吳旭，金鵬，劉洋，邢海艷，吳義春，孫儷，蘇晶

（淮安市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇淮安 223300）

新康唑是一種咪唑類新型廣譜抗生素[1]，具有去屑、殺菌和調(diào)節(jié)皮膚油脂[2]的作用，在我國(guó)暫未列入《已使用化妝品原料名稱目錄》，在歐洲化妝品領(lǐng)域中作為去屑劑使用[3]。達(dá)克羅寧是一種處方類局部麻醉藥，起效快、持續(xù)久，通過(guò)阻斷神經(jīng)沖動(dòng)或刺激傳導(dǎo)，抑制觸覺(jué)和痛覺(jué)，具有止痛、止癢及殺菌的作用[4]。美國(guó)藥典第35 版已有收錄，我國(guó)藥典2020版還未收錄，在我國(guó)臨床已廣泛使用多年，有膠漿劑[5]、乳膏劑[6]、洗劑[7]等種劑型，多用于黏膜表面麻醉[8]及皮膚鎮(zhèn)痛、止癢[9]。一些不法商家在化妝品中非法添加新康唑和達(dá)克羅寧，使化妝品具有快速去濕疹、去紅血絲、止癢等使用效果。長(zhǎng)期使用添加新康唑和達(dá)克羅寧的化妝品，會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生影響[10-12]，特別是藥物濫用會(huì)給兒童帶來(lái)的巨大危害[13-14]。

新康唑和達(dá)克羅寧在化妝品中的檢測(cè)研究較少，已知檢測(cè)方法包括紫外分光光度法[15]、高效液相色譜法[16]等。為了更好地服務(wù)化妝品安全監(jiān)管，規(guī)范化妝品中禁限用物質(zhì)檢測(cè)技術(shù)要求，確?；瘖y品安全質(zhì)量，筆者采用超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立化妝品中新康唑和達(dá)克羅寧非法添加物定性、定量檢測(cè)方法，提高化妝品非法添加物檢測(cè)效率、減少基質(zhì)干擾、節(jié)約檢測(cè)成本，并進(jìn)行方法的驗(yàn)證及應(yīng)用研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

三重四極桿質(zhì)譜儀：AB SCⅠEX APⅠ 4000+型，配有V型Turbo電離源，美國(guó)AB SCⅠEX公司。

超高效液相色譜儀：Waters Acquity UPLC HClass型，美國(guó)沃特世公司。

電子天平：XS205D 型，感量為0.01 mg,瑞士梅特勒-托利多科技有限公司。

高速低溫離心機(jī)：Thermo MULTⅠFUGE X1R型，美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

超聲波清洗儀：KH7200 型，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

渦旋混合儀：XW-80A 型，上海馳唐電子有限公司。

超純水機(jī)：Milli-QR型，美國(guó)密理博公司。

甲醇、乙腈、甲酸：均為色譜純，美國(guó)默克公司。

氯化鈉：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

飽和氯化鈉溶液：稱取40 g 氯化鈉，置于250 mL燒杯中，加入100 mL水，超聲15 min。

鹽酸達(dá)克羅寧：質(zhì)量分?jǐn)?shù)（按C18H27NO2·HCl計(jì)）為99.8%，批號(hào)為100423-201102，于105 ℃干燥3 h后使用，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

新康唑：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.8%，批號(hào)為1028-RC-0061，上海源葉生物科技有限公司。

化妝品樣品：爽膚水、凝膠、潤(rùn)膚霜、精華油、潤(rùn)膚乳5種化妝品，市售。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色 譜 柱：Waters ACQUⅠTY UPLC?BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm，美國(guó)沃特世公司）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：2 μL；流動(dòng)相：A相為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸溶液，B 相為甲醇，梯度洗脫程序見(jiàn)表1，流量為0.3 mL/min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESⅠ源）；監(jiān)測(cè)模式：正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；監(jiān)測(cè)離子對(duì)及相關(guān)參數(shù)設(shè)定見(jiàn)表2。

表2 達(dá)克羅寧和新康唑質(zhì)譜分析參數(shù)Tab.2 Mass analysis parameters of dyclonine and elubiol

1.3 溶液制備

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液

精密稱取達(dá)克羅寧、新康唑標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg（精確到0.01 mg），分別置于10 mL棕色容量瓶中，加入乙腈使溶解并定容至標(biāo)線，搖勻。所得達(dá)克羅寧、新康唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的質(zhì)量濃度均為1 000 mg/L。

1.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液

準(zhǔn)確移取達(dá)克羅寧、新康唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各1.0 mL，置于100 mL 棕色容量瓶中，用乙腈稀釋定容至標(biāo)線，搖勻，于-18 ℃冰箱中避光保存。該混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液中兩組分的質(zhì)量濃度均為10 mg/L。

1.3.3 樣品溶液

稱取化妝品樣品0.2 g（精確至0.1 mg），置于20 mL具塞比色管中，加入飽和氯化鈉溶液2 mL，渦旋振蕩30 s，加入乙腈1 mL，渦旋30 s，再加入乙腈10 mL，渦旋30 s，置冰浴中超聲提取30 min，以4 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min。將乙腈層移入另一20 mL具塞比色管中，殘?jiān)偌尤胍译? mL，重復(fù)提取一次，合并兩次乙腈提取液，并用乙腈定容至標(biāo)線，取上述提取液用0.22 μm 有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾，濾液作為樣品溶液。

1.3.4 空白基質(zhì)提取溶液

稱取空白化妝品樣品0.2 g（精確至0.1 mg），置于20 mL具塞比色管中，與樣品溶液制備同法處理，作為空白基質(zhì)提取液。

1.3.5 基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)中間液

準(zhǔn)確量取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1.0 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，用空白基質(zhì)提取液稀釋至標(biāo)線，搖勻，制成達(dá)克羅寧、新康唑質(zhì)量濃度均為1 000 μg/L的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.6 系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

移取基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)中間液適量，用空白基質(zhì)提取溶液稀釋，制得達(dá)克羅寧、新康唑質(zhì)量濃度均分別為1、5、10、20、50、100 μg/L 的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

在1.2儀器工作條件下，將系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別進(jìn)樣測(cè)定，以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)色譜峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，建立基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。取樣品溶液進(jìn)樣測(cè)定，將對(duì)應(yīng)目標(biāo)物色譜峰面積代入基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到目標(biāo)物的質(zhì)量濃度，再計(jì)算得到樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理方法討論

2.1.1 提取溶劑的選擇

化妝品基質(zhì)復(fù)雜，達(dá)克羅寧和新康唑在甲醇、乙腈中的溶解作用良好。以空白加標(biāo)樣品為對(duì)象，比較了飽和氯化鈉-乙腈、乙腈和甲醇三種提取溶液對(duì)兩種目標(biāo)物的提取效率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同提取溶劑提取回收率（n=6）Tab.3 Recovery rates of different solvents extraction (n=6)

由表3數(shù)據(jù)可知，乙腈或飽和氯化鈉-乙腈提取溶液對(duì)兩種目標(biāo)物的提取回收率均較高，但乙腈提取后的樣品不易完全溶解，有結(jié)塊，而添加飽和氯化鈉溶液可避免樣品起泡，有利于樣品破乳溶解，對(duì)兩種目標(biāo)物的提取效率均良好，因此選擇采用飽和氯化鈉-乙腈作為提取溶劑。

2.1.2 提取方式和提取條件的選擇

以陽(yáng)性樣品為考察對(duì)象，分別在冰浴、室溫（25 ℃）、60 ℃三種提取溫度下超聲提取30 min，以及在冰浴下超聲提取0、10、20、30、40 min，考察不同提取方式的目標(biāo)物提取率，結(jié)果列于表4和表5。

表4 不同超聲提取溫度下目標(biāo)物測(cè)定值（n=6）Tab.4 Test results of different ultrasonic extraction temperatures

表5 不同超聲提取時(shí)間的目標(biāo)物測(cè)定值（n=6）Tab.5 Test results of different ultrasound extraction times

由表4可知，隨著提取溫度增加，目標(biāo)物測(cè)定值減小，因此確定采用冰浴提取樣品。由表5可知，冰浴條件下兩種目標(biāo)物測(cè)定值隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)30 min后有所減小。綜合考慮提取效率和提取時(shí)間，選擇超聲提取時(shí)間為30 min。最終選擇冰浴條件下超聲30 min來(lái)提取目標(biāo)物。

2.2 色譜條件

2.2.1 液相色譜柱的選擇

實(shí)驗(yàn)比較了Waters ACQUⅠTY UPLC?BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm，美國(guó)沃特世公司）和Thermo Hepersil Gold C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國(guó)賽默飛世爾科技公司）2種不同品牌類型的C18色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物峰型及分離效果的影響，結(jié)果表明，二者均能夠滿足分析要求，由于Waters ACQUⅠTY UPLC?BEH C18色譜柱出峰時(shí)間更快，所以選擇其作為實(shí)驗(yàn)用色譜柱。

2.2.2 流動(dòng)相的選擇

參考《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》，分別采用甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-水和乙腈-0.1%甲酸水體系作流動(dòng)相，比較了目標(biāo)化合物的色譜峰形及分離效果，結(jié)果表明，在三種流動(dòng)相體系下目標(biāo)化合物均可得到有效分離，且色譜峰形良好?？紤]到加入適量酸可以提供質(zhì)譜的離子化效果，使用甲醇可節(jié)約成本，最終選擇甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相。

2.3 質(zhì)譜條件

設(shè)定色譜流動(dòng)相流量為0.3 mL/min，按照儀器廠家推薦設(shè)置氣流、源溫、毛細(xì)管電壓等參數(shù)（噴霧壓力：207 kPa；干燥氣壓力：379 kPa；干燥氣溫度：500 ℃；毛細(xì)管電壓：5 500 V），利用三重四極桿質(zhì)譜定量和定性分析，針對(duì)每個(gè)目標(biāo)物分別進(jìn)樣進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，主要包括定性和定量離子對(duì)、錐孔電壓和碰撞能量的選擇。從一級(jí)質(zhì)譜掃描圖和二級(jí)碎裂質(zhì)譜掃描圖可知，達(dá)克羅寧在ESⅠ正離子模式下，形成[M+H]準(zhǔn)分子離子峰290.1，主要碎片離子質(zhì)荷比為97.8、70.1；新康唑準(zhǔn)分子離子峰質(zhì)荷比為561.3，主要碎片離子質(zhì)荷比為515.2、489.2。采用儀器優(yōu)化程序?qū)ι鲜鲭x子對(duì)的錐孔電壓和碰撞能量值進(jìn)行優(yōu)化，最終確定達(dá)克羅寧錐孔電壓分別為102、70 V，碰撞能量分別為16、60 eV，新康唑錐孔電壓分別為115、115 V，碰撞能量分別為45、42 eV。

2.4 專屬性

經(jīng)過(guò)處理的空白化妝品樣品、空白化妝品樣品加標(biāo)對(duì)照品，在選定的色譜條件下注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 空白樣品和空白加標(biāo)樣品的UHPLC-MS/MS色譜圖Fig.1 UHPLC-MS/MS chromatograms of blank sample and blank spiked sample

由圖1可見(jiàn)，化妝品基質(zhì)對(duì)2種待測(cè)物質(zhì)測(cè)定無(wú)干擾，說(shuō)明所建方法適用于化妝品中兩種目標(biāo)物的測(cè)定。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

分別選擇爽膚水、凝膠、潤(rùn)膚霜、精華油、潤(rùn)膚乳5種典型的空白化妝品作為基質(zhì)，考察基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6數(shù)據(jù)可以看出，達(dá)克羅寧和新康唑在化妝品中存在基質(zhì)效應(yīng)，低含量時(shí)基質(zhì)效應(yīng)影響較小，而高含量時(shí)基質(zhì)效應(yīng)顯著，所以采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線作為定量校準(zhǔn)曲線。

表6 空白化妝品樣品中兩種目標(biāo)物基質(zhì)效應(yīng)Tab.6 Measurement results of matrix effects of two compounds to be tested in blank samples

2.6 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

在設(shè)定的分析條件下，測(cè)定系列濃度的目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和空白樣品的目標(biāo)物基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以目標(biāo)物質(zhì)量濃度（ρ）為橫坐標(biāo)，目標(biāo)物色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸(權(quán)重因子1/X)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線、校準(zhǔn)曲線，線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍分別見(jiàn)表7 和表8。比較發(fā)現(xiàn)校準(zhǔn)曲線線性明顯優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)曲線，故確定用校準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

表7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Tab.7 Regression equation, correlation coefficient, and linear range of solution standard curve

表8 校準(zhǔn)曲線的線性方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Tab.8 Regression equation, correlation coefficient, and linear range of blank matrix standard curve

2.7 檢出限和定量限

以測(cè)定最低濃度點(diǎn)信噪比大于10 來(lái)確定方法定量限。結(jié)果顯示，達(dá)克羅寧和新康唑溶液濃度為1 ng/mL 時(shí)，信噪比分別為1 406.1±5.02，364.1±8.28（n=6），空白樣品加標(biāo)0.1 μg/g 時(shí)，信噪比分別為3 313.0±11.25，277.3±8.77（n=6），均大于10。考慮不同儀器、不同色譜柱等因素，該方法中達(dá)克羅寧和新康唑的定量限均確定為1 ng/mL，當(dāng)取樣量為0.2 g時(shí)，可檢測(cè)到的樣品最低質(zhì)量分?jǐn)?shù)均確定為0.1 μg/g；按照3倍檢出限為定量限原則，以上述定量限計(jì)算，確定該方法中達(dá)克羅寧和新康唑的檢出限均為0.3 ng/mL，當(dāng)取樣量為0.2 g 時(shí)，可檢測(cè)到的樣品最低質(zhì)量分?jǐn)?shù)均確定為0.03 μg/g。

2.8 精密度和準(zhǔn)確度

選擇爽膚水、凝膠、潤(rùn)膚霜、精華油、潤(rùn)膚乳5種典型的空白化妝品樣品作為驗(yàn)證基質(zhì)，在方法定量限、兩倍方法定量限和十倍方法定量限進(jìn)行三水平空白基質(zhì)加標(biāo)試驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)6次，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 5種典型基質(zhì)中兩種目標(biāo)物的精密度和準(zhǔn)確度Tab.9 Precision and accuracy assessment for two target substances in 5 typical matrices

根據(jù)化妝品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法管理辦法，被測(cè)組分含量在0.01～0.1、0.1～1、1～10 mg/kg時(shí)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為小于等于21%、小于等于15%、小于等于7.5%。被測(cè)組分添加水平小于等于0.1、0.1～1、1～100 mg/kg 時(shí)回收率范圍分別為60%～120%、80%～110%、90%～110%。由表9 數(shù)據(jù)可知，該方法兩種目標(biāo)物的精密度和準(zhǔn)確度均滿足分析技術(shù)要求。

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)對(duì)化妝品中兩種目標(biāo)物樣品前處理方法的選擇，分析條件的優(yōu)化，最終建立了化妝品中達(dá)克羅寧和新康唑兩種目標(biāo)物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。該方法分析速度快、靈敏度高、應(yīng)用范圍廣，可以滿足化妝品中達(dá)克羅寧和新康唑兩種目標(biāo)物的檢測(cè)要求，為化妝品中非法添加的檢測(cè)提供技術(shù)支持。