吳旭,金鵬,劉洋,邢海艷,吳義春,孫儷,蘇晶
(淮安市食品藥品檢驗所,江蘇淮安 223300)
新康唑是一種咪唑類新型廣譜抗生素[1],具有去屑、殺菌和調(diào)節(jié)皮膚油脂[2]的作用,在我國暫未列入《已使用化妝品原料名稱目錄》,在歐洲化妝品領(lǐng)域中作為去屑劑使用[3]。達克羅寧是一種處方類局部麻醉藥,起效快、持續(xù)久,通過阻斷神經(jīng)沖動或刺激傳導(dǎo),抑制觸覺和痛覺,具有止痛、止癢及殺菌的作用[4]。美國藥典第35 版已有收錄,我國藥典2020版還未收錄,在我國臨床已廣泛使用多年,有膠漿劑[5]、乳膏劑[6]、洗劑[7]等種劑型,多用于黏膜表面麻醉[8]及皮膚鎮(zhèn)痛、止癢[9]。一些不法商家在化妝品中非法添加新康唑和達克羅寧,使化妝品具有快速去濕疹、去紅血絲、止癢等使用效果。長期使用添加新康唑和達克羅寧的化妝品,會對人體健康產(chǎn)生影響[10-12],特別是藥物濫用會給兒童帶來的巨大危害[13-14]。
新康唑和達克羅寧在化妝品中的檢測研究較少,已知檢測方法包括紫外分光光度法[15]、高效液相色譜法[16]等。為了更好地服務(wù)化妝品安全監(jiān)管,規(guī)范化妝品中禁限用物質(zhì)檢測技術(shù)要求,確?;瘖y品安全質(zhì)量,筆者采用超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),建立化妝品中新康唑和達克羅寧非法添加物定性、定量檢測方法,提高化妝品非法添加物檢測效率、減少基質(zhì)干擾、節(jié)約檢測成本,并進行方法的驗證及應(yīng)用研究。
三重四極桿質(zhì)譜儀:AB SCⅠEX APⅠ 4000+型,配有V型Turbo電離源,美國AB SCⅠEX公司。
超高效液相色譜儀:Waters Acquity UPLC HClass型,美國沃特世公司。
電子天平:XS205D 型,感量為0.01 mg,瑞士梅特勒-托利多科技有限公司。
高速低溫離心機:Thermo MULTⅠFUGE X1R型,美國賽默飛世爾科技公司。
超聲波清洗儀:KH7200 型,昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。
渦旋混合儀:XW-80A 型,上海馳唐電子有限公司。
超純水機:Milli-QR型,美國密理博公司。
甲醇、乙腈、甲酸:均為色譜純,美國默克公司。
氯化鈉:分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司。
飽和氯化鈉溶液:稱取40 g 氯化鈉,置于250 mL燒杯中,加入100 mL水,超聲15 min。
鹽酸達克羅寧:質(zhì)量分?jǐn)?shù)(按C18H27NO2·HCl計)為99.8%,批號為100423-201102,于105 ℃干燥3 h后使用,中國食品藥品檢定研究院。
新康唑:質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.8%,批號為1028-RC-0061,上海源葉生物科技有限公司。
化妝品樣品:爽膚水、凝膠、潤膚霜、精華油、潤膚乳5種化妝品,市售。
1.2.1 色譜條件
色 譜 柱:Waters ACQUⅠTY UPLC?BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm,美國沃特世公司);柱溫:30 ℃;進樣體積:2 μL;流動相:A相為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸溶液,B 相為甲醇,梯度洗脫程序見表1,流量為0.3 mL/min。
1.2.2 質(zhì)譜條件
離子源:電噴霧離子源(ESⅠ源);監(jiān)測模式:正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM);監(jiān)測離子對及相關(guān)參數(shù)設(shè)定見表2。
表2 達克羅寧和新康唑質(zhì)譜分析參數(shù)Tab.2 Mass analysis parameters of dyclonine and elubiol
1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液
精密稱取達克羅寧、新康唑標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg(精確到0.01 mg),分別置于10 mL棕色容量瓶中,加入乙腈使溶解并定容至標(biāo)線,搖勻。所得達克羅寧、新康唑標(biāo)準(zhǔn)儲備液的質(zhì)量濃度均為1 000 mg/L。
1.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液
準(zhǔn)確移取達克羅寧、新康唑標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液各1.0 mL,置于100 mL 棕色容量瓶中,用乙腈稀釋定容至標(biāo)線,搖勻,于-18 ℃冰箱中避光保存。該混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液中兩組分的質(zhì)量濃度均為10 mg/L。
1.3.3 樣品溶液
稱取化妝品樣品0.2 g(精確至0.1 mg),置于20 mL具塞比色管中,加入飽和氯化鈉溶液2 mL,渦旋振蕩30 s,加入乙腈1 mL,渦旋30 s,再加入乙腈10 mL,渦旋30 s,置冰浴中超聲提取30 min,以4 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min。將乙腈層移入另一20 mL具塞比色管中,殘渣再加入乙腈8 mL,重復(fù)提取一次,合并兩次乙腈提取液,并用乙腈定容至標(biāo)線,取上述提取液用0.22 μm 有機微孔濾膜過濾,濾液作為樣品溶液。
1.3.4 空白基質(zhì)提取溶液
稱取空白化妝品樣品0.2 g(精確至0.1 mg),置于20 mL具塞比色管中,與樣品溶液制備同法處理,作為空白基質(zhì)提取液。
1.3.5 基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)中間液
準(zhǔn)確量取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1.0 mL,置于10 mL棕色容量瓶中,用空白基質(zhì)提取液稀釋至標(biāo)線,搖勻,制成達克羅寧、新康唑質(zhì)量濃度均為1 000 μg/L的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)中間液,應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。
1.3.6 系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液
移取基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)中間液適量,用空白基質(zhì)提取溶液稀釋,制得達克羅寧、新康唑質(zhì)量濃度均分別為1、5、10、20、50、100 μg/L 的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。
在1.2儀器工作條件下,將系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別進樣測定,以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對應(yīng)色譜峰面積為縱坐標(biāo),進行線性回歸,建立基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。取樣品溶液進樣測定,將對應(yīng)目標(biāo)物色譜峰面積代入基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到目標(biāo)物的質(zhì)量濃度,再計算得到樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。
2.1.1 提取溶劑的選擇
化妝品基質(zhì)復(fù)雜,達克羅寧和新康唑在甲醇、乙腈中的溶解作用良好。以空白加標(biāo)樣品為對象,比較了飽和氯化鈉-乙腈、乙腈和甲醇三種提取溶液對兩種目標(biāo)物的提取效率,結(jié)果見表3。
表3 不同提取溶劑提取回收率(n=6)Tab.3 Recovery rates of different solvents extraction (n=6)
由表3數(shù)據(jù)可知,乙腈或飽和氯化鈉-乙腈提取溶液對兩種目標(biāo)物的提取回收率均較高,但乙腈提取后的樣品不易完全溶解,有結(jié)塊,而添加飽和氯化鈉溶液可避免樣品起泡,有利于樣品破乳溶解,對兩種目標(biāo)物的提取效率均良好,因此選擇采用飽和氯化鈉-乙腈作為提取溶劑。
2.1.2 提取方式和提取條件的選擇
以陽性樣品為考察對象,分別在冰浴、室溫(25 ℃)、60 ℃三種提取溫度下超聲提取30 min,以及在冰浴下超聲提取0、10、20、30、40 min,考察不同提取方式的目標(biāo)物提取率,結(jié)果列于表4和表5。
表4 不同超聲提取溫度下目標(biāo)物測定值(n=6)Tab.4 Test results of different ultrasonic extraction temperatures
表5 不同超聲提取時間的目標(biāo)物測定值(n=6)Tab.5 Test results of different ultrasound extraction times
由表4可知,隨著提取溫度增加,目標(biāo)物測定值減小,因此確定采用冰浴提取樣品。由表5可知,冰浴條件下兩種目標(biāo)物測定值隨提取時間的延長而增大,當(dāng)提取時間超過30 min后有所減小。綜合考慮提取效率和提取時間,選擇超聲提取時間為30 min。最終選擇冰浴條件下超聲30 min來提取目標(biāo)物。
2.2.1 液相色譜柱的選擇
實驗比較了Waters ACQUⅠTY UPLC?BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm,美國沃特世公司)和Thermo Hepersil Gold C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm,美國賽默飛世爾科技公司)2種不同品牌類型的C18色譜柱對目標(biāo)化合物峰型及分離效果的影響,結(jié)果表明,二者均能夠滿足分析要求,由于Waters ACQUⅠTY UPLC?BEH C18色譜柱出峰時間更快,所以選擇其作為實驗用色譜柱。
2.2.2 流動相的選擇
參考《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》,分別采用甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-水和乙腈-0.1%甲酸水體系作流動相,比較了目標(biāo)化合物的色譜峰形及分離效果,結(jié)果表明,在三種流動相體系下目標(biāo)化合物均可得到有效分離,且色譜峰形良好。考慮到加入適量酸可以提供質(zhì)譜的離子化效果,使用甲醇可節(jié)約成本,最終選擇甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動相。
設(shè)定色譜流動相流量為0.3 mL/min,按照儀器廠家推薦設(shè)置氣流、源溫、毛細(xì)管電壓等參數(shù)(噴霧壓力:207 kPa;干燥氣壓力:379 kPa;干燥氣溫度:500 ℃;毛細(xì)管電壓:5 500 V),利用三重四極桿質(zhì)譜定量和定性分析,針對每個目標(biāo)物分別進樣進行質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化,主要包括定性和定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量的選擇。從一級質(zhì)譜掃描圖和二級碎裂質(zhì)譜掃描圖可知,達克羅寧在ESⅠ正離子模式下,形成[M+H]準(zhǔn)分子離子峰290.1,主要碎片離子質(zhì)荷比為97.8、70.1;新康唑準(zhǔn)分子離子峰質(zhì)荷比為561.3,主要碎片離子質(zhì)荷比為515.2、489.2。采用儀器優(yōu)化程序?qū)ι鲜鲭x子對的錐孔電壓和碰撞能量值進行優(yōu)化,最終確定達克羅寧錐孔電壓分別為102、70 V,碰撞能量分別為16、60 eV,新康唑錐孔電壓分別為115、115 V,碰撞能量分別為45、42 eV。
經(jīng)過處理的空白化妝品樣品、空白化妝品樣品加標(biāo)對照品,在選定的色譜條件下注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行分析,色譜圖見圖1。
圖1 空白樣品和空白加標(biāo)樣品的UHPLC-MS/MS色譜圖Fig.1 UHPLC-MS/MS chromatograms of blank sample and blank spiked sample
由圖1可見,化妝品基質(zhì)對2種待測物質(zhì)測定無干擾,說明所建方法適用于化妝品中兩種目標(biāo)物的測定。
分別選擇爽膚水、凝膠、潤膚霜、精華油、潤膚乳5種典型的空白化妝品作為基質(zhì),考察基質(zhì)效應(yīng),結(jié)果見表6。由表6數(shù)據(jù)可以看出,達克羅寧和新康唑在化妝品中存在基質(zhì)效應(yīng),低含量時基質(zhì)效應(yīng)影響較小,而高含量時基質(zhì)效應(yīng)顯著,所以采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線作為定量校準(zhǔn)曲線。
表6 空白化妝品樣品中兩種目標(biāo)物基質(zhì)效應(yīng)Tab.6 Measurement results of matrix effects of two compounds to be tested in blank samples
在設(shè)定的分析條件下,測定系列濃度的目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和空白樣品的目標(biāo)物基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,以目標(biāo)物質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo),目標(biāo)物色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo),進行線性回歸(權(quán)重因子1/X),并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線、校準(zhǔn)曲線,線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍分別見表7 和表8。比較發(fā)現(xiàn)校準(zhǔn)曲線線性明顯優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)曲線,故確定用校準(zhǔn)曲線進行定量。
表7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Tab.7 Regression equation, correlation coefficient, and linear range of solution standard curve
表8 校準(zhǔn)曲線的線性方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Tab.8 Regression equation, correlation coefficient, and linear range of blank matrix standard curve
以測定最低濃度點信噪比大于10 來確定方法定量限。結(jié)果顯示,達克羅寧和新康唑溶液濃度為1 ng/mL 時,信噪比分別為1 406.1±5.02,364.1±8.28(n=6),空白樣品加標(biāo)0.1 μg/g 時,信噪比分別為3 313.0±11.25,277.3±8.77(n=6),均大于10??紤]不同儀器、不同色譜柱等因素,該方法中達克羅寧和新康唑的定量限均確定為1 ng/mL,當(dāng)取樣量為0.2 g時,可檢測到的樣品最低質(zhì)量分?jǐn)?shù)均確定為0.1 μg/g;按照3倍檢出限為定量限原則,以上述定量限計算,確定該方法中達克羅寧和新康唑的檢出限均為0.3 ng/mL,當(dāng)取樣量為0.2 g 時,可檢測到的樣品最低質(zhì)量分?jǐn)?shù)均確定為0.03 μg/g。
選擇爽膚水、凝膠、潤膚霜、精華油、潤膚乳5種典型的空白化妝品樣品作為驗證基質(zhì),在方法定量限、兩倍方法定量限和十倍方法定量限進行三水平空白基質(zhì)加標(biāo)試驗,每個水平重復(fù)6次,進行重復(fù)性試驗,結(jié)果見表9。
表9 5種典型基質(zhì)中兩種目標(biāo)物的精密度和準(zhǔn)確度Tab.9 Precision and accuracy assessment for two target substances in 5 typical matrices
根據(jù)化妝品補充檢驗方法管理辦法,被測組分含量在0.01~0.1、0.1~1、1~10 mg/kg時,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為小于等于21%、小于等于15%、小于等于7.5%。被測組分添加水平小于等于0.1、0.1~1、1~100 mg/kg 時回收率范圍分別為60%~120%、80%~110%、90%~110%。由表9 數(shù)據(jù)可知,該方法兩種目標(biāo)物的精密度和準(zhǔn)確度均滿足分析技術(shù)要求。
通過對化妝品中兩種目標(biāo)物樣品前處理方法的選擇,分析條件的優(yōu)化,最終建立了化妝品中達克羅寧和新康唑兩種目標(biāo)物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。該方法分析速度快、靈敏度高、應(yīng)用范圍廣,可以滿足化妝品中達克羅寧和新康唑兩種目標(biāo)物的檢測要求,為化妝品中非法添加的檢測提供技術(shù)支持。