何德鑫，趙 翔，張雪靜，李佳宜，張鵬宇，姚興東，謝甫綈

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所，沈陽 110161；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)技術(shù)推廣中心，呼和浩特 010051）

大豆作為一種重要的油料作物，對全世界糧食安全都具有舉足輕重的影響[1-2]。近年來受耕地面積縮減、種植結(jié)構(gòu)調(diào)整、過度依賴進口等多方面影響，在有些地區(qū)大豆連作已經(jīng)成為一種普遍的種植模式[3-4]。大豆忌連作，連作會導(dǎo)致大豆土壤理化性質(zhì)失調(diào)、土壤微生物群落發(fā)生異常改變、加劇土傳病害蔓延，繼而導(dǎo)致大豆產(chǎn)量和品質(zhì)下降[5]。

土壤微生物群落對陸地生態(tài)系統(tǒng)循環(huán)至關(guān)重要，如土壤碳循環(huán)、氮循環(huán)等[6]。近年來研究表明，土壤微生物群落組成及多樣性的變化可引起土壤理化性質(zhì)和土壤酶活性的變化[7-8]。季尚寧等[9]對連作大豆土壤進行殺菌消毒后種植，結(jié)果表明殺菌消毒能從根本上消除大豆連作對土壤造成的不利影響，從而保證大豆良好的生長發(fā)育和增產(chǎn)效果。這表明土壤微生物群落的改變是導(dǎo)致大豆連作障礙的主要因素之一[4]。大豆連作會使土壤中致病細(xì)菌和病原真菌的富集豐度增加，土壤理化性質(zhì)發(fā)生異常變化，土壤微生物多樣性減少繼而引起大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)的下降[10]。

群落構(gòu)建過程對于微生物生態(tài)學(xué)研究起著至關(guān)重要的作用，對于解釋微生物組成及多樣性形成過程有著重要的指導(dǎo)作用[11]。微生物群落構(gòu)建過程分為確定性和隨機性兩個過程，二者主要在研究尺度、群落類型等方面存在差異[12]。目前主要是通過βNTI（β-Nearest Taxon Index,最近種間指數(shù)）模型來構(gòu)建土壤微生物群落，并通過βNTI模式的構(gòu)建發(fā)現(xiàn)確定性過程對土壤生態(tài)環(huán)境起主導(dǎo)作用[13]。郭晗玥等[14]對西瓜連作土壤群落構(gòu)建過程的研究表明，西瓜連作細(xì)菌群落構(gòu)建過程以隨機性為主導(dǎo)，真菌構(gòu)建過程由確定性過程主導(dǎo)。然而，對于連作大豆根際土壤生態(tài)環(huán)境中土壤微生物群落的構(gòu)建過程機制，至今仍缺乏深入細(xì)致的探究。

本研究選擇連作大豆根際土壤微生物群落為對象，采用16S rRNA 測序、ITS 測序和βNTI 模型構(gòu)建，分析了連作大豆、玉米-大豆輪作根際土壤微生物群落組成、多樣性和群落構(gòu)建過程的差異，試圖闡釋連作大豆土壤微生物組裝機制，為緩解大豆連作障礙研究提供新的見解。

1 材料與方法

1.1 試驗地點和取樣

2015年在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)遼中定位試驗基地（41°52’N，122°72’W，海拔5.5~23.5 m）建立定位試驗，采用大豆連作和玉米-大豆輪作的種植制度進行種植。本試驗于2021-2022年進行取樣測定。采用大豆連作（LCR）和玉米-大豆輪作（LRR）兩種處理方法，玉米-大豆輪作為對照處理，玉米：東單6531，大豆：遼豆14。小區(qū)行數(shù)6 行，壟長15 m，壟距0.6 m，小區(qū)面積54 m2，密度15 萬株·hm-2，3 個重復(fù)，每穴保苗2株，常規(guī)田間管理。

在大豆鼓粒期（R6），按照5點法取樣，即從每個處理中隨機選擇5個取樣點，用無菌刷子將大豆根系表面5 mm以內(nèi)的土壤輕輕取下，作為根際土壤，混合充分，在-80 ℃保存，用于土壤微生物的測序。

每個小區(qū)按照5點法取5個點（直徑5 cm×深度20 cm），然后充分混合成1個復(fù)合樣品，并用2 mm 的篩子篩分土壤樣品以除去葉子和根等作物殘茬，然后每個樣分成兩部分：1 份保存在-80 ℃用于土壤酶活性的測定，1份自然條件下風(fēng)干用于土壤化學(xué)指標(biāo)分析。

1.2 土壤化學(xué)指標(biāo)測定

使用pH 計測定土壤pH 值;土壤含水量和容重的測定分別使用鋁盒烘干法和環(huán)刀法;總碳、總氮使用元素分析儀測定;銨態(tài)氮(NH4+-N)和硝態(tài)氮(NO3--N)使用間斷化學(xué)分析儀測定。

1.3 土壤細(xì)菌16S和真菌ITS高通量測序

將待測樣品送到武漢邁特維爾生物科技有限公司，提取土壤總DNA 和后續(xù)分析。采用CATB 方法進行土壤樣品DNA 提?。籇NA 提取完成后，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA 濃度以及純度。用無菌水將所取的樣品稀釋到1 ng·μL-1；稀釋后得到DNA 模板，進行PCR 擴增；選用瓊脂糖凝膠對擴增后的引物進行電泳檢測；對16S r RNA 的V4 區(qū)進行PCR 擴增，使用特異性引物515F（GTGCCAGCMGCCGCGGTAA）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）[15]；ITS1 區(qū)引物ITS5-1737F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS2-2043R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)[16]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Qiime軟件（Version 1.9.1）計算Observed-otus、Chao1、Shannon、Simpson、ace指數(shù)；群落構(gòu)建過程使用最近種間親緣關(guān)系指數(shù)(βNTI)進行評估。當(dāng)|βNTI|>2 時為確定性過程，確定性過程又分為同質(zhì)選擇過程(βNTI<-2)和異質(zhì)選擇過程(βNTI>+2);而0<|βNTI|<2 時為隨機過程，隨機過程又分為擴散限制(|βNTI|<2)、均勻擴散(|βNTI|<2)和不確定性過程(|βNTI|<2)；基于物種豐度，計算各菌屬之間的相關(guān)系數(shù)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤環(huán)境因子對大豆連作的響應(yīng)

由表1 可知，兩種種植模式下土壤的化學(xué)性質(zhì)呈現(xiàn)不同變化。與玉米-大豆輪作相比，大豆連作土壤全氮、全磷、全鉀、全碳、有效磷、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、有機質(zhì)和速效磷含量均不同程度下降，其中土壤全氮、全磷、硝態(tài)氮含量下降較大，下降幅度分別為40.35%、56.45%、33.13%。玉米-大豆輪作降低了土壤速效鉀含量和pH值。

表1 大豆輪作和連作處理對土壤理化性質(zhì)參數(shù)的影響Table 1 Effects of soybean rotation and continuous cropping on soil physicochemical properties parameters

2.2 土壤酶活性對大豆連作的響應(yīng)

由表2可知，對比玉米-大豆輪作處理，連作顯著提高土壤蔗糖酶和過氧化氫酶活性，提高幅度分別為30.15%和54.30%；顯著降低土壤脲酶、亮氨酸氨肽酶活性和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性，下降幅度分別為12.32%、13.60%和20.28。兩處理間土壤蔗糖酶、過氧化氫酶、亮氨酸氨肽酶活性及N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性差異顯著。

表2 大豆輪作和連作處理對土壤酶活性參數(shù)的影響Table 2 Effects of soybean rotation and continuous cropping on soil enzyme activity parameters

2.3 根際土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)對大豆連作的響應(yīng)

由圖1a可知，在屬水平下（相對豐度>0.01%），玉米-大豆輪作和大豆連作及根際土壤細(xì)菌群落的優(yōu)勢屬均為鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas，LRR：6%；LCR：9%）、短根瘤菌屬（Bradyrhizobium，LRR：3.9%；LCR：4.1%）、貪噬菌屬（Variovorax，LRR：0.7%；LCR：2%）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium，LRR：0.15%；LCR：1.5%）、噬幾丁質(zhì)菌屬（Chitinophaga，LRR：1.9%；LCR：0.9%）、卡氏伯克霍爾德菌屬（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia，LRR：1.4%；LCR：2.4%）、念珠菌屬（Candidatus_Solibacter，LRR：2.5%；LCR：1.9%）、氨氧化菌屬（Ellin6067，LRR：2.2%；LCR：2%）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas，LRR：2.1%；LCR：1.7%）、苔蘚桿菌（Bryobacter，LRR：1.7%；LCR：1.5%）。相比于玉米-大豆輪作處理，大豆連作根際土壤鞘氨醇單胞菌屬、短根瘤菌屬、貪噬菌屬、鞘氨醇桿菌屬、卡氏伯克霍爾德菌屬相對豐度較高。

由圖1b可知，在屬水平下（相對豐度>0.01%），玉米-大豆輪作和大豆連作根際土壤真菌的優(yōu)勢屬均為散尾鬼筆屬（Lysurus，LCR：29.5%；LRR：19.3%）、球蓋菇屬Stropharia，LCR：1.3%；LRR：15.9%）、鐮刀菌屬（Fusarium，LCR：20.5%；LRR：13.2%）、麗赤殼屬（Calonectria，LCR：8.9%；LRR：0.2%）、擬松針藻屬（Codinaeopsis，LCR：1.6%；LRR：4.2%）、亞隔孢殼屬（Didymella，LCR：4.7%；LRR：1.3%）、球菌屬（Powellomyces，LCR：1.3%；LRR：0.1%）、被孢霉屬（Mortierella，LCR：2.4%；LRR：1.6%）、線蟲捕捉菌屬（Arthrobotrys，LCR：0.05%；LRR：1.2%）、鵝膏菌（Amanita，LCR：0.05%；LRR：0.8%）相比于玉米大豆輪作處理，大豆連作根際土壤鐮刀菌屬(Fusarium)、麗赤殼屬(Calonectria)、亞隔孢殼屬(Didymella)、被孢霉屬(Mortierella)相對豐度較高。

圖1 玉米-大豆輪作和大豆連作根際土壤微生物群落的優(yōu)勢屬柱狀圖Figure 1 Dominant genus bar chart of rhizosphere soil microbial communities in maize soybean rotation and continuous soybean cropping

2.4 大豆連作根際土壤微生物群落特征

由表3 和表4 可知，對比輪作根際，連作根際土壤細(xì)菌富集OTU 數(shù)量顯著降低，下降幅度為8.21%，連作根際土壤細(xì)菌香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)、chao1 指數(shù)和ace 指數(shù)均不同程度下降，下降幅度分別為15.33%、10.98%、6.28%和5.92。同樣地，對比輪作根際，連作根際土壤真菌OTU數(shù)量、香農(nóng)指數(shù)、chao1指數(shù)和ace指數(shù)均不同程度下降，但下降幅度較小。

表3 輪作和連作處理對大豆土壤細(xì)菌α多樣性的影響Table 3 Rotation and continuous cropping treatments on soybean soil bacteriaα impact of diversity

表4 輪作和連作處理對大豆土壤真菌α多樣性的影響Table 4 Effects of rotation and continuous cropping on fungi in soybean soil α impact of diversity

2.5 連作下土壤環(huán)境因子與土壤微生物的關(guān)系

冗余分析（RDA）表明，土壤環(huán)境因子與土壤微生物相對豐度具有較大的相關(guān)性（圖4）。兩處理處理下10個細(xì)菌屬和真菌屬表現(xiàn)出差異。細(xì)菌RDA 分布結(jié)構(gòu)中，RDA 前兩軸分別解釋38.1%（RDA1）、23.5%（RDA2）。其中速效鉀、速效磷、有機質(zhì)、有機碳、全鉀、蔗糖酶、過氧化氫酶、脲酶、亮氨酸氨肽酶及N-乙酰氨基葡萄糖苷酶是決定羅河桿菌屬（Rhodanobacter）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、多嗜菌（Variovorax）、伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）、鞘脂桿菌屬（Sphingobacterium）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）和鞘氨醇菌屬（Chitinophaga）相對豐度的主要土壤酶。其中，LRR 處理下，脲酶、亮氨酸氨肽酶、N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、速效磷、有機質(zhì)、有機碳、全鉀與羅河桿菌屬（Rhodanobacter）及芽單胞菌屬（Gemmatimonas）表現(xiàn)出強烈相關(guān)性；LCR 處理下，速效鉀、蔗糖酶、過氧化氫酶及慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）具有較強的正相關(guān)性（圖3a、圖3c）。真菌RDA 分布結(jié)構(gòu)中，RDA 前兩軸分別解釋49.3%（RDA1）和28.8%（RDA2）。其中，速效鉀、速效磷、有機質(zhì)、有機碳、全鉀、蔗糖酶、過氧化氫酶、脲酶、亮氨酸氨肽酶及N-乙酰氨基葡萄糖苷酶是決定散尾鬼筆屬（Lysurus）、鐮刀菌屬（Fusarium）、球蓋菇屬（Stropharia）、被孢霉屬（Mortierella）、麗赤殼屬（Calonectria）、巨孢囊霉屬（Gigaspora）、克魯維酵母屬（Kluyveromyces）、亞隔孢殼屬（Didymella）、絲葚霉屬（Papulaspora）和毛霉菌屬（Mucoromycotina）相對豐度的主要土壤因子。LRR處理下，脲酶、亮氨酸氨肽酶、N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、速效磷、有機質(zhì)、有機碳、全鉀與球蓋菇屬（Stropharia）、絲葚霉屬（Papulaspora）及毛霉菌屬（Mucoromycotina）表現(xiàn)出強烈相關(guān)性；LCR 處理下，速效鉀、蔗糖酶、過氧化氫酶與鐮刀菌屬（Fusarium）、亞隔孢殼屬（Didymella）、麗赤殼屬（Calonectria）及被孢霉屬（Mortierella）具有較強的正相關(guān)性（圖3b、圖3d）。

圖3 輪作和連作處理根際環(huán)境因子與土壤微生物屬水平的RDA分析Figure 3 RDA analysis of rhizosphere environmental factors and soil microbial genus levels in crop rotation and continuous cropping treatments

2.6 土壤微生物群落構(gòu)建過程

由圖4 可知，大豆連作根際土壤細(xì)菌群落構(gòu)建主要由確定性過程( βNTI>2) 和隨機過程（0< |βNTI|<2）主導(dǎo)，分別占比20%和13%；玉米-大豆輪作根際土壤細(xì)菌群落構(gòu)建主要由隨機過程（0< |βNTI|<2）主導(dǎo)，其占比大于50%(圖4a)；大豆連作根際土壤真菌群落構(gòu)建、玉米-大豆輪作根際土壤真菌群落構(gòu)建由隨機過程（0<|βNTI|<2）即擴散限制過程主導(dǎo)(圖4b)。由此可見，大豆連作和玉米-大豆輪作根際土壤微生物群落的構(gòu)建具有一定的差異。

圖4 輪作和連作處理根際土壤微生物群落構(gòu)建圖Figure 4 Construction diagram of rhizosphere soil microbial community under rotation and continuous cropping treatments

3 討論與結(jié)論

3.1 大豆連作、玉米-大豆輪作對根際土壤化學(xué)性質(zhì)和酶活性的影響

大豆連作可造成土壤理化性質(zhì)失衡[17]。玉米-大豆輪作可顯著提高大豆根際土壤養(yǎng)分含量[10]。本試驗研究結(jié)果顯示，玉米-大豆輪作處理下，土壤全氮、溶解性有機碳、有機質(zhì)等含量均高于連作處理。土壤酶活性隨著土壤內(nèi)部環(huán)境的變化而變化，如土壤過氧化氫酶與土壤逆境相關(guān)聯(lián)。土壤脲酶活性變化可引起土壤養(yǎng)分的變化。亮氨酸氨肽酶是一種土壤氮獲取酶，其活性變化與微生物氮利用效率呈正相關(guān)[18-20]。本研究結(jié)果表明，連作會提高土壤蔗糖酶和過氧化氫酶活性，降低土壤脲酶、亮氨酸氨肽酶活性和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性，該結(jié)果與LIU等[18]研究結(jié)果一致。

3.2 大豆連作、玉米-大豆輪作對根際土壤微生物群落的影響

不同種植模式下，土壤微生物群落的組成、數(shù)量和多樣性變化不盡相同。RAO 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，與大豆連作相比，玉米-大豆輪作提高了大豆根際土壤微生物的數(shù)量和多樣性指數(shù)。本研究中，相比于大豆連作，玉米-大豆輪作會提高大豆根際土壤細(xì)菌、真菌OTUs數(shù)量、ace指數(shù)和shannon指數(shù)。

相關(guān)研究表明，作物連作可造成其根際土壤微生物群落組成的變化[10]。本研究中，大豆連作土壤中鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）和伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）相對豐度高于輪作處理，而輪作土壤中鞘氨醇菌屬（Chitinophaga）相對豐度高于連作處理。鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）和伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）是一種生防細(xì)菌，其耐受惡劣土壤生態(tài)環(huán)境[21-22]。本研究中，連作處理鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）和伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）相對豐度升高，有可能是連作障礙激發(fā)了大豆根際鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）和伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）生物防御效應(yīng)以應(yīng)對大豆連作障礙造成的。小麥連作障礙的研究表明，噬幾丁質(zhì)菌屬（Chitinophaga）具有抑制或拮抗功能，可抑制病原菌在土壤中繁殖，其相對豐度的增加可進一步抑制土傳病害的發(fā)生，進而促進植株健康生長[23]。在真菌群落中，有研究表明，球蓋菇屬（Stropharia）為有益真菌，球蓋菇屬（Stropharia）真菌相對豐度升高，可有效改善表層土壤理化性質(zhì)，提升土壤有機質(zhì)含量，減少土壤病蟲害[24]。鐮刀菌屬（Fusarium）真菌為連作土壤典型病原菌，其相對豐度的升高導(dǎo)致黨參、西瓜枯萎病的發(fā)生[25-26]。本研究中，與輪作處理相比，連作處理鐮刀菌屬（Fusarium）相對豐度顯著增加，球蓋菇屬（Stropharia）真菌相對豐度顯著降低。因此，連作改變土壤微生物群落組成，增加病原菌相對豐度，從而引起連作障礙的發(fā)生。

3.3 大豆連作、玉米-大豆輪作土壤因子與土壤微生物的關(guān)系

前人研究表明，土壤環(huán)境因子與土壤微生物相對豐度具有密切聯(lián)系[27]。本研究中，輪作處理下，脲酶、亮氨酸氨肽酶、N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、速效磷、有機質(zhì)、有機碳及全鉀顯著影響羅河桿菌屬（Rhodanobacter）和芽單胞菌屬（Gemmatimonas）細(xì)菌；球蓋菇屬（Stropharia）、絲葚霉屬（Papulaspora）和毛霉菌屬（Mucoromycotina）真菌相對豐度；連作處理下，速效鉀、蔗糖酶、過氧化氫酶顯著影響細(xì)菌慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、真菌鐮刀菌（Fusarium）、亞隔孢殼屬（Didymella）及麗赤殼屬（Calonectria）、被孢霉屬（Mortierella）相對豐度。鐮刀菌（Fusarium）與土壤蔗糖酶具有顯著正相關(guān)性，蔗糖酶進一步分解可為鐮刀菌提供有利碳源[28]。本研究中，輪作處理蔗糖酶含量高于連作處理，輪作處理鐮刀菌（Fusarium）相對豐度低于連作處理，這也說明，大豆連作條件下，土壤消耗了過量的蔗糖酶等土壤因子從而提升了鐮刀菌（Fusarium）等致病真菌的相對豐度。

3.4 大豆連作、玉米-大豆輪作對根際土壤微生物群落組裝過程的影響

為了更好地闡釋土壤根際微生物群落構(gòu)建對大豆連作的響應(yīng)，研究了連作大豆、玉米-大豆輪作土壤根際細(xì)菌、真菌群落構(gòu)建過程。本研究中，由于土壤化學(xué)性質(zhì)（pH、土壤全氮、全碳）和土壤酶活性等變化，使得大豆連作根際土壤細(xì)菌群落構(gòu)建主要由隨機性過程轉(zhuǎn)為確定性過程；玉米-大豆輪作根際土壤細(xì)菌群落構(gòu)建主要由隨機過程主導(dǎo)；大豆連作根際土壤真菌群落構(gòu)建由隨機過程主導(dǎo)[29]。有研究指出，西瓜連作時，pH 值和有機質(zhì)含量等環(huán)境因素的選擇會將細(xì)菌群落構(gòu)建過程由隨機性轉(zhuǎn)換為確定性過程，而在連作年限增加后，細(xì)菌群落構(gòu)建更容易受到隨機性事件影響[14]。真菌群落構(gòu)建過程中，隨機性過程更為突出，這是由于一些土壤環(huán)境因子如根系分泌物、土壤理化指標(biāo)、土壤酶等變化所造成的結(jié)果[30]。

連作會顯著影響大豆根際土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致土壤有益菌（噬幾丁質(zhì)菌屬Chitinophaga、球蓋菇屬Stropharia）相對豐度下降，病原菌（鐮刀菌Fusarium、伯克霍爾德菌屬Burkholderia）相對豐度升高，進而改變土壤微生物群落的組成和多樣性，降低根際土壤應(yīng)對環(huán)境變化的抵抗作用。玉米-大豆輪作模式下，土壤真菌相對豐度顯著下降，根際土壤細(xì)菌群落組裝也趨向于隨機性過程。本研究結(jié)果表明，玉米-大豆輪作模式通過改變大豆根際土壤群落特征和提高土壤有益菌相對豐度等方式，緩解大豆連作障礙，進而促進大豆土壤環(huán)境健康，提升大豆產(chǎn)量。