蔣磊，李碩，徐昊晟

（上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院，上海 201203）

光譜光度測(cè)量?jī)x器是一種使用頻繁、覆蓋面廣的分析儀器，尤其是紫外可見分光光度計(jì)，廣泛應(yīng)用于制藥、醫(yī)療、食品、環(huán)保等行業(yè)的檢測(cè)領(lǐng)域。能否準(zhǔn)確評(píng)價(jià)光譜光度測(cè)量?jī)x器的性能，直接決定檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，其中波長(zhǎng)是非常重要的指標(biāo)之一[1]。

紫外可見光區(qū)的波長(zhǎng)通常需要結(jié)合氧化鈥濾光片(峰值波長(zhǎng)范圍為200 nm～600 nm)和鐠釹濾光片(峰值波長(zhǎng)范圍為700 nm～900 nm)作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)共同使用才能進(jìn)行校準(zhǔn)[2-6]。但由于濾光片是通過熔融玻璃摻入稀土元素制成，均勻性相對(duì)難以控制，峰形較差，不確定度較大，校準(zhǔn)效果不夠理想[7]。氧化鈥及鐠釹濾光片的吸收譜圖如圖1和圖2所示。

圖1 氧化鈥濾光片紫外可見區(qū)吸收譜圖Fig.1 Absorption spectrum of holmium oxide filter in ultravioletvisible region

圖2 鐠釹濾光片紫外可見區(qū)吸收譜圖Fig.2 Absorption spectrum of praseodymium-neodymium filter in ultraviolet-visible region

另外，目前濾光片波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的數(shù)據(jù)間隔是0.1 nm，可以滿足常規(guī)計(jì)量測(cè)試，但無法滿足更高水準(zhǔn)的光譜光度測(cè)量?jī)x器的計(jì)量需求。隨著科技水平的不斷提高，高端光譜儀器的分辨力已經(jīng)可以達(dá)到小數(shù)點(diǎn)后兩位。

三價(jià)稀土氧化物有以下特點(diǎn)：(1)能溶于稀酸，稀酸水溶液在紫外可見區(qū)無吸收；(2)三價(jià)稀土離子處于內(nèi)層的4f電子受到5s和5p電子的屏蔽，受環(huán)境影響較?。?3)自由離子的光譜是類原子的線性光譜，譜帶尖銳。筆者利用稀土元素以上特點(diǎn)，通過配制不同稀土元素組成、不同濃度的溶液，篩選出峰形尖銳、在230～900 nm范圍內(nèi)波長(zhǎng)分布均勻、最大吸光度不超過2 的候選物作為最終目標(biāo)樣品，研制了波長(zhǎng)校準(zhǔn)用溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以滿足國(guó)內(nèi)外各類光譜光度測(cè)量?jī)x器的計(jì)量需求，包括出廠檢驗(yàn)、質(zhì)量控制等需求，確保結(jié)果在國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室測(cè)量的可靠性、可比性和溯源性[8]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

紫外可見近紅外分光光度計(jì)：Cary6000i 型，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

電子天平：XS205型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司。

特制石英比色皿：光程為1 cm，材質(zhì)為JGS2 光學(xué)石英玻璃。

醫(yī)用注射器：10 mL，江蘇治宇醫(yī)療器材有限責(zé)任公司。

高氯酸：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

氧化鈥：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))不小于99.99%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

氧化釹：光譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

氧化鈥溶液波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：SRM2034，美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院。

Milli-Q超純水制備系統(tǒng)：美國(guó)密理博公司。

數(shù)字溫濕度計(jì)、單標(biāo)線容量瓶、單標(biāo)線吸管等玻璃量器。

所有儀器和玻璃量器均經(jīng)過計(jì)量技術(shù)機(jī)構(gòu)檢定或校準(zhǔn)。

實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水制備系統(tǒng)制備。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫外可見區(qū)波長(zhǎng)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的篩選

對(duì)不同稀土元素溶解于高氯酸后的溶液進(jìn)行紫外可見區(qū)波長(zhǎng)掃描，結(jié)果見圖3。

圖3 不同稀土元素溶液的紫外可見區(qū)吸收譜圖Fig.3 Absorption spectrum of different rare earth elements solution in ultraviolet-visible region

根據(jù)光譜圖，從溶液中選取吸收光波長(zhǎng)能夠均勻覆蓋200～900 nm 波長(zhǎng)的氧化鈥、氧化釹的高氯酸溶液作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物。此外，氧化鈰溶液在200～250 nm的遠(yuǎn)紫外區(qū)表現(xiàn)出良好的吸收特性。

1.2.2 紫外可見區(qū)波長(zhǎng)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的制備

準(zhǔn)確稱量40.0 g氧化鈥和12.0 g氧化釹，溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的高氯酸溶液中，用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢杌靹?，完全溶解后定容? L，得到所述紫外可見區(qū)波長(zhǎng)校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[9]。

1.2.3 紫外可見區(qū)波長(zhǎng)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的封裝

設(shè)計(jì)一種特殊進(jìn)樣口的石英比色皿，將波長(zhǎng)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)通過進(jìn)樣針打入特制比色皿后，熔融進(jìn)樣口處的石英來進(jìn)行永久密封。密封后的紫外可見波長(zhǎng)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)成品見圖4。

圖4 密封后的紫外可見波長(zhǎng)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)成品Fig.4 Sealed ultraviolet-visible wavelength standard solution product

1.2.4 紫外可見區(qū)波長(zhǎng)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的波長(zhǎng)掃描

掃描參數(shù)設(shè)定參照J(rèn)JG 178—2007《紫外、可見、近紅外分光光度計(jì)檢定規(guī)程》。波長(zhǎng)掃描范圍選擇200～900 nm，光譜帶寬為2 nm，慢速掃描，掃描速率為40 nm/min，采樣間隔為0.1 nm，采用吸光度測(cè)量方式，使用空氣作空白進(jìn)行儀器的基線校正，將紫外可見波長(zhǎng)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)垂直置于樣品光路中，連續(xù)掃描3 次，分別檢出吸光度峰值波長(zhǎng)。掃描圖譜見圖5。

圖5 紫外可見波長(zhǎng)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)吸收譜圖Fig.5 Absorption spectrum of ultraviolet-visible wavelength standard solution

由圖5 可以看出，吸收峰形遠(yuǎn)優(yōu)于濾光片的吸收譜圖(圖1 和圖2)，且測(cè)試范圍更廣，滿足JJG 178—2007中對(duì)于波長(zhǎng)檢定，每間隔100 nm至少選擇一個(gè)波長(zhǎng)檢定點(diǎn)的要求。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外可見區(qū)波長(zhǎng)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值方法

常規(guī)波長(zhǎng)峰值的檢出是選取吸光度測(cè)試點(diǎn)的局部最大值對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)。為了滿足高端光譜儀器對(duì)于分析精度的要求，采用0.01 nm采樣間隔，以241 nm處波長(zhǎng)為例，發(fā)現(xiàn)當(dāng)掃描間隔太小時(shí)，峰頂處點(diǎn)與點(diǎn)之間的縱坐標(biāo)過于接近，峰值檢出的效果會(huì)受到儀器基線誤差的影響，如圖6。另外，采用0.01 nm 采樣間隔進(jìn)行紫外可見區(qū)全波段掃描，用時(shí)是0.1 nm采樣間隔的10 倍，不僅效率大幅降低，還會(huì)更容易受到儀器穩(wěn)定性的影響。

圖6 采樣間隔0.01 nm，紫外可見波長(zhǎng)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)241 nm處吸收譜圖Fig.6 Absorption spectrum of ultraviolet-visible wavelength standard solution at 241 nm with sampling interval of 0.01 nm

筆者在對(duì)比了三次函數(shù)擬合和三次樣條插值后，選擇采用三次樣條插值為峰值波長(zhǎng)定值[10-11]，得到多一位有效位數(shù)的量值，解決了掃描間隔對(duì)定值準(zhǔn)確性限制的問題。當(dāng)采用最小二乘法中最泛用的Levenberg-Marquardt 算法進(jìn)行3 次多項(xiàng)式擬合時(shí)，發(fā)現(xiàn)并非所有吸收峰的形狀符合三次函數(shù)，部分吸收峰擬合結(jié)果的相關(guān)系數(shù)差強(qiáng)人意。因此，在未知函數(shù)表達(dá)式的情況下，用三次樣條插值能夠經(jīng)過所有已知點(diǎn)，且該點(diǎn)的前后函數(shù)為連續(xù)函數(shù)，更為安全和合理。

如圖7 所示，以0.1 nm 掃描下頂點(diǎn)的左右各2個(gè)點(diǎn)，共5個(gè)點(diǎn)進(jìn)行三次樣條插值，考慮到需要0.01 nm的間隔，插值數(shù)量定為80，并以此方法對(duì)全波長(zhǎng)范圍內(nèi)的波峰進(jìn)行定值[12]。

圖7 采樣間隔0.1 nm，紫外可見波長(zhǎng)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)241 nm處吸收譜圖的數(shù)據(jù)插值Fig.7 Ⅰnterpolation of absorption spectrum data of ultraviolet-visible wavelength standard solution at 241 nm with sampling interval of 0.1 nm

另外，865 nm處吸收峰的重復(fù)性和復(fù)現(xiàn)性遠(yuǎn)差于其他吸收峰，插值結(jié)果異常，因此將其舍去。

經(jīng)過一段時(shí)間的觀察，不同的光譜帶寬對(duì)于均勻性、穩(wěn)定性幾乎沒有影響，因此在計(jì)算不確定度時(shí)，均采用光譜帶寬為2 nm下的數(shù)據(jù)。

2.2 均勻性檢驗(yàn)

2.2.1 瓶?jī)?nèi)均勻性

由于不同廠家型號(hào)的儀器甚至是相同廠家不同型號(hào)的儀器入射比色皿的位置都會(huì)有所不同，因此單支比色皿的均勻性也會(huì)引入不確定度，需要通過比色皿不同位置的均勻性進(jìn)行考察。

隨機(jī)抽取4 瓶紫外可見波長(zhǎng)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，通過調(diào)節(jié)紫外可見分光光度計(jì)樣品槽的深度，對(duì)樣品3 個(gè)不同深度位置進(jìn)行掃描，每個(gè)位置掃描3 次，記錄峰值波長(zhǎng)值。采用方差分析法對(duì)該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)，結(jié)果表明，在95%置信水平下，F(xiàn)值均小于F0.05(11，24)，可認(rèn)為數(shù)據(jù)組間無明顯差異，表明該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)瓶?jī)?nèi)是均勻的。

2.2.2 瓶間均勻性

隨機(jī)抽取11 瓶紫外可見波長(zhǎng)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品，對(duì)每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，記錄峰值波長(zhǎng)值。采用方差分析法對(duì)該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)，結(jié)果表明，95%置信水平下F值均小于F0.05(10，22)，認(rèn)為數(shù)據(jù)組間無明顯差異，表明該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)瓶間是均勻的。

2.3 穩(wěn)定性考察結(jié)果

保持樣品穩(wěn)定性的措施必須貫穿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的全過程。由于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在使用過程中不可避免要涉及到運(yùn)輸?shù)纫蛩兀虼藢?duì)該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別進(jìn)行了運(yùn)輸穩(wěn)定性和長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察。

2.3.1 運(yùn)輸穩(wěn)定性考察

運(yùn)輸穩(wěn)定性考察采用同步穩(wěn)定性研究，所有穩(wěn)定性研究的測(cè)量在重復(fù)性條件下進(jìn)行，即僅進(jìn)行一輪校準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)?zāi)M樣品在運(yùn)輸中可能遇到的條件。潛在動(dòng)力學(xué)機(jī)理未知的情況下，采用經(jīng)典線性模型。將制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)取6 瓶，分別于50 和4 ℃下保存0、1、3、5、7、14 天后取出，同時(shí)進(jìn)行測(cè)試，考察運(yùn)輸穩(wěn)定性，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次。對(duì)運(yùn)輸穩(wěn)定性考察結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，在95%置信水平上，斜率不顯著，沒有觀察到不穩(wěn)定性。表明該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在運(yùn)輸條件下14天內(nèi)是穩(wěn)定的，滿足實(shí)際運(yùn)輸要求。

2.3.2 長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察

長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察采用經(jīng)典穩(wěn)定性研究，即同時(shí)制備的樣品在相同條件下隨著時(shí)間的推移進(jìn)行測(cè)量。分別在樣品制備完成后當(dāng)天和1、2、3、4、5、8、12 個(gè)月對(duì)制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)隨機(jī)抽取1 瓶，每次重復(fù)測(cè)定3 次，樣品在室溫下存放，進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察。同樣對(duì)長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，在95%置信水平上，斜率不顯著，沒有觀察到不穩(wěn)定性。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在室溫條件(25 ℃)下保存，可以判定在12個(gè)月內(nèi)是穩(wěn)定的。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室將持續(xù)監(jiān)測(cè)該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值及不確定度評(píng)定

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值

按照ⅠSO導(dǎo)則35《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法》的要求，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采用多家實(shí)驗(yàn)室合作定值的方法。參加定值單位包括中科院上海微系統(tǒng)所、中科院上海光機(jī)所、中科院上海硅酸鹽所、東華大學(xué)等9 家具有高精度紫外可見分光光度計(jì)的機(jī)構(gòu)。定值儀器選用與NⅠST 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM 2034 國(guó)際比對(duì)相同品牌的儀器的最高端型號(hào)[12]，包括 安 捷 倫 的Cary5000、Cary6000i、PE 的lambda 1050 Plus、日立的UH4150、島津UV3600i Plus。定值儀器采用NⅠST標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM 2034 進(jìn)行驗(yàn)證，定值儀器的波長(zhǎng)示值誤差小于0.1 nm。數(shù)據(jù)結(jié)果為2 nm 光譜帶寬下，以0.1 nm 掃描間隔掃描，并通過對(duì)峰值波長(zhǎng)附近的5 個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)做三次樣條插值，插值數(shù)量為80，得到插值后的數(shù)據(jù)結(jié)果。平行測(cè)定9次，進(jìn)行定值分析。檢測(cè)結(jié)果經(jīng)過柯克倫檢驗(yàn)(等精度檢驗(yàn))和格拉布斯檢驗(yàn)(可疑值檢驗(yàn))，所有單元的數(shù)據(jù)均可保留并參與最終定值，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的平均值和總平均值見表1。

表1 紫外可見波長(zhǎng)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰值波長(zhǎng)9家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值數(shù)據(jù)結(jié)果Tab.1 Joint determination results of wavelength standard solutions in the ultraviolet-visible regions by 9 laboratories

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度評(píng)定

紫外可見分光光度計(jì)波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰值波長(zhǎng)的不確定度來源由4 部分組成：比色皿不同位置均勻性引入的不確定度、瓶間均勻性引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值過程帶來的不確定度，包括測(cè)量過程引入的不確定度和測(cè)量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)引入的不確定度[13-14]。將合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子k=2，得到擴(kuò)展不確定度。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

表2 紫外可見波長(zhǎng)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰值波長(zhǎng)的定值及不確定度Tab.2 List of wavelengths and uncertainties of wavelength standard solutions in the ultraviolet-visible regions

3 結(jié)語(yǔ)

采用高精度紫外可見近紅外分光光度計(jì)，經(jīng)多家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值，結(jié)果量值可靠，研制的紫外可見波長(zhǎng)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)準(zhǔn)確性、均勻性和穩(wěn)定性良好。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在多家光譜光度測(cè)量?jī)x器生產(chǎn)單位和使用單位使用過程中，檢測(cè)得到的結(jié)果重復(fù)性、穩(wěn)定性好，可以滿足國(guó)內(nèi)外光譜光度測(cè)量?jī)x器的出廠檢驗(yàn)及質(zhì)量控制的要求。除此之外，發(fā)現(xiàn)氧化鈰溶液在遠(yuǎn)紫外區(qū)表現(xiàn)出了良好的吸收特性，未來可進(jìn)一步通過研究，擴(kuò)展紫外可見區(qū)的波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。