梁 艷，雷春妮，王 波，張 歡，王新潮，周小平，*，朱夢晨

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.蘭州海關(guān)技術(shù)中心，甘肅 蘭州 730010；3.西北師范大學(xué) 地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

橄欖油由新鮮油橄欖果實(shí)冷榨而成，富有油酸及亞油酸等多種有益于人體的天然營養(yǎng)成分，被譽(yù)為“液體黃金”和“植物油皇后”。近年來橄欖油逐漸進(jìn)入我國消費(fèi)市場并呈現(xiàn)高速發(fā)展趨勢，國際橄欖理事會預(yù)言我國將成為未來世界第一大橄欖油消費(fèi)國［1］。由于橄欖在種植和生長過程中施用農(nóng)藥來達(dá)到預(yù)防蟲害的目的，且部分農(nóng)藥不易降解，致使橄欖油中可能存在農(nóng)藥殘留，其潛在風(fēng)險(xiǎn)不容忽視［2］。開展農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測是保障橄欖油質(zhì)量安全的重要措施，因此建立一種快速、高效、高通量篩查橄欖油中多種農(nóng)藥殘留的檢測方法十分必要。目前關(guān)于橄欖油中農(nóng)藥殘留檢測方法已有報(bào)道，如劉綱勇等［3］測定橄欖油中22 種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留，Iosif 等［4］測定橄欖油中39 種農(nóng)藥殘留。但相關(guān)研究主要集中于1種或1類多農(nóng)藥殘留的檢測，針對數(shù)百種不同極性、不同化學(xué)性質(zhì)的多種農(nóng)藥殘留的檢測報(bào)道較少。

關(guān)于橄欖油或含油量較高的植物油樣品中農(nóng)藥殘留的前處理方法主要有固相萃取法（SPE）［5］、凝膠滲透色譜法（GPC）［6］、QuEChERS 法［7］等。分散液液微萃取法（DLLME）是2006年［8］被首次提出的一種集采樣、萃取和濃縮于一體的樣品前處理技術(shù)，通過形成水相、分散劑、萃取劑三元渾濁體系，增大目標(biāo)物與萃取劑的接觸面積，經(jīng)離心后將目標(biāo)物轉(zhuǎn)移到萃取劑中，從而實(shí)現(xiàn)樣品成分的富集［9］。該方法具有富集倍數(shù)較高，操作簡單、快速，耗材成本低廉，對環(huán)境綠色環(huán)保等優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用于多種無機(jī)和有機(jī)化合物的提取分析。目前DLLME 技術(shù)主要應(yīng)用于水樣等基質(zhì)簡單的液體樣品以及1 種或1類農(nóng)藥殘留的檢測，如韓文濤等［10］利用現(xiàn)場DLLME 法檢測水體中5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，李芳芳等［11］利用DLLME 法測定植物油中11 種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留。然而運(yùn)用DLLME 法檢測橄欖油復(fù)雜基質(zhì)中數(shù)百種農(nóng)藥殘留的分析鮮見報(bào)道。

在檢測技術(shù)方面，農(nóng)藥殘留分析的常用技術(shù)有氣相色譜法（GC）［12］、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）［13］、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）［14］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）［15］等。氣相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜法（GC-QTOF MS）既具有高分離能力，又具有高質(zhì)量分辨率、高掃描速率等優(yōu)勢，并且其實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可進(jìn)行重復(fù)分析，極大提高了工作效率，在非靶向未知物篩查及高通量篩查方面的研究較為成熟，適合橄欖油中農(nóng)藥殘留的高通量檢測。

本研究基于綠色環(huán)保理念，將DLLME與GC-QTOF MS法相結(jié)合，建立了一種準(zhǔn)確、快速、便捷且綠色環(huán)保的橄欖油中180 種農(nóng)藥殘留的檢測技術(shù)，以期為橄欖油中農(nóng)藥殘留的快速監(jiān)測分析提供技術(shù)支持，為復(fù)雜基質(zhì)的前處理提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

GC-QTOF MS 7890B-7200氣相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）；BC-1000多管旋渦混合儀（深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司）；3K30 臺式高速冷凍離心機(jī)（美國Sigma 公司）；20～200 μL、100～1 000 μL、1.0～5.0 mL、5.0～10.0 mL 移液槍（德國Eppendorf 公司）；BSA822 電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）。

100 μg/mL 180種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（以乙酸乙酯為溶劑，天津阿爾塔科技有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水（蒸餾水，屈臣氏）；乙腈（分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；甲酸（分析純，天津市百世化工有限公司）；乙醚（分析純，利安隆博華（天津）醫(yī)藥化學(xué)有限公司）；三氯甲烷、甲苯、環(huán)己烷（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；四氯化碳（分析純，天津市登豐化學(xué)品有限公司）。

橄欖油樣品為市售的特級初榨橄欖油。

1.2 樣品前處理

稱取1.0 g 橄欖油試樣于15 mL 離心管，加入2 mL 含2%甲酸的乙腈溶液提取，渦旋3 min，并在-5 ℃下以5 000 r/min 冷凍離心3 min。取1 mL 上清液于15 mL 離心管中，加入200 μL 三氯甲烷，再加入9 mL 水，渦旋3 min，并在-5 ℃下以5 000 r/min 冷凍離心3 min。取離心管底部液滴至含有襯管的進(jìn)樣瓶中，待測定。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將質(zhì)量濃度為100 μg/mL的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品用乙酸乙酯配制成質(zhì)量濃度為5 μg/mL的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。該溶液用經(jīng)“1.2”處理的空白橄欖油基質(zhì)提取液逐級稀釋，配制成系列質(zhì)量濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 儀器分析

1.4.1 色譜條件色譜柱：HP-5MS UI 柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；進(jìn)樣模式：不分流進(jìn)樣；載氣：氦氣，純度≥99.999%；載氣流速：1 mL/min；升溫程序：初始溫度50 ℃，保持2 min，以40 ℃/min 升溫至120 ℃，以3 ℃/min 升溫至255 ℃，再以10 ℃/min 升溫至300 ℃，保持6 min；進(jìn)樣量：1 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件離子化模式：電子轟擊（EI）源；電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；監(jiān)測模式：全掃描模式；掃描范圍：m/z35～500；掃描速率：5 spectra/s；四極桿溫度：150 ℃；碰撞氣：高純氮?dú)猓?9.999%）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采集通過Agilent Mass Hunter Acquisition 7200 軟件完成，數(shù)據(jù)處理通過Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis B.07.00軟件完成，數(shù)據(jù)分析通過Agilent Mass Hunter TOF 定量分析軟件分析。每種農(nóng)藥選擇響應(yīng)較好且無明顯干擾的離子用于定量及定性分析，并參照GB 23200.8-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 水果和蔬菜中500種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜法》［16］選擇1個(gè)定量離子及2個(gè)定性離子（見表1）。

表1 橄欖油中180種農(nóng)藥的保留時(shí)間、定量離子、定性離子、線性范圍、檢出限、定量下限、加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 1 Retention times，quantitative ions，qualitative ions，linear ranges，LODs，LOQs，spiked recoveries and RSDs of the 180 pesticides in olive oils（n=6）

（續(xù)表1）

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 乙腈酸化濃度的優(yōu)化橄欖油的主要成分為油脂，會給后續(xù)分析帶來強(qiáng)烈干擾。乙腈中可溶入的油脂量極少，且對絕大多數(shù)農(nóng)藥的溶解度較大，因此本實(shí)驗(yàn)中乙腈既是提取溶劑，又是 DLLME分散劑。由于部分農(nóng)藥可能對酸堿度較為敏感，考察了含0、0.5%、1%、2%、5%、10%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸的乙腈溶液對180 種農(nóng)藥的提取效果。如圖1 所示，回收率在70%～120%范圍的農(nóng)藥數(shù)量隨甲酸體積分?jǐn)?shù)的增大先增多后減少，說明乙腈酸化程度對農(nóng)藥回收率有著較大影響。采用含2%甲酸的乙腈溶液提取時(shí)，回收率在70%～120%范圍的農(nóng)藥數(shù)量最多，占全部被測農(nóng)藥的76.67%，因此選擇使用含2%甲酸的乙腈溶液進(jìn)行提取。

圖1 不同乙腈酸化濃度提取時(shí)180種農(nóng)藥的回收率（Rec.）分布（n=3）Fig.1 Recovery（Rec.） distributions of the 180 pesticides extracted by different acetonitrile acidification concentrations（n=3）

2.1.2 水相體積的優(yōu)化DLLME 體系中分散劑、萃取劑和水相的體積將影響農(nóng)藥的萃取效率，增加水相體積會影響方法靈敏度以及基質(zhì)效應(yīng)，導(dǎo)致樣品經(jīng)前處理后離心管底部液滴的體積有一定變化，從而影響后續(xù)檢測［17］。考察了不同水相體積（6、7、8、9、10 mL）對180 種農(nóng)藥的提取效果，結(jié)果見圖2。隨著水相體積的增加，回收率在70%～120%范圍的農(nóng)藥數(shù)量呈明顯變化，說明在快速富集過程中農(nóng)藥的提取效率與水相體積有關(guān)；當(dāng)加水量為6、7、8 mL 時(shí)提取效率較低，可能與提取不充分有關(guān)，而加入9 mL 水時(shí)農(nóng)藥的回收率最高，有利于后續(xù)測定。因此最終選擇水相體積為9 mL。

圖2 不同水相體積時(shí)180種農(nóng)藥的回收率分布（n=3）Fig.2 Recovery distributions of the 180 pesticides in different water phase volumes（n=3）

2.1.3 萃取劑種類的優(yōu)化在DLLME 中，合適的萃取劑能夠提高目標(biāo)化合物的萃取效率。萃取劑需滿足以下要求：不易溶于水；易溶于分散劑；目標(biāo)化合物易溶于萃取劑；萃取劑的密度大于油類基質(zhì)與分散劑的混合溶液［18］?？疾炝溯腿┓謩e為三氯甲烷、四氯化碳、甲苯、乙醚、環(huán)己烷時(shí)的提取效果。結(jié)果表明：加入甲苯時(shí)，油類基質(zhì)與分散劑的混合溶液密度大于萃取劑，沉淀物在上層；加入乙醚時(shí)，分散劑、萃取劑和水三相互溶；加入環(huán)己烷時(shí)，形成白色乳濁液；加入四氯化碳時(shí)，180 種農(nóng)藥中有73.33%的農(nóng)藥回收率在70%～120%范圍內(nèi)；而加入三氯甲烷時(shí)，該占比提高至76.67%（見圖3）。因此選擇三氯甲烷作為萃取劑。

圖3 不同萃取劑種類時(shí)180種農(nóng)藥的回收率分布（n=3）Fig.3 Recovery distributions of the 180 pesticides in different extraction types（n=3）

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（ME）是指樣品基質(zhì)中除分析物以外的其他成分所引起的檢測信號增強(qiáng)或減弱現(xiàn)象［19］。一般通過比較目標(biāo)物在空白基質(zhì)提取液和純?nèi)軇┲械捻憫?yīng)進(jìn)行評估：ME=農(nóng)藥在基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)/農(nóng)藥在溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)。當(dāng)ME 低于0.8 時(shí)為基質(zhì)抑制效應(yīng)；ME 在0.8～1.2 之間時(shí)為弱基質(zhì)效應(yīng)；ME大于1.2時(shí)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。對180種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，2%的農(nóng)藥表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)，58%的農(nóng)藥表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng)，40%的農(nóng)藥表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。因此采用空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量。180種農(nóng)藥的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液提取離子色譜圖見圖4。

圖4 180種農(nóng)藥的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液提取離子色譜圖Fig.4 Extract ion chromatogram of the 180 pestcides in matrix standard solution

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性范圍、檢出限與定量下限采用本方法對“1.3”配制的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，以目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/mL），峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表1 可知，87.8%農(nóng)藥的線性范圍為0.02～2 μg/mL，12.2%農(nóng)藥的線性范圍為0.1～2 μg/mL，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.99，表明180種農(nóng)藥在各自線性范圍內(nèi)關(guān)系良好，滿足檢測要求。以3倍信噪比（S/N=3）為檢出限、10倍信噪比（S/N=10）為定量下限，得到180 種農(nóng)藥的檢出限為0.002～0.020 mg/kg，定量下限為0.007～0.067 mg/kg。其中有135 種農(nóng)藥的定量下限達(dá)到0.007 mg/kg，23 種農(nóng)藥的定量下限達(dá)到0.017 mg/kg，占總數(shù)量的88%；5%農(nóng)藥的定量下限為0.033 mg/kg；7%農(nóng)藥的定量下限為0.067 mg/kg。

2.3.2 準(zhǔn)確度及精密度在空白橄欖油試樣中，分別進(jìn)行0.02、0.1、0.2 mg/kg 3個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平做6 個(gè)平行，考察180 種農(nóng)藥的準(zhǔn)確度與精密度。結(jié)果表明：在上述3 個(gè)加標(biāo)水平下，回收率為70%～120%的農(nóng)藥占全部被測農(nóng)藥的76.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于10%的農(nóng)藥占總數(shù)的94.4%以上（見表1）。該方法的準(zhǔn)確度與精密度良好，可滿足多農(nóng)藥殘留分析的要求。

2.4 實(shí)際樣品檢測

實(shí)驗(yàn)對10份市售橄欖油試樣進(jìn)行檢測，共檢出5種農(nóng)藥，檢出量為0.005 7～0.042 7 mg/kg。其中4份橄欖油試樣中均檢出敵敵畏，含量為0.011 1～0.012 4 mg/kg；1份橄欖油試樣中檢出敵敵畏、克百威和三唑醇3 種農(nóng)藥（見表2）。與我國現(xiàn)行GB 2763-2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》［20］相比，敵敵畏、克百威、三唑醇、殺蟲畏的殘留量未超過其最大殘留限量值，禾草丹暫未規(guī)定最大殘留限量值。

表2 市售橄欖油中農(nóng)藥殘留的檢出情況Table 2 Detection of pesticide residues in olive oils on the market

3 結(jié) 論

本研究基于綠色環(huán)保理念，將分散液液微萃取與氣相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜法相結(jié)合建立了一種快速測定橄欖油中多農(nóng)藥殘留的分析方法，并考察了乙腈酸化濃度、水相體積、萃取劑種類對180 種農(nóng)藥殘留測定的影響。該方法操作簡單、快速，靈敏度高，成本低，綠色環(huán)保，準(zhǔn)確度及精密度良好，滿足橄欖油中農(nóng)藥殘留高通量檢測的要求，為市場監(jiān)管部門對食用油中農(nóng)藥殘留的快速監(jiān)測提供了技術(shù)支持，為復(fù)雜基質(zhì)的前處理提供了參考。