馮博 楊梅 伍儉兒 王方海

摘要? ［目的］了解重要的轉(zhuǎn)錄因子Tramtrack蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，以及在卵和5齡若蟲身體各部位的表達(dá)情況。［方法］在已獲得的白背飛虱tramtrack基因的cDNA序列基礎(chǔ)上，對(duì)其編碼的Tramtrack蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。［結(jié)果］該蛋白等電點(diǎn)為8.24，屬于堿性蛋白，無(wú)信號(hào)肽，屬于親水性蛋白，有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其三維結(jié)構(gòu)主要是α-螺旋，少部分是β-折疊。定量PCR檢測(cè)表明在白背飛虱受精卵中tramtrack基因的表達(dá)明顯高于未受精卵；此外tramtrack基因在五齡若蟲頭部表達(dá)顯著高于在胸部或腹部表達(dá)。［結(jié)論］這是第一次有關(guān)水稻害蟲稻飛虱的Tramtrack蛋白的研究報(bào)道，為今后探究該蛋白在水稻害蟲中的具體功能角色提供前期基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞? Tramtrack；結(jié)構(gòu)分析；白背飛虱；基因表達(dá)

中圖分類號(hào)? Q966? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A? 文章編號(hào)? 0517-6611（2024）04-0133-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.04.029

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Structural Characteristics of Tramtrack Protein and Its High Expression in the Head of Zygotes and Fifth Instar Nymphs of Sogatella furcifera

FENG Bo， YANG Mei， WU Jian.er et al

（State Key Laboratory for Biocontrol and Resource Utilization/Institute of Entomology， Sun Yat.sen University， Guangzhou， Guangdong 510275）

Abstract? ［Objective］To understand the structural characteristics of Tramtrack protein， and its expression in eggs and the 5th instar nymph.［Method］The structure of Tramtrack protein of Sogatella furcifera encoded by the obtained cDNA sequence of tramtrack gene was analyzed. ［Ｒesult］The protein was a basic protein， no signal peptide， a hydrophilic protein with multiple phosphorylation sites and its isoelectric point was 8.24. The three.dimensional structure of the protein was mainly α.helix， and a small part was β.fold.? Quantitative PCR detected that the mRNA level of tramtrack gene in the fertilized eggs of white.backed planthopper was much higher compare to that in unfertilized eggs.? In addition， the mRNA level of tramtrack gene in the head of fifth instar nymphs was much higher compare to that in the chest or abdomen.? ［Conclusion］This is the first detailed report on the Tramtrack protein of white.backed planthopper， which lays a foundation for further in vitro expression and functional study of this protein gene， and is conducive to the future exploration of the specific function and regulatory role of this protein in the growth and development of rice planthopper.

Key words? Tramtrack；Structural analysis；Sogatella furcifera；Gene expression

基金項(xiàng)目? 廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2021A1515012402）。

作者簡(jiǎn)介? 馮博（1997—），男，天津人，碩士研究生，研究方向：昆蟲學(xué)。*通信作者，教授，博士，從事昆蟲學(xué)研究。

收稿日期? 2023-02-18

Tramtrack蛋白是由tramtrack基因編碼的蛋白質(zhì)，隸屬于BTB（Broad-complex，Tramtrack，and Bric.a.brac）蛋白家族，最早發(fā)現(xiàn)于果蠅［1］。對(duì)tramtrack基因的研究表明，該基因具有特定的鋅指結(jié)構(gòu)，在其N末端則帶有BTB結(jié)構(gòu)域，也稱為poxvirus and zinc finger（POZ）結(jié)構(gòu)域。組成該結(jié)構(gòu)域的120個(gè)氨基酸以疏水性氨基酸為主，形成由4段α螺旋和部分β折疊所組成的二級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步形成具有特定的可與其他蛋白發(fā)生相互作用的三維空間結(jié)構(gòu)［2-3］。該結(jié)構(gòu)域既可以參與同源二聚體的形成和蛋白質(zhì)間的交互作用，也能改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致特定基因的開關(guān)［4-5］。BTB 蛋白遍布在整個(gè)真核生物中，且不同物種間的BTB蛋白高度保守［2］。研究發(fā)現(xiàn)BTB 蛋白具有多種功能，如調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、重構(gòu)染色質(zhì)、降解蛋白等。在哺乳動(dòng)物中也有報(bào)道BTB 蛋白影響淋巴細(xì)胞發(fā)育、軸突導(dǎo)向和性腺形態(tài)發(fā)生等［5］。而鋅指蛋白可與特定的DNA 序列結(jié)合，從而影響或調(diào)控某些基因的表達(dá)［6］。

tramtrack基因已發(fā)現(xiàn)多種，表達(dá)的蛋白功能多樣，在生物體生長(zhǎng)發(fā)育等過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)在果蠅中該基因參與神經(jīng)系統(tǒng)的分化［7-8］、調(diào)節(jié)卵泡成熟及排卵［9］、參與雄性求偶行為調(diào)節(jié)［10-11］等。隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步和發(fā)展，許多昆蟲基因組序列得到解碼和公布，愈來愈多的昆蟲tramtrack基因被發(fā)現(xiàn)［12-13］，但除果蠅外，其他昆蟲中有關(guān)Tramtrack蛋白的結(jié)構(gòu)和功能則研究很少，特別在水稻害蟲中，該類蛋白的結(jié)構(gòu)和功能都是未知，有待研究。

白背飛虱（Sogatella furcifera）為水稻重要害蟲，屬昆蟲綱半翅目飛虱科［14］。成蟲前胸背板以及中胸背板均為白色，其名由此而來［15］。白背飛虱整個(gè)生活史包括卵、若蟲和成蟲3個(gè)階段，屬于不完全變態(tài)，成蟲有翅二型現(xiàn)象。該研究前期已測(cè)定獲得了此蟲的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，比對(duì)到全長(zhǎng)1 377 bp的tramtrack基因cDNA開放閱讀框序列（序列號(hào)c53168_c4_g1_i3），編碼由458個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，筆者在此基礎(chǔ)上分析白背飛虱Tramtrack蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并采用熒光定量 PCR 方法測(cè)定了該蛋白基因在受精卵和未受精卵，以及5齡若蟲不同部位的表達(dá)水平。研究結(jié)果有助于了解水稻害蟲Tramtrack蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和表達(dá)水平，為進(jìn)一步研究其在水稻害蟲中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

蟲源采自廣州市郊外的華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)田，在室溫（28±2）℃、 70 %相對(duì)濕度和16 h光照：8 h黑暗的條件下進(jìn)行飼養(yǎng)。選取交配和未交配、且腹部肥大即將產(chǎn)卵的雌成蟲各10頭，在體式顯微鏡下分別解剖取出已成熟的卵，放入低溫冰箱中保存待用。另外選取五齡第2天的雌若蟲10頭，先低溫冷凍處理，再用刀片將所有蟲體切成頭部、胸部和腹部，然后收集各個(gè)部位的樣品儲(chǔ)存在低溫冰箱中待用。以上樣品重復(fù)3次。

1.2? Tramtrack蛋白的理化性質(zhì)分析

利用網(wǎng)上軟件 ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam.html）、SignalP-5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）和NetPhos-3.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetPhos-3.1）對(duì)白背飛虱Tramtrack蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行具體分析。

1.3? Tramtrack蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

在網(wǎng)上軟件Swiss-Model（https：//swissmodel.expasy.org/）中提交白背飛虱Tramtrack蛋白的氨基酸序列，采用同源建模法模擬構(gòu)建出Tramtrack三維結(jié)構(gòu)。

1.4? 定量PCR檢測(cè)

采用Trizol試劑盒（Invitrogen，美國(guó)）從受精卵、未受精卵和5齡頭、胸、腹的樣品中分別提取總 RNA，再根據(jù)PrimeScriptTM RT Master Mix（TaKaRa，日本）試劑盒的操作說明，分別反轉(zhuǎn)錄合成各樣品的cDNA。設(shè)計(jì)出Tramtrack蛋白基因的引物（F：TCCTGGTTTGAAATCCCTT；R：CAACTCACCATCGCACAAT）。內(nèi)參基因?yàn)棣?actin（NCBI的登錄號(hào)為NC_004354.4），試驗(yàn)使用的方法為SYBR green qRT-PCR。使用2-ΔΔCT法處理相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果，數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 26軟件。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 白背飛虱Tramtrack蛋白的理化分析

Tramtrack蛋白理論等電點(diǎn)為8.24，屬于堿性蛋白。由圖1可知，白背飛虱Tramtrack為親水性蛋白。SignalP-5.0在線軟件預(yù)測(cè)分析Tramtrack的SP 信號(hào)肽值為0.000 5，沒有信號(hào)肽（圖2）。Netphos 對(duì)Tramtrack的重要磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該蛋白有 42個(gè)絲氨酸、13個(gè)蘇氨酸、5個(gè)酪氨酸位點(diǎn)（圖3）。

2.2? 白背飛虱Tramtrack蛋白的三維結(jié)構(gòu)分析

建模得到的三維結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋構(gòu)成，還有少部分的β-折疊（圖4）。

2.3? 編碼Tramtrack蛋白的基因在白背飛虱卵和五齡若蟲頭、胸、腹中的表達(dá)

編碼Tramtrack蛋白的mRNA在白背飛虱受精卵中含量顯著高于未受精卵（圖5）。在白背飛虱五齡若蟲中，Tramtrack蛋白基因在胸部和腹部的表達(dá)量接近，差異不顯著，但在頭部的表達(dá)顯著升高，與在胸部和腹部的表達(dá)相比差異顯著（圖6）。

3? 結(jié)論與討論

該研究在已獲得的白背飛虱全長(zhǎng)1 377 bp的tramtrack基因cDNA開放閱讀框序列的基礎(chǔ)上，對(duì)其編碼的由458個(gè)氨基酸所組成的Tramtrack蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，該蛋白等電點(diǎn)為8.24，屬于堿性蛋白，無(wú)信號(hào)肽，為親水性蛋白，有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其三維結(jié)構(gòu)主要是α-螺旋，少部分是β-折疊。這說明白背飛虱Tramtrack蛋白在結(jié)構(gòu)上與其他物種的相關(guān)蛋白類似，進(jìn)一步說明該類蛋白在不同物種中具有高度保守性［2］。這是第一次有關(guān)水稻害蟲稻飛虱的Tramtrack蛋白的研究報(bào)道，為今后具體探究該蛋白在水稻害蟲中的具體功能角色提供前期基礎(chǔ)。

定量PCR檢測(cè)表明在白背飛虱受精卵中tramtrack基因的表達(dá)明顯高于未受精卵。由于卵內(nèi)mRNA均來源于母體［16］，推測(cè)交配受精行為可能會(huì)增強(qiáng)母體tramtrack基因的表達(dá)，故受精卵中tramtrack的mRNA量高于未受精卵。具體情況還有待進(jìn)一步證實(shí)。此外，定量PCR檢測(cè)還發(fā)現(xiàn)tramtrack基因在五齡若蟲頭部表達(dá)顯著高于在胸部或腹部表達(dá)。這與已有報(bào)道認(rèn)為這個(gè)基因主要在頭部神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)和發(fā)揮作用相一致［8，10］。

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