黃燕 李鈺娜 宋麗華 牛曉紅 冀菁荃 李卿

1.長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部生化教研室,山西 長(zhǎng)治 046000

2.運(yùn)城護(hù)理職業(yè)學(xué)院,山西 運(yùn)城 044000

3.長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院內(nèi)分泌科,山西 長(zhǎng)治 046000

4.長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部病生教研室,山西 長(zhǎng)治 046000

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是由于自然絕經(jīng)或卵巢切除導(dǎo)致體內(nèi)雌激素水平下降,鈣吸收不良,骨質(zhì)流失[1-2]等全身代謝性骨病,超過(guò)30%的女性絕經(jīng)后患有由骨質(zhì)疏松引起的全身性骨痛和骨微結(jié)構(gòu)改變。目前治療PMOP的方法很多,經(jīng)典的治療方法是雌激素替代療法(estrogen replacement therapy,ERT)。雌激素通過(guò)刺激成骨細(xì)胞分泌胰島素樣生長(zhǎng)因子、骨保護(hù)素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子,抑制破骨細(xì)胞成熟,刺激成骨細(xì)胞分化[3],其療效肯定,但長(zhǎng)期應(yīng)用有增加冠心病、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn),尤其是對(duì)雌激素敏感的乳腺癌患者及乳腺癌高風(fēng)險(xiǎn)人群[4]。因此,尋找更為理想的化合物輔助治療PMOP成為目前研究的熱點(diǎn)。

白藜蘆醇(resveratrol,RSV)是一種相對(duì)分子質(zhì)量為228的天然植物雌激素,存在于多種水果、蔬菜和中藥中。RSV可調(diào)節(jié)骨細(xì)胞代謝和骨轉(zhuǎn)換[5],能有效降低機(jī)體老化和絕經(jīng)后雌激素缺乏引起的骨質(zhì)疏松[6]。RSV通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化和抑制破骨細(xì)胞生成,如通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[7];通過(guò)活化SIRT-1/FoxO1通路促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化[8];通過(guò)促進(jìn)自噬誘導(dǎo)小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1的增殖和分化[9],0.1～10 μmol/L濃度范圍的RSV通過(guò)抑制自噬來(lái)抑制破骨細(xì)胞的分化[10];RSV以40 mg/(kg·d)、80 mg/(kg·d)灌胃10周可通過(guò)提高骨密度和改善骨微結(jié)構(gòu)來(lái)防止卵巢切除術(shù)引起的骨質(zhì)量惡化[11]。盡管RSV對(duì)骨質(zhì)疏松癥影響的數(shù)據(jù)不斷積累,但對(duì)于腹腔注射白藜蘆醇相較于雌二醇的效果和安全性實(shí)驗(yàn)較少。本研究在選擇給藥方式時(shí),綜合生物利用度、給藥難度、藥物劑型等因素,最終選擇腹腔注射。通過(guò)制作絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型,對(duì)比RSV及雌二醇對(duì)PMOP的影響,以期為RSV作為潛在治療PMOP的輔助性用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:8周齡雌性SD大鼠購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司(許可證號(hào):SCXK2019-0008)。大鼠在SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng),相對(duì)濕度60%,溫度25 ℃,光/暗循環(huán)12 h。采用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),各組飼養(yǎng)條件相同。本研究經(jīng)長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器:白藜蘆醇(RSV,C14H12O3,R8350)購(gòu)自Solarbio(中國(guó)北京)。二甲基亞砜(DMSO,Solarbio,北京,中國(guó))溶解白藜蘆醇。β-雌二醇(CAS:50-28-2)購(gòu)自sigma公司。肌酐測(cè)定試劑盒(C011-2-1)及尿素氮測(cè)試盒(C013-2-1)購(gòu)自南京建成生物工程研究所。全身雙能X射線吸收儀(DXA,Hologic ASY-00409)購(gòu)自美國(guó)Hologic公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1構(gòu)建大鼠PMOP模型及樣本收集:適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后,將50只大鼠隨機(jī)分為5組(每組10只):正常(CONTROL)組、假手術(shù)(Sham)組、去卵巢(OVX)組、OVX+白藜蘆醇(OVX+RSV)組、OVX+雌激素(OVX+E)組。OVX組大鼠手術(shù)切除雙側(cè)卵巢,Sham組切除卵巢周圍相同大小的脂肪,見圖1。術(shù)后1周,OVX+RSV組腹腔注射RSV[10 mg/(kg·d)],OVX+E組腹腔注射β-雌二醇[0.1 mg/(kg·d)]。Sham組和OVX組注射生理鹽水。每周稱量體重,干預(yù)12周后,收集所有動(dòng)物血清、雙側(cè)股骨、心臟、肝臟、胰腺和腎臟。

圖1 背側(cè)雙切口切除雌性SD大鼠雙側(cè)卵巢Fig.1 Bilateral ovariectomy of female SD rats through dorsal double incisions

1.2.2蘇木精-伊紅(HE)染色:右側(cè)股骨用4%多聚甲醛固定,切片前用EDTA脫鈣液脫鈣21 d。將脫水的樣品包埋于石蠟中,切片4 μm厚,HE染色,倒置顯微鏡下觀察,采集圖像。

1.2.3Goldner染色:解剖后,左側(cè)股骨在4%多聚甲醛中固定24 h后,通過(guò)梯度濃度的乙醇(70%～100%)和二甲苯脫水,嵌入甲基丙烯酸甲酯(MMA),對(duì)5 μm厚的切片進(jìn)行Goldner染色。

1.2.4雙能X射線吸收分析:各組SD大鼠于測(cè)量前12 h禁食禁水,腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后,放置于全身雙能X射線吸收儀掃描,采用高分辨率模式,檢測(cè)骨密度(BMD,g/cm2)、體脂率(BFP,%)和肌肉量(Lean mass,%),每4周檢測(cè)1次。最終由設(shè)備制造商提供小動(dòng)物身體組成軟件(Hologic QDR軟件的Windows XP,版本12.3)完成數(shù)據(jù)分析。

1.2.5臟器系數(shù):實(shí)驗(yàn)12周后,所有動(dòng)物禁食24 h,記錄安靜狀態(tài)下大鼠體質(zhì)量;腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg),取心臟、肝臟、胰腺和腎臟,并稱重。臟器系數(shù)表示為[器官質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)]×100%。

1.2.6血清肌酐及血清尿素氮水平的測(cè)定:大鼠取仰臥位,30 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后于腹主動(dòng)脈取血至負(fù)壓采血管中,室溫靜置1 h,8 000 r/min離心,共10 min,取上層血清,使用試劑盒檢測(cè)各組大鼠血清肌酐及尿素氮水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示。使用SPSS 26.0軟件通過(guò)單因素方差分析(ANOVA)評(píng)估各組間的統(tǒng)計(jì)差異。方差相等時(shí)采用最小差異檢驗(yàn)(least significant difference,LSD),方差不相等時(shí)采用Tamhane ’s T2檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)大鼠體重的影響

在12周內(nèi),每組大鼠體重均在一定范圍內(nèi)波動(dòng),總體呈上升趨勢(shì)(圖2),統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示各組間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

圖2 不同組別大鼠每周體重變化Fig.2 Weekly weight changes of rats in different groups

2.2 白藜蘆醇對(duì)骨組織形態(tài)學(xué)的影響

HE染色結(jié)果顯示,CONTROL組及Sham組骨小梁密集,具有排列規(guī)則的致密網(wǎng)絡(luò)。OVX組骨小梁變薄,小梁間隙增加,網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞。OVX+E組處理12周后骨小梁結(jié)構(gòu)有明顯改善。在大鼠RSV干預(yù)12周后,與OVX組相比,骨小梁網(wǎng)絡(luò)連接得到改善,且骨小梁結(jié)構(gòu)更厚和更規(guī)則。Goldner染色結(jié)果顯示,與Sham組相比,OVX組股骨遠(yuǎn)端礦化小梁(綠色區(qū)域)的數(shù)量和厚度均顯著降低。OVX組大鼠骨小梁數(shù)目和容積減小、髓腔加寬、出現(xiàn)骨小梁網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞區(qū),說(shuō)明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠建模成功。與OVX組相比,OVX+RSV組與OVX+E組骨小梁數(shù)量和小梁厚度顯著增加,骨小梁分離度顯著降低,見圖3。

圖3 各處理組股骨HE染色及Goldner染色(50×)Fig.3 Femoral HE staining and Goldner staining were performed in each treatment group (50×)

2.3 白藜蘆醇對(duì)DXA測(cè)量結(jié)果的影響

2.3.1各組對(duì)大鼠BMD的影響:4周與8周時(shí),各組間無(wú)顯著性差異(P>0.05),12周時(shí),與Sham組相比,OVX組BMD顯著降低(P<0.05),與OVX組相比,OVX+RSV組與OVX+E組BMD升高,但差異不顯著(P>0.05),OVX+RSV組與OVX+E組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

2.3.2各組對(duì)大鼠BFP的影響:4周與8周時(shí),各組間BFP無(wú)顯著性差異(P>0.05),12周時(shí),與Sham組及OVX組相比,OVX+RSV組BFP降低不顯著(P>0.05),OVX+E組BFP顯著性降低(P<0.05),OVX+RSV組與OVX+E組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

2.3.3各組對(duì)大鼠肌肉含量的影響:4周與8周時(shí),各組間肌肉含量無(wú)顯著性差異(P>0.05),12周時(shí),與Sham組及OVX組相比,OVX+RSV組肌肉含量無(wú)顯著變化(P>0.05),OVX+E組肌肉含量明顯升高(P<0.05),OVX+RSV組與OVX+E組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05),見圖4。

圖4 各組大鼠DXA測(cè)量結(jié)果分析Fig.4 Analysis of DXA measurement results of rats in each group

2.4 白藜蘆醇對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響

通過(guò)各組間臟器系數(shù)比較顯示(圖5),肝臟、胰腺及心臟系數(shù)各組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05);與CONTROL組和OVX組相比,OVX+RSV組的腎臟系數(shù)顯著降低(P<0.05),OVX+RSV組與OVX+E組各臟器系數(shù)之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

圖5 各組大鼠各臟器系數(shù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)Fig.5 Statistics of coefficients of various organs of rats in each group

2.5 白藜蘆醇對(duì)血清肌酐及血清尿素氮水平的影響

與CONTROL組及OVX組相比,OVX+RSV組大鼠空腹血清尿素氮和肌酐水平均顯著降低(P<0.05),OVX+E組肌酐水平顯著降低(P<0.05),見表1。

表1 RSV對(duì)大鼠血清尿素氮及血清肌酐水平的影響

3 討論

PMOP主要是由于體內(nèi)雌激素水平下降引起全身骨量減少的代謝性疾病[12]。20世紀(jì)70年代已有臨床研究證實(shí)ERT可以緩解絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松。然而,長(zhǎng)期服用雌激素存在誘發(fā)腫瘤、心血管疾病等風(fēng)險(xiǎn)[4]。植物雌激素是一類在結(jié)構(gòu)或功能上模仿哺乳動(dòng)物雌激素的植物源非甾體化合物,可以抑制骨吸收,促進(jìn)骨形成,同時(shí)可以克服ERT的副作用[13]。有文獻(xiàn)表明植物雌激素可以通過(guò)ER或非ER通路影響骨代謝,如淫羊藿苷通過(guò)激活雌激素受體介導(dǎo)的BMP/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)前成骨細(xì)胞MC3T3-E1的分化[14-15],補(bǔ)骨脂素可能通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路顯著提高PMOP模型大鼠的骨密度、骨鈣素等指標(biāo),改善絕經(jīng)后大鼠的骨質(zhì)疏松[16]。RSV作為一種天然雌激素,已有文獻(xiàn)表明其作用機(jī)制為:通過(guò)抑制ROS/HIF-1α信號(hào)通路,促進(jìn)成骨細(xì)胞的生成[17];激活雌激素介導(dǎo)的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2和JNK信號(hào)通路調(diào)控成骨細(xì)胞的分化和增殖[18];通過(guò)SIRT1和Wnt/-catenin信號(hào)通路降低PPARγ水平促進(jìn)成骨分化[19]。本課題組前期研究表明RSV在體外通過(guò)CaN/NFATc1通路促進(jìn)前成骨細(xì)胞MC3T3-E1的分化和成熟[20],但RSV在臨床應(yīng)用中的安全性和有效性仍有待驗(yàn)證。因此,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型,探討RSV抗PMOP的效果與安全性。

白藜蘆醇對(duì)大鼠體重影響的結(jié)果顯示,體重的增長(zhǎng)各組間無(wú)顯著性差異,說(shuō)明腹腔注射10 mg/(kg·d) RSV對(duì)體重影響不明顯。BMD檢測(cè)結(jié)果表明,12周時(shí),與Sham組相比,OVX組BMD顯著降低,說(shuō)明切除卵巢可顯著降低BMD導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。與OVX組相比,OVX+RSV組與OVX+E組BMD保持與CONTROL組相近的BMD,說(shuō)明白藜蘆醇與雌二醇有相似的緩解BMD降低的作用。BFP檢測(cè)結(jié)果表明,12周時(shí),OVX+E組BFP顯著降低。由于雌激素能夠調(diào)控成骨和成脂分化,當(dāng)雌激素缺乏時(shí),機(jī)體會(huì)出現(xiàn)成骨分化和脂肪代謝障礙,從而引發(fā)骨質(zhì)疏松癥和中心性肥胖[21],脂肪在體內(nèi)過(guò)度堆積導(dǎo)致體脂率增高,所以雌二醇的補(bǔ)充可有效降低BFP。而白藜蘆醇降BFP的效應(yīng)則較緩和,與CONTROL組和Sham組相比,BFP有所下降,但作用不顯著。通過(guò)對(duì)大鼠肌肉含量的測(cè)定可以看出,12周時(shí),OVX+E組肌肉含量顯著升高,可能由于雌激素作用于成肌細(xì)胞表面受體,促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖分化[22]。此外,Kohara[23]的研究表明,脂質(zhì)庫(kù)增加能降低氨基酸的利用率和肌纖維蛋白的合成量,因此,體內(nèi)脂肪過(guò)多可能會(huì)誘發(fā)和加劇肌肉減少。由此可知,隨著體脂率的上升,肌肉含量相應(yīng)減少。對(duì)于OVX+RSV組來(lái)說(shuō),作用較為溫和,與CONTROL組和Sham組相比差異不顯著。

臟器系數(shù)結(jié)果表明,除白藜蘆醇顯著降低腎臟系數(shù)外,肝臟、胰腺及心臟系數(shù)各組間差異不顯著。臟器系數(shù)降低常提示臟器萎縮或功能受損[24],說(shuō)明白藜蘆醇可能會(huì)造成腎臟功能損傷。因此,為了進(jìn)一步確定腎功能狀態(tài),行大鼠空腹血清尿素氮和肌酐水平測(cè)定,血尿素氮主要由蛋白質(zhì)分解代謝而來(lái),經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò)隨尿排出,血中尿素氮水平升高往往見于器質(zhì)性腎功能損傷。血清中肌酐主要通過(guò)骨骼肌中磷酸肌酸的非酶促反應(yīng)生成,經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò)隨尿排出體外,當(dāng)腎功能障礙時(shí),肌酐排出受阻,血中濃度升高。因此,臨床上常用血尿素氮和肌酐水平作為評(píng)估腎功能的指標(biāo)[25]。本研究結(jié)果顯示,與CONTROL組及OVX組相比,OVX+RSV組大鼠空腹血清尿素氮和肌酐水平均顯著降低,OVX+E組肌酐水平顯著降低,因此,并未發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇造成腎功能障礙。當(dāng)然,也有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,SD 大鼠白藜蘆醇[3 000 mg/(kg·d)]灌胃28 d出現(xiàn)血清尿素和肌酐水平升高,腎臟組織病理學(xué)改變的發(fā)生率和損傷程度加重,表現(xiàn)出腎毒性[26]。本實(shí)驗(yàn)選擇腹腔注射白藜蘆醇10 mg/(kg·d)并未出現(xiàn)腎功能障礙,可能與給藥劑量、給藥方式及給藥時(shí)間有關(guān)?？傊?臟器系數(shù)只是從整體上反映白藜蘆醇對(duì)主要器官是否有損傷,而對(duì)各臟器的形態(tài)學(xué)改變并不能判別,后續(xù)課題組將進(jìn)一步通過(guò)整體和微觀兩方面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

骨組織HE染色和Goldner染色結(jié)果顯示,OVX組出現(xiàn)骨質(zhì)疏松征象,如骨小梁排列稀疏,骨小梁變薄斷裂。與OVX組相比,OVX+RSV組與OVX+E組骨小梁數(shù)量和小梁厚度顯著增加,骨小梁網(wǎng)絡(luò)連接得到改善,骨小梁分離度降低。說(shuō)明白藜蘆醇能夠有效改善雌激素降低引起的骨質(zhì)疏松,且其效果與雌二醇相當(dāng)。亦有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,白藜蘆醇8.4 mg/(kg·d)灌胃8周可增加骨密度、提高骨強(qiáng)度、促進(jìn)骨形成[27]。

綜上所述,腹腔注射白藜蘆醇具有與雌激素相當(dāng)?shù)奶岣叽笫蠊晒荁MD的作用,且未發(fā)現(xiàn)有明顯毒副作用,具有較高安全性,為白藜蘆醇在抗骨質(zhì)疏松方面的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。