余秀萍,蔡霞,李變變,胡丹
(1.安徽省宿州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心,安徽宿州 234000; 2.泰州市食品檢驗(yàn)院,江蘇泰州 225300)
甜葉菊為菊科甜葉菊屬多年生草本植物,又名甜菊、蜜菊等[1]。葉片富含甜菊糖苷,因其低熱值和高甜度而廣為人知,其甜度為蔗糖的300倍,作為一種天然的甜味劑,被廣泛應(yīng)用于食品、飲料、醫(yī)藥等行業(yè)[2-3]。作為中草藥的甜葉菊,還被用作預(yù)防齲齒、促進(jìn)新陳代謝、降血壓、抗癌的藥用原料,用來(lái)治療食物過(guò)敏、咳嗽、流感等[4-5]。近年來(lái)甜葉菊被廣泛種植,國(guó)內(nèi)主要集中在安徽、山東、浙江、河南、甘肅和新疆等地[6-7]。
在甜葉菊栽培和生長(zhǎng)過(guò)程中,各種元素會(huì)通過(guò)土壤、水、大氣等進(jìn)入藥材中,除了人體必需的微量元素外還有很多對(duì)人體有害的重金屬,過(guò)量攝入重金屬(如Cd、Pb、Hg、Cu 等)會(huì)對(duì)人體肝臟、腎臟、肺等造成危害,引發(fā)各類病變甚至癌癥[8-10],因此,對(duì)甜葉菊進(jìn)行元素分析是十分必要的。目前對(duì)甜葉菊的研究主要集中在種植和其主要成分的分離提取、合成應(yīng)用等方面,對(duì)其元素方面的研究少有報(bào)道。《中華人民共和國(guó)藥典》2020版四部制定了中藥中元素測(cè)定指導(dǎo)原則,明確了首選電感耦合等離子體質(zhì)譜(ⅠCP-MS)法進(jìn)行多元素同時(shí)測(cè)定[11]。ⅠCP-MS 法能同時(shí)測(cè)定多種元素,具有分析速度快、檢測(cè)限低、靈敏度高、線性范圍寬的優(yōu)點(diǎn),適用于微量、痕量元素分析[12-13]。
筆者采用微波消解-電感耦合等離子質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定甜葉菊中25種元素的含量,從元素方面對(duì)甜葉菊進(jìn)行研究,考察甜葉菊中元素的特征,既能為甜葉菊質(zhì)量研究和控制工作提供技術(shù)支持,又能為后期更好地對(duì)甜葉菊的藥用價(jià)值進(jìn)行綜合利用、資源開發(fā)提供參考。
電感耦合等離子體質(zhì)譜儀:iCAP Q 型,美國(guó)賽默飛世爾科技公司。
微波消解儀:MARS6型,美國(guó)CEM公司。
電子天平:BSA124S 型,感量為0.1 mg,德國(guó)賽多利斯儀器有限公司。
25 種元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:含有Al、As、B、Ba、Be、Ca、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Hg、K、Mg、Mn、Mo、Na、Ni、Pb、Sb、Se、Ti、Tl、V、Zn 等25 種元素,各元素質(zhì)量濃度均為100 μg/mL,國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心。
混合內(nèi)標(biāo)溶液:含有Bi、Ca、Ⅰn、Li、SC、Tb和Y,各元素質(zhì)量濃度均為100 μg/mL,國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心。
混合標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧液:編號(hào)為1323770,含有Ba、Bi、Ce、Co、Ⅰn、Li、U 元素,各元素質(zhì)量濃度均為1.0 μg/L,美國(guó)賽默飛世爾科技公司。
硝酸、過(guò)氧化氫:均為優(yōu)級(jí)純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
高純氬氣、高純氦氣:純度(體積分?jǐn)?shù))均為99.999%,宿州雨陽(yáng)氣體有限責(zé)任公司。
甜葉菊樣品:共12 批次,收集場(chǎng)所涉及藥材市場(chǎng)和種植基地,所有樣品均經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)劉守金和楊青山教授鑒定為菊科甜葉菊屬甜葉菊的干燥葉子。
實(shí)驗(yàn)所用玻璃儀器均在20%硝酸溶液中浸泡12 h 后用蒸餾水沖洗干凈,于恒溫干燥箱烘干后冷卻至室溫備用。
實(shí)驗(yàn)用水為屈臣氏蒸餾水。
取25 種元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,精密移取適量,用2%硝酸作為稀釋劑,加入適量混合內(nèi)標(biāo)溶液,制備得到各元素質(zhì)量濃度均分別為0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、500.0 ng/mL 和1.0、5.0、10.0 μg/mL,其中內(nèi)標(biāo)元素質(zhì)量濃度均為1 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
射頻功率:1 500 W;等離子體氣流量:15 L/min;載氣流量:0.8 L/min;采樣深度:8~10 mm;輔助氣流量:0.4 L/min;霧化室溫度:2.0 ℃;測(cè)量模式:碰撞池模式(KED);碰撞氣體積流量:4.0 mL/min;泵轉(zhuǎn)速:40 r/min。
精密稱取甜葉菊樣品粉末約0.5 g (過(guò)3#篩),置于消解罐中,加入5 mL 硝酸、3 mL 過(guò)氧化氫,充分進(jìn)行混合,搖勻,放置12 h。預(yù)消解完成后,放入微波消解儀中消解,消解程序見表1。冷卻后取出,緩慢打開罐蓋,用少量水沖洗內(nèi)蓋,將消解罐放在趕酸器中,緩慢加熱至紅棕色蒸氣揮盡,并繼續(xù)濃縮至2~3 mL,冷卻后轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中,加入0.5 mL混合內(nèi)標(biāo)溶液,用體積分?jǐn)?shù)為2%的硝酸溶液定容,混勻備用,作為樣品溶液。同法制得試劑空白溶液。
表1 微波消解儀工作參數(shù)Tab.1 Operating parameters of microwave digestion instrument
按照1.3儀器工作條件編輯測(cè)定程序,依次測(cè)定空白標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白樣品溶液與樣品溶液,采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量。
分別考察了濕法消解、干灰化法和微波消解3種消解方式對(duì)甜葉菊樣品加標(biāo)回收率的影響,確定樣品的最佳處理方式,扣除本底值后,回收率結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,微波消解法回收率高于濕法消解和干灰化法。由于濕法消解溫度不易控制,對(duì)結(jié)果影響較大;干灰化法消解會(huì)由于馬弗爐溫度高容易造成易揮發(fā)元素的損失,而且由于灰化不完全或者溶解不完全都會(huì)導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果和回收率降低,因此選取微波消解法作為樣品的消解方式。
圖1 不同消解方式對(duì)應(yīng)的甜葉菊樣品中25種元素回收率Fig.1 Recovery of 25 elements in the Stevia rebaudiana Bertoni samples corresponding to the different digestion methods
分別設(shè)定取樣質(zhì)量為0.3、0.5、0.8 g 進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果表明,當(dāng)取樣質(zhì)量為0.3 g 時(shí),平行試驗(yàn)樣品重復(fù)性較差;當(dāng)取樣質(zhì)量為0.8 g時(shí),硝酸需要量較大,加入10 mL硝酸樣品也不能消解完全。由于儀器自身技術(shù)指標(biāo)限制,消解罐內(nèi)溶液總體積應(yīng)不超過(guò)10 mL,因此需加入過(guò)氧化氫以增強(qiáng)氧化性,減少硝酸使用量。通過(guò)試驗(yàn)確定樣品取樣質(zhì)量為0.5 g,消解體系為5 mL 硝酸和3 mL 過(guò)氧化氫,這種組合消解更完全,溶液更澄清,更有利于藥材質(zhì)量的控制。
由于As 和Hg 元素為易揮發(fā)元素,為避免趕酸溫度過(guò)高導(dǎo)致?lián)p失,試驗(yàn)過(guò)程中要對(duì)趕酸溫度進(jìn)行控制[14-15]。分別設(shè)定趕酸溫度為100、120、130、150、160 ℃進(jìn)行試驗(yàn),各種元素回收率如圖2 所示。結(jié)果表明,趕酸溫度較低時(shí),趕酸時(shí)間比較長(zhǎng),如趕酸溫度設(shè)定為100 ℃時(shí),濃縮至實(shí)驗(yàn)要求的2~3 mL,至少需要7 h;而趕酸溫度為150 ℃時(shí),Hg元素測(cè)定結(jié)果差別較大,不太穩(wěn)定,回收率明顯偏低;趕酸溫度為160 ℃時(shí),As元素回收率開始變低。趕酸溫度不超過(guò)130 ℃時(shí),加熱至無(wú)棕黃色煙霧揮出時(shí),As和Hg元素的損失較小,回收率比較理想。為了節(jié)省趕酸時(shí)間,趕酸溫度宜控制在120~130 ℃。
圖2 不同趕酸溫度條件下的元素回收率Fig.2 Recovery of elements at different deacidification temperatures
儀器進(jìn)樣時(shí)的酸度環(huán)境對(duì)測(cè)定結(jié)果也有一定影響,分別用體積分?jǐn)?shù)為0%(純水)、1%、2%、3%、5%的硝酸溶液為稀釋劑配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(各元素質(zhì)量濃度均為50.0 ng/mL),將標(biāo)準(zhǔn)溶液依次在儀器最佳條件下進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算各元素的回收率,結(jié)果見圖3。由圖3可見,當(dāng)硝酸溶液體積分?jǐn)?shù)大于2%時(shí),標(biāo)準(zhǔn)回收率趨于最大且穩(wěn)定,同時(shí)為了避免酸度過(guò)大對(duì)儀器造成的損壞和浪費(fèi),滿足實(shí)驗(yàn)要求和節(jié)約成本,選擇在2%的硝酸體系中進(jìn)行測(cè)定。
圖3 不同酸進(jìn)樣體積對(duì)應(yīng)的各元素回收率Fig.3 Recovery of each element corresponding to the different acid injection volumes
ⅠCP-MS 分析法測(cè)定過(guò)程中會(huì)存在基體干擾、記憶效應(yīng)干擾、物理干擾、質(zhì)譜干擾等[16-17]?;w干擾主要是儀器的空間電荷效應(yīng)和在采樣錐與截取錐之間的物理變化導(dǎo)致的,可通過(guò)內(nèi)標(biāo)校正、控制樣品鹽分、延長(zhǎng)樣品沖洗時(shí)間、清洗錐體和稀釋樣品消除。記憶效應(yīng)是由于上一個(gè)樣品在進(jìn)樣系統(tǒng)內(nèi)壁上過(guò)量分析物揮發(fā)引起的,可采用2%的硝酸溶液沖洗加以消除。物理干擾可通過(guò)多次清洗霧化室、進(jìn)樣錐及進(jìn)樣管路消除,同時(shí)增加測(cè)樣時(shí)管路沖洗時(shí)間。質(zhì)譜干擾可通過(guò)選擇合適的同位素離子及儀器校正消除,如測(cè)定鎘時(shí),選擇111Cd和114Cd進(jìn)行試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)111Cd 干擾少,測(cè)定值更加準(zhǔn)確,最終確定111Cd為鎘測(cè)定同位素,同時(shí)加入內(nèi)標(biāo)校正儀器漂移及碰撞反應(yīng)池技術(shù)(KED)消除干擾。各目標(biāo)元素測(cè)定同位素及內(nèi)標(biāo)溶液的選擇見表2。
表2 各元素同位素及內(nèi)標(biāo)元素Tab.2 Each element isotope and internal standard element
將系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入電感耦合等離子體質(zhì)譜儀中,按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定目標(biāo)元素的強(qiáng)度信號(hào)值,以目標(biāo)元素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、強(qiáng)度信號(hào)值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計(jì)算得到線性方程和相關(guān)系數(shù)(r)。
測(cè)定11次試劑空白溶液,計(jì)算響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差,以3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算方法檢出限[18]。
25種元素線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限見表3。結(jié)果表明,25 種元素的標(biāo)準(zhǔn)溶液在測(cè)定范圍內(nèi)均具有良好的線性,相關(guān)系數(shù)均在0.999 以上,表明線性關(guān)系良好,25 種元素的方法檢出限為0.000 1~0.5 mg/kg。
表3 各元素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Tab.3 Linear range,linear equation,correlation coefficient and detection limit of each element
由于各元素含量間差異較大,回收率采用分組測(cè)定,Hg和Tl未檢出,以檢出限為參考,其余元素按含量大小和標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍分為8組(Be、Sb為一組,加入5 ng;Co、As、Se為一組,加入50 ng;V、Cd、Pb為一組,加入200 ng;Na、Cr、Ni、Cu、Mo 為一組,加入2.0 μg;B、Zn、Ba、Ti為一組,加入5.0 μg;Al、Mn、Fe為一組,加入50.0 μg;Mg為一組,加入500 μg;K、Ca為一組,加入1 500 μg),分別試驗(yàn)并計(jì)算回收率。取已知含量的甜葉菊樣品6份,每份約0.25 g,精密稱定,分別加入和樣品中各元素含量相近的標(biāo)準(zhǔn)元素溶液,按該方法進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算各元素的回收率,結(jié)果見表4。由表4可知,25種元素的平均樣品加標(biāo)回收率為92.4%~102.4%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.09%~4.11%,均小于5%,表明該方法準(zhǔn)確度和精密度均較高。
利用電感耦合等離子體質(zhì)譜法對(duì)甜葉菊中25種元素進(jìn)行定量分析,該方法精密度和準(zhǔn)確度良好,線性范圍寬,靈敏度高,可為后期更好地對(duì)甜葉菊的藥用價(jià)值進(jìn)行綜合利用、資源開發(fā)提供參考。