吳偉欣,鄭珍萍,顧富城,楊美鑫,王和鳴,李 楠,3

(1. 福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,福建 福州 350122;2. 福建中醫(yī)藥大學(xué),福建 福州 350122;3. 中醫(yī)骨傷及運(yùn)動(dòng)康復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州 350122)

膝骨關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)樘卣鞯穆酝诵行怨顷P(guān)節(jié)疾病,其發(fā)生后,軟骨細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)環(huán)境受到破壞,繼而發(fā)生軟骨細(xì)胞凋亡、軟骨下骨硬化,而軟骨退變又與軟骨細(xì)胞凋亡程度及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)分解合成密切相關(guān),因此,如何減少軟骨細(xì)胞凋亡及調(diào)節(jié)ECM分解合成平衡成為治療膝骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵[1-4]。王和鳴教授從“腎主骨生髓”理論出發(fā),在臨床上運(yùn)用龜鹿二仙膠填精補(bǔ)髓治療膝骨關(guān)節(jié)炎取得良好療效[5]。課題組前期研究證實(shí),龜鹿二仙膠及拆方均能有效抑制軟骨細(xì)胞凋亡,對(duì)軟骨ECM也有一定調(diào)控作用[6-7]。但龜板膠和鹿角膠對(duì)ECM分解合成平衡的影響還有待進(jìn)一步觀(guān)察。此外有研究表明半胱氨酸蛋白酶3/多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(Caspase-3/PARP)信號(hào)通路參與細(xì)胞凋亡[8],但目前國(guó)內(nèi)外研究尚未見(jiàn)中藥治療膝骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制是否與該信號(hào)通路有關(guān)。因此本研究基于該信號(hào)通路,探究了龜鹿二仙膠及拆方對(duì)白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)誘導(dǎo)的退變軟骨細(xì)胞凋亡及ECM的作用及可能保護(hù)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1動(dòng)物 2月齡清潔級(jí)SD大鼠40只,體重(200±20)g,雌雄各半,委托福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心代購(gòu)和飼養(yǎng)(動(dòng)物使用許可證號(hào):[SYXK(閩)2019-0007]),用于含藥血清的制備;4周齡清潔級(jí)C57BL/6小鼠60只,體重(90±10)g,雌雄不限,用于原代野生型軟骨細(xì)胞提取。動(dòng)物均由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(滬)2017-0005。

1.2藥物 龜鹿二仙膠由龜板膠9 g、鹿角膠6 g、人參6 g、枸杞9 g構(gòu)成,各味藥物批號(hào)分別為1175,951,448,203,均購(gòu)自閩侯縣上街致誠(chéng)醫(yī)藥商店。

1.3主要設(shè)備 ChemiDocXRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司),9600 PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)PE公司),ABI7500 7500 Real-Time PCR儀(美國(guó)ABI公司),E163302 CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific公司),熒光顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司),DG5033A酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(上海繼錦化學(xué)科技有限公司)。

1.4主要試劑 IL-1beta protein[亞科因(武漢)生物技術(shù)有限公司,批號(hào):prp1119-5μg];CCK-8試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司,批號(hào):fc101-03);基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)Rabbit PolyClonal antibody[美國(guó)proteintech(PTG)公司,批號(hào):18165 -1-AP];Mouse anti GAPDH Monoclonal antibody[美國(guó)proteintech(PTG)公司,批號(hào):60004-1-Ig];PARP-1 Mouse Monoclonal Antibody[美國(guó)proteintech(PTG)公司,批號(hào):66520-1-Ig];Anti-聚集蛋白聚糖(Aggrecan) antibody(美國(guó)abcam公司,批號(hào):ab36861);Anti-Caspase-3 antibody(美國(guó)abcam公司,批號(hào):ab13847);HiScript II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(美國(guó)lablead公司,批號(hào):R123-01);Peroxidase-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(美國(guó)lablead公司,批號(hào):SA00001-1);熒光定量PCR試劑盒(SYBR Green qPCR Mix,美國(guó)biosharp公司,批號(hào):BL698A);TUNEL試劑盒(上海翊圣生物有限公司,批號(hào):40306ES50)。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1空白血清和含藥血清的制備 將SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為4組各10只:空白血清組按10 mL/kg的量給予生理鹽水灌胃;龜鹿二仙膠含藥血清組、龜甲膠含藥血清組及鹿角膠含藥血清組按人與動(dòng)物等效劑量比值換算給藥量[9],分別灌胃2.7 g/kg龜鹿二仙膠、0.81 g/kg龜甲膠、0.54 g/kg鹿角膠;均2次/d,連續(xù)7 d。末次灌胃2 h后,采用1.25 g/kg烏拉坦麻醉大鼠[10],腹主動(dòng)脈采血,室溫靜置2 h,3 000 r/min離心15 min,吸上清,滅活后0.22 μm濾膜過(guò)濾,-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2軟骨細(xì)胞的培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行小鼠軟骨細(xì)胞提取,無(wú)菌操作,用刀片刮取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)透明的軟骨組織,更換新刀片將軟骨組織切碎至約1 mm3大小,經(jīng)消化后獲得軟骨細(xì)胞懸液,用含10% FBS及1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基重懸軟骨細(xì)胞,接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(5%CO2、37 ℃),標(biāo)記為原代,待細(xì)胞融合約90%后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。采用Ⅱ型膠原免疫熒光染色對(duì)第1代軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定[12]。

1.5.3細(xì)胞分組及干預(yù)培養(yǎng) 將軟骨細(xì)胞分為空白組、模型組、龜鹿組、龜板組、鹿角組,每組各1塊6孔板。除空白組外,其余組均給予10 ng/mL IL-1β干預(yù)24 h,之后空白組、模型組加入10%空白血清培養(yǎng),龜鹿組加入10%龜鹿二仙膠含藥血清培養(yǎng),龜板組加入10%龜板膠含藥血清培養(yǎng),鹿角組加入10%鹿角膠含藥血清培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后,倒置相差顯微鏡觀(guān)察,進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.5.4檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.4.1軟骨細(xì)胞活性 各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,向每孔加入10 μL CCK-8試劑,孵育2 h,酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞在450 nm下的光密度(OD)。

1.5.4.2軟骨細(xì)胞凋亡情況 采用TUNEL法檢測(cè):各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,棄培養(yǎng)液,PBS洗3次,4%多聚甲醛固定,配制Proteinase K工作液,1×Equilibration Buffer室溫孵育,TdT孵育緩沖液避光孵育,DAPI染核封片,熒光顯微鏡觀(guān)察。

1.5.4.3軟骨細(xì)胞中Caspase-3、PARP-1表達(dá)情況 采用免疫熒光染色法檢測(cè):各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,棄培養(yǎng)液,PBS洗3次,4%多聚甲醛固定,常規(guī)通透、封閉,Caspase-3及PARP-1抗體孵育過(guò)夜,加入熒光二抗,DAPI染核封片,熒光顯微鏡觀(guān)察,采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析檢測(cè)數(shù)據(jù),計(jì)算平均熒光強(qiáng)度。

1.5.4.4軟骨細(xì)胞中Caspase-3、PARP-1、MMP-13、Aggrecan蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測(cè):各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,加入含有RIPA裂解液的蛋白酶抑制劑混合液提取總蛋白并定量,每組按50 μg總蛋白在恒壓條件下進(jìn)行電泳,然后采用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,封閉,加入GAPDH及Caspase-3、PARP-1、MMP-13、Aggrecan一抗(抗體稀釋比例分別為1∶10 000,1∶1 000,1∶1 000,1∶1 000,1∶3 000)孵育過(guò)夜,洗膜后加二抗(1∶10 000),37 ℃孵育1 h,洗膜,滴加超敏ECL化學(xué)發(fā)光劑凝膠顯影。采用Image Lab軟件對(duì)條帶進(jìn)行成像,選取曝光恰當(dāng)?shù)膱D片保存,分析并計(jì)算相應(yīng)條帶的灰度值。

1.5.4.5軟骨細(xì)胞中Caspase-3、PARP-1、MMP-13、Aggrecan mRNA表達(dá)情況 采用qRT-PCR法檢測(cè):各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,以Simply P總RNA提取試劑盒提取軟骨細(xì)胞的總RNA,使用紫外分光光度計(jì)測(cè)量細(xì)胞的總RNA濃度和純度。根據(jù)所測(cè)得的濃度計(jì)算含有500 ng的總RNA所需體積,按照HiScript II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,最后按照SYBR Green qPCR Mix說(shuō)明進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng),采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。Caspase-3、PARP-1、MMP-13、Aggrecan引物均由上海博尚生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行合成,引物序列見(jiàn)表1。

表1 Caspase-3、PARP-1、MMP-13、Aggrecan及GAPDH基因的引物序列

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 通過(guò)SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)本

2 結(jié) 果

2.1軟骨細(xì)胞形態(tài) 倒置相差顯微鏡下見(jiàn)原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)至第3天細(xì)胞貼壁完成,進(jìn)入快速增殖階段;培養(yǎng)至第11天,軟骨細(xì)胞均勻鋪滿(mǎn)瓶底,呈典型的“鋪路石”狀。第1代軟骨細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與原代一致,增殖速度較快,隨著傳代次數(shù)的增加,ECM減少,COL2A1結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,細(xì)胞增殖速度減慢,逐漸表現(xiàn)為長(zhǎng)梭形或形態(tài)不規(guī)則,因此選用第1代軟骨細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖1。

圖1 倒置相差顯微鏡下小鼠軟骨細(xì)胞形態(tài)

2.2軟骨細(xì)胞鑒定 熒光顯微鏡下,在不同吸收光波及發(fā)射光波激發(fā)下,COL2A1染色陽(yáng)性為紅色熒光;經(jīng)DAPI試劑復(fù)染后,細(xì)胞核出現(xiàn)清晰藍(lán)色熒光,細(xì)胞質(zhì)及胞膜均出現(xiàn)清晰的紅色熒光,表明軟骨細(xì)胞表達(dá)COL2A1,具有軟骨細(xì)胞特性。見(jiàn)圖2。

圖2 熒光顯微鏡下小鼠第1代軟骨細(xì)胞形態(tài)

2.3軟骨細(xì)胞活性及凋亡情況 與空白組比較,模型組軟骨細(xì)胞活性明顯降低(P<0.05),軟骨細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05);與模型組比較,龜鹿組、龜板組及鹿角組軟骨細(xì)胞活性均明顯升高(P均<0.05),軟骨細(xì)胞凋亡率均明顯降低(P均<0.05);與龜板組及鹿角組比較,龜鹿組軟骨細(xì)胞活性更高(P均<0.05),軟骨細(xì)胞凋亡率更低(P均<0.05);龜板組軟骨細(xì)胞活性和軟骨細(xì)胞凋亡率均明顯低于鹿角組(P均<0.05)。見(jiàn)表2及圖3。

圖3 空白組和白細(xì)胞介素-1誘導(dǎo)各組小鼠軟骨細(xì)胞凋亡情況(TUNEL檢測(cè))

表2 空白組和白細(xì)胞介素-1誘導(dǎo)各組小鼠軟骨細(xì)胞活性及凋亡情況比較

2.4軟骨細(xì)胞中Caspase-3、PARP-1陽(yáng)性表達(dá)情況 模型組Caspase-3、PARP-1平均熒光強(qiáng)度均明顯高于空白組(P均<0.05);龜鹿組、龜板組及鹿角組Caspase-3、PARP-1平均熒光強(qiáng)度均明顯低于模型組(P均<0.05),且龜鹿組Caspase-3、PARP-1平均熒光強(qiáng)度均明顯低于龜板組及鹿角組(P均<0.05),龜板組Caspase-3、PARP-1平均熒光強(qiáng)度均明顯低于鹿角組(P均<0.05)。見(jiàn)圖4、圖5及表3。

圖4 空白組和白細(xì)胞介素-1誘導(dǎo)各組小鼠軟骨細(xì)胞中Caspase-3表達(dá)情況(免疫熒光染色)

圖5 空白組和白細(xì)胞介素-1誘導(dǎo)各組小鼠軟骨細(xì)胞中PARP-1表達(dá)情況(免疫熒光染色)

表3 空白組和白細(xì)胞介素-1誘導(dǎo)各組小鼠軟骨細(xì)胞中Caspase-3、PARP-1陽(yáng)性表達(dá)平均熒光強(qiáng)度比較

2.5軟骨細(xì)胞中 Caspase-3、PARP-1、MMP-13、Aggrecan蛋白表達(dá)情況 與空白組比較,模型組Caspase-3、PARP-1、MMP-13蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05),Aggrecan蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05);與模型組比較,龜鹿組、龜板組及鹿角組Caspase-3、PARP-1、MMP-13蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05),Aggrecan蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05);與龜板組及鹿角組比較,龜鹿組Caspase-3、PARP-1、MMP-13蛋白相對(duì)表達(dá)量均更低(P均<0.05),Aggrecan蛋白相對(duì)表達(dá)量更高(P均<0.05);龜板組Caspase-3、PARP-1、MMP-13、Aggrecan蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于鹿角組(P均<0.05)。見(jiàn)圖6及表4。

圖6 空白組和白細(xì)胞介素-1誘導(dǎo)各組小鼠軟骨細(xì)胞中Caspase-3、PARP-1、MMP-13、Aggrecan蛋白表達(dá)免疫印跡

表4 空白組和白細(xì)胞介素-1誘導(dǎo)各組小鼠軟骨細(xì)胞中Caspase-3、PARP-1、MMP-13、Aggrecan蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.6軟骨細(xì)胞中Caspase-3、PARP-1、MMP-13、Aggrecan mRNA表達(dá)情況 與空白組比較,模型組Caspase-3、PARP-1、MMP-13 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05),Aggrecan mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05);與模型組比較,龜鹿組、龜板組及鹿角組Caspase-3、PARP-1、MMP-13 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05),Aggrecan mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05);與龜板組及鹿角組比較,龜鹿組Caspase-3、PARP-1、MMP-13 mRNA相對(duì)表達(dá)量均更低(P均<0.05),Aggrecan mRNA相對(duì)表達(dá)量更高(P均<0.05);龜板組Caspase-3、PARP-1、MMP-13、Aggrecan mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于鹿角組(P均<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 空白組和白細(xì)胞介素-1誘導(dǎo)各組小鼠軟骨細(xì)胞中Caspase-3、PARP-1、MMP-13、Aggrecan mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

膝骨關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)“痹證”范疇,其中辨證為肝腎虧虛證者多表現(xiàn)為腰膝酸軟、倦怠乏力,甚或肌萎無(wú)力,不耐久行[13]。龜鹿二仙膠出自《醫(yī)方考》,具有填補(bǔ)精髓、益氣壯陽(yáng)之功,正是針對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎肝腎虧虛而設(shè)。

目前認(rèn)為關(guān)節(jié)局部長(zhǎng)期存在的炎癥環(huán)境在膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,其中IL-1β起到尤為關(guān)鍵的作用[14-15]。IL-1β激活能夠引起ECM降解,誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡[16-17]。關(guān)節(jié)軟骨由軟骨細(xì)胞和ECM組成,而軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨的主要組成部分,軟骨細(xì)胞凋亡是膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的主要原因[18-19]。因此,抑制軟骨細(xì)胞凋亡可能是防治膝骨關(guān)節(jié)炎的有效途徑。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞活性明顯降低,細(xì)胞凋亡率升高;給予龜鹿二仙膠及拆方干預(yù)后,軟骨細(xì)胞活性升高,細(xì)胞凋亡率降低,其中龜鹿二仙膠抑制凋亡的作用優(yōu)于龜板膠及鹿角膠,龜板膠優(yōu)于鹿角膠,這與前期研究報(bào)道一致[6-7];而鹿角膠提高軟骨細(xì)胞活性的作用強(qiáng)于龜板膠。

ECM分解代謝大于合成代謝是膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的另一重要機(jī)制[20]。相關(guān)研究表明,IL-1β在誘導(dǎo)ECM降解過(guò)程中也發(fā)揮了重要作用[21],其既可抑制軟骨細(xì)胞Aggrecan合成,又能促進(jìn)MMP-13的表達(dá)以促進(jìn)ECM的降解,從而加速軟骨組織的破壞[22]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn),IL-1β能顯著上調(diào)軟骨細(xì)胞MMP-13蛋白及mRNA表達(dá),下調(diào)Aggrecan蛋白及mRNA表達(dá);在龜鹿二仙膠及拆方作用下,MMP-13 蛋白及mRNA表達(dá)下調(diào),Aggrecan蛋白及mRNA表達(dá)上調(diào),從而維持ECM合成與分解代謝之間的平衡,且龜鹿二仙膠藥效強(qiáng)于龜板膠及鹿角膠。

為了進(jìn)一步探究龜鹿二仙膠及拆方抑制IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡及ECM降解的作用機(jī)制,本研究對(duì)Caspase-3通路相關(guān)因子進(jìn)行檢測(cè)。Caspase屬于IL-1轉(zhuǎn)化酶家族,Caspase-3是凋亡通路的關(guān)鍵基因,可通過(guò)激活下游靶基因PARP,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,龜鹿二仙膠及拆方各組IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中Caspase-3及PARP-1平均熒光強(qiáng)度、蛋白及mRNA表達(dá)均明顯下調(diào),說(shuō)明龜鹿二仙膠及拆方可抑制Caspase-3/PARP信號(hào)通路的激活。

綜上所述,龜板膠可抑制軟骨細(xì)胞凋亡及ECM降解,鹿角膠可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和ECM合成代謝,龜鹿二仙膠作用效果優(yōu)于龜板膠及鹿角膠,其作用機(jī)制可能與抑制Caspase-3/PARP信號(hào)通路的激活有關(guān)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。