余秀萍，蔡霞，李變變，胡丹

（1.安徽省宿州市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，安徽宿州 234000； 2.泰州市食品檢驗(yàn)院，江蘇泰州 225300）

甜葉菊為菊科甜葉菊屬多年生草本植物，又名甜菊、蜜菊等[1]。葉片富含甜菊糖苷，因其低熱值和高甜度而廣為人知，其甜度為蔗糖的300倍，作為一種天然的甜味劑，被廣泛應(yīng)用于食品、飲料、醫(yī)藥等行業(yè)[2-3]。作為中草藥的甜葉菊，還被用作預(yù)防齲齒、促進(jìn)新陳代謝、降血壓、抗癌的藥用原料，用來治療食物過敏、咳嗽、流感等[4-5]。近年來甜葉菊被廣泛種植，國內(nèi)主要集中在安徽、山東、浙江、河南、甘肅和新疆等地[6-7]。

在甜葉菊栽培和生長過程中，各種元素會通過土壤、水、大氣等進(jìn)入藥材中，除了人體必需的微量元素外還有很多對人體有害的重金屬，過量攝入重金屬(如Cd、Pb、Hg、Cu 等)會對人體肝臟、腎臟、肺等造成危害，引發(fā)各類病變甚至癌癥[8-10]，因此，對甜葉菊進(jìn)行元素分析是十分必要的。目前對甜葉菊的研究主要集中在種植和其主要成分的分離提取、合成應(yīng)用等方面，對其元素方面的研究少有報(bào)道?！吨腥A人民共和國藥典》2020版四部制定了中藥中元素測定指導(dǎo)原則，明確了首選電感耦合等離子體質(zhì)譜(ⅠCP-MS)法進(jìn)行多元素同時(shí)測定[11]。ⅠCP-MS 法能同時(shí)測定多種元素，具有分析速度快、檢測限低、靈敏度高、線性范圍寬的優(yōu)點(diǎn)，適用于微量、痕量元素分析[12-13]。

筆者采用微波消解-電感耦合等離子質(zhì)譜法同時(shí)測定甜葉菊中25種元素的含量，從元素方面對甜葉菊進(jìn)行研究，考察甜葉菊中元素的特征，既能為甜葉菊質(zhì)量研究和控制工作提供技術(shù)支持，又能為后期更好地對甜葉菊的藥用價(jià)值進(jìn)行綜合利用、資源開發(fā)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：iCAP Q 型，美國賽默飛世爾科技公司。

微波消解儀：MARS6型，美國CEM公司。

電子天平：BSA124S 型，感量為0.1 mg，德國賽多利斯儀器有限公司。

25 種元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：含有Al、As、B、Ba、Be、Ca、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Hg、K、Mg、Mn、Mo、Na、Ni、Pb、Sb、Se、Ti、Tl、V、Zn 等25 種元素，各元素質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，國家有色金屬及電子材料分析測試中心。

混合內(nèi)標(biāo)溶液：含有Bi、Ca、Ⅰn、Li、SC、Tb和Y，各元素質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，國家有色金屬及電子材料分析測試中心。

混合標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧液：編號為1323770，含有Ba、Bi、Ce、Co、Ⅰn、Li、U 元素，各元素質(zhì)量濃度均為1.0 μg/L，美國賽默飛世爾科技公司。

硝酸、過氧化氫：均為優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

高純氬氣、高純氦氣：純度(體積分?jǐn)?shù))均為99.999%，宿州雨陽氣體有限責(zé)任公司。

甜葉菊樣品：共12 批次，收集場所涉及藥材市場和種植基地，所有樣品均經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)劉守金和楊青山教授鑒定為菊科甜葉菊屬甜葉菊的干燥葉子。

實(shí)驗(yàn)所用玻璃儀器均在20%硝酸溶液中浸泡12 h 后用蒸餾水沖洗干凈，于恒溫干燥箱烘干后冷卻至室溫備用。

實(shí)驗(yàn)用水為屈臣氏蒸餾水。

1.2 系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備

取25 種元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密移取適量，用2%硝酸作為稀釋劑，加入適量混合內(nèi)標(biāo)溶液，制備得到各元素質(zhì)量濃度均分別為0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、500.0 ng/mL 和1.0、5.0、10.0 μg/mL，其中內(nèi)標(biāo)元素質(zhì)量濃度均為1 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 儀器工作條件

射頻功率：1 500 W；等離子體氣流量：15 L/min；載氣流量：0.8 L/min；采樣深度：8～10 mm；輔助氣流量：0.4 L/min；霧化室溫度：2.0 ℃；測量模式：碰撞池模式(KED)；碰撞氣體積流量：4.0 mL/min；泵轉(zhuǎn)速：40 r/min。

1.4 樣品處理

精密稱取甜葉菊樣品粉末約0.5 g (過3#篩)，置于消解罐中，加入5 mL 硝酸、3 mL 過氧化氫，充分進(jìn)行混合，搖勻，放置12 h。預(yù)消解完成后，放入微波消解儀中消解，消解程序見表1。冷卻后取出，緩慢打開罐蓋，用少量水沖洗內(nèi)蓋，將消解罐放在趕酸器中，緩慢加熱至紅棕色蒸氣揮盡，并繼續(xù)濃縮至2～3 mL，冷卻后轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，加入0.5 mL混合內(nèi)標(biāo)溶液，用體積分?jǐn)?shù)為2%的硝酸溶液定容，混勻備用，作為樣品溶液。同法制得試劑空白溶液。

表1 微波消解儀工作參數(shù)Tab.1 Operating parameters of microwave digestion instrument

1.5 樣品測定

按照1.3儀器工作條件編輯測定程序，依次測定空白標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白樣品溶液與樣品溶液，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理方法的選擇

分別考察了濕法消解、干灰化法和微波消解3種消解方式對甜葉菊樣品加標(biāo)回收率的影響，確定樣品的最佳處理方式，扣除本底值后，回收率結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，微波消解法回收率高于濕法消解和干灰化法。由于濕法消解溫度不易控制，對結(jié)果影響較大；干灰化法消解會由于馬弗爐溫度高容易造成易揮發(fā)元素的損失，而且由于灰化不完全或者溶解不完全都會導(dǎo)致測定結(jié)果和回收率降低，因此選取微波消解法作為樣品的消解方式。

圖1 不同消解方式對應(yīng)的甜葉菊樣品中25種元素回收率Fig.1 Recovery of 25 elements in the Stevia rebaudiana Bertoni samples corresponding to the different digestion methods

2.2 取樣量與消解溶液的選擇

分別設(shè)定取樣質(zhì)量為0.3、0.5、0.8 g 進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，當(dāng)取樣質(zhì)量為0.3 g 時(shí)，平行試驗(yàn)樣品重復(fù)性較差；當(dāng)取樣質(zhì)量為0.8 g時(shí)，硝酸需要量較大，加入10 mL硝酸樣品也不能消解完全。由于儀器自身技術(shù)指標(biāo)限制，消解罐內(nèi)溶液總體積應(yīng)不超過10 mL，因此需加入過氧化氫以增強(qiáng)氧化性，減少硝酸使用量。通過試驗(yàn)確定樣品取樣質(zhì)量為0.5 g，消解體系為5 mL 硝酸和3 mL 過氧化氫，這種組合消解更完全，溶液更澄清，更有利于藥材質(zhì)量的控制。

2.3 趕酸溫度的選擇

由于As 和Hg 元素為易揮發(fā)元素，為避免趕酸溫度過高導(dǎo)致?lián)p失，試驗(yàn)過程中要對趕酸溫度進(jìn)行控制[14-15]。分別設(shè)定趕酸溫度為100、120、130、150、160 ℃進(jìn)行試驗(yàn)，各種元素回收率如圖2 所示。結(jié)果表明，趕酸溫度較低時(shí)，趕酸時(shí)間比較長，如趕酸溫度設(shè)定為100 ℃時(shí)，濃縮至實(shí)驗(yàn)要求的2～3 mL，至少需要7 h；而趕酸溫度為150 ℃時(shí)，Hg元素測定結(jié)果差別較大，不太穩(wěn)定，回收率明顯偏低；趕酸溫度為160 ℃時(shí)，As元素回收率開始變低。趕酸溫度不超過130 ℃時(shí)，加熱至無棕黃色煙霧揮出時(shí)，As和Hg元素的損失較小，回收率比較理想。為了節(jié)省趕酸時(shí)間，趕酸溫度宜控制在120～130 ℃。

圖2 不同趕酸溫度條件下的元素回收率Fig.2 Recovery of elements at different deacidification temperatures

2.4 進(jìn)樣酸度條件的優(yōu)化

儀器進(jìn)樣時(shí)的酸度環(huán)境對測定結(jié)果也有一定影響，分別用體積分?jǐn)?shù)為0%(純水)、1%、2%、3%、5%的硝酸溶液為稀釋劑配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(各元素質(zhì)量濃度均為50.0 ng/mL)，將標(biāo)準(zhǔn)溶液依次在儀器最佳條件下進(jìn)行測定，計(jì)算各元素的回收率，結(jié)果見圖3。由圖3可見，當(dāng)硝酸溶液體積分?jǐn)?shù)大于2%時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)回收率趨于最大且穩(wěn)定，同時(shí)為了避免酸度過大對儀器造成的損壞和浪費(fèi)，滿足實(shí)驗(yàn)要求和節(jié)約成本，選擇在2%的硝酸體系中進(jìn)行測定。

圖3 不同酸進(jìn)樣體積對應(yīng)的各元素回收率Fig.3 Recovery of each element corresponding to the different acid injection volumes

2.5 干擾消除

ⅠCP-MS 分析法測定過程中會存在基體干擾、記憶效應(yīng)干擾、物理干擾、質(zhì)譜干擾等[16-17]。基體干擾主要是儀器的空間電荷效應(yīng)和在采樣錐與截取錐之間的物理變化導(dǎo)致的，可通過內(nèi)標(biāo)校正、控制樣品鹽分、延長樣品沖洗時(shí)間、清洗錐體和稀釋樣品消除。記憶效應(yīng)是由于上一個(gè)樣品在進(jìn)樣系統(tǒng)內(nèi)壁上過量分析物揮發(fā)引起的，可采用2%的硝酸溶液沖洗加以消除。物理干擾可通過多次清洗霧化室、進(jìn)樣錐及進(jìn)樣管路消除，同時(shí)增加測樣時(shí)管路沖洗時(shí)間。質(zhì)譜干擾可通過選擇合適的同位素離子及儀器校正消除，如測定鎘時(shí)，選擇111Cd和114Cd進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)111Cd 干擾少，測定值更加準(zhǔn)確，最終確定111Cd為鎘測定同位素，同時(shí)加入內(nèi)標(biāo)校正儀器漂移及碰撞反應(yīng)池技術(shù)(KED)消除干擾。各目標(biāo)元素測定同位素及內(nèi)標(biāo)溶液的選擇見表2。

表2 各元素同位素及內(nèi)標(biāo)元素Tab.2 Each element isotope and internal standard element

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線與方法檢出限

將系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入電感耦合等離子體質(zhì)譜儀中，按實(shí)驗(yàn)方法測定目標(biāo)元素的強(qiáng)度信號值，以目標(biāo)元素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、強(qiáng)度信號值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算得到線性方程和相關(guān)系數(shù)(r)。

測定11次試劑空白溶液，計(jì)算響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，以3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算方法檢出限[18]。

25種元素線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限見表3。結(jié)果表明，25 種元素的標(biāo)準(zhǔn)溶液在測定范圍內(nèi)均具有良好的線性，相關(guān)系數(shù)均在0.999 以上，表明線性關(guān)系良好，25 種元素的方法檢出限為0.000 1～0.5 mg/kg。

表3 各元素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Tab.3 Linear range，linear equation，correlation coefficient and detection limit of each element

2.7 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)

由于各元素含量間差異較大，回收率采用分組測定，Hg和Tl未檢出，以檢出限為參考，其余元素按含量大小和標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍分為8組(Be、Sb為一組，加入5 ng；Co、As、Se為一組，加入50 ng；V、Cd、Pb為一組，加入200 ng；Na、Cr、Ni、Cu、Mo 為一組，加入2.0 μg；B、Zn、Ba、Ti為一組，加入5.0 μg；Al、Mn、Fe為一組，加入50.0 μg；Mg為一組，加入500 μg；K、Ca為一組，加入1 500 μg)，分別試驗(yàn)并計(jì)算回收率。取已知含量的甜葉菊樣品6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別加入和樣品中各元素含量相近的標(biāo)準(zhǔn)元素溶液，按該方法進(jìn)樣測定，計(jì)算各元素的回收率，結(jié)果見表4。由表4可知，25種元素的平均樣品加標(biāo)回收率為92.4%～102.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.09%～4.11%，均小于5%，表明該方法準(zhǔn)確度和精密度均較高。

3 結(jié)語

利用電感耦合等離子體質(zhì)譜法對甜葉菊中25種元素進(jìn)行定量分析，該方法精密度和準(zhǔn)確度良好，線性范圍寬，靈敏度高，可為后期更好地對甜葉菊的藥用價(jià)值進(jìn)行綜合利用、資源開發(fā)提供參考。