沈靈杰 秦超 劉合飛

南通市海門區(qū)人民醫(yī)院手足外科,江蘇 南通 226100

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)患者的骨骼脆弱,具有較高的骨折風(fēng)險(xiǎn)[1]。OP性骨折患者的生活質(zhì)量降低、病死率較高,給家庭及醫(yī)療保健系統(tǒng)帶來了沉重負(fù)擔(dān)[2]。開發(fā)新的治療方法來加快OP骨折患者骨組織修復(fù)及愈合,是骨科研究的重要任務(wù)之一。

富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)是一種超生理濃度的血小板濃縮物,可通過釋放多種高濃度的生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子,來促進(jìn)創(chuàng)傷區(qū)快速止血、栓塞血管再通,炎癥反應(yīng)快速應(yīng)答、肉芽組織修復(fù)生長(zhǎng)[3-4]。近來研究發(fā)現(xiàn),PRP也可為骨折愈合提供富含生長(zhǎng)因子及衍生蛋白的有利微環(huán)境,來加速成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的增殖和遷移,并快速有效的促進(jìn)骨折修復(fù)與重建,而受到骨科研究的重視[5]。但PRP加速骨質(zhì)生長(zhǎng)、促進(jìn)骨折愈合的具體分子生物學(xué)機(jī)制還不甚明確。

Notch通路可調(diào)控骨形成蛋白(BMP)表達(dá),抑制成骨細(xì)胞、骨原細(xì)胞分化等來參與OP性骨折愈合過程,而逐漸受到骨科研究學(xué)者的重視[6]。PRP能否調(diào)控Notch活化,來發(fā)揮促骨質(zhì)生長(zhǎng)及骨愈合作用,還未見報(bào)道。本研究擬建立大鼠OP性骨折模型,制備自體PRP并進(jìn)行干預(yù),從Notch通路方面探究PRP促OP性骨折愈合的可能機(jī)制,以期為PRP的開發(fā)應(yīng)用及在OP方面的治療提供可靠資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物:SPF級(jí)SD雄性大鼠60只,6～8月齡,體重250～300 g,購(gòu)自北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(京)2020-0007;所有大鼠于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心房中常規(guī)飼養(yǎng)。本試驗(yàn)動(dòng)物符合3R原則,試驗(yàn)經(jīng)南通市海門區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑及儀器:維甲酸(貨號(hào):1674004,上海玉博生物科技有限公司);Notch通路抑制劑(γ-分泌酶抑制劑,DAPT)(貨號(hào):M00762,北京百奧萊博科技有限公司);骨鈣素(OCN)ELISA試劑盒(貨號(hào):YK-08750,北京伊塔生物科技有限公司)、骨性堿性磷酸酶(BAP)ELISA試劑盒(貨號(hào):RX301001R,泉州市睿信生物科技有限公司)、血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF)ELISA試劑盒(貨號(hào):F16541,上海西唐生物科技有限公司)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)ELISA試劑盒(貨號(hào):SND-R746,滁州仕諾達(dá)生物科技有限公司)、胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(GF-1R)ELISA試劑盒(貨號(hào):CD-108844,武漢純度生物科技有限公司);堿性磷酸酶鈣-鈷法染色試劑盒(貨號(hào):YM-S1519,上海遠(yuǎn)慕生物科技公司);抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒(貨號(hào):SY6328,北京伊塔生物科技有限公司);兔抗大鼠Notch1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、骨保護(hù)素(OPG)、核因子κB受體活化因子配體(RANKL)等抗體(美國(guó)abcam公司,貨號(hào):ab184742、ab214821、ab203061、ab62516);SkyScan1276小動(dòng)物顯微CT(Micro-CT)影像系統(tǒng)購(gòu)自布魯克(北京)科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1大鼠OP性骨折模型建立及分組給藥:取SD雄性大鼠,參照文獻(xiàn)[7]灌胃給予70 mg/kg維甲酸,1次/d,14 d后用小動(dòng)物顯微CT(Micro-CT)檢測(cè)骨密度。確認(rèn)為OP后,將大鼠麻醉,用右側(cè)股骨干骨折髓內(nèi)固定術(shù)建立OP性骨折模型,并分為模型組、PRP組、DAPT組(Notch通路抑制劑DAPT)、PRP+DAPT組,每組12只,另取12只正常雄性大鼠,用閉合骨折制備法造成大鼠右側(cè)股骨中段骨折,設(shè)為正常骨折組,來作為對(duì)照。PRP組參照文獻(xiàn)[8]在大鼠造模前,經(jīng)眼眶采血3 mL制備PRP凝膠溶液[(血小板平均濃度為(12.05±0.29)×1012/L、白細(xì)胞平均濃度為(3.81±0.26)×109/L],取PRP凝膠溶液注射至骨折斷之間,1次/d;DAPT組尾靜脈注射1 mg/kg的DAPT溶液[9],1次/d;PRP+DAPT組給予PRP凝膠溶液的同時(shí),尾靜脈注射給予DAPT溶液;模型組及正常骨折組于骨折斷端注射給予不含PRP的凝膠溶液0.3 mL。各組連續(xù)給藥6周,末次給藥結(jié)束后12 h,取大鼠進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2X線觀察大鼠骨折愈合情況:各組大鼠末次給藥結(jié)束后,用X線檢測(cè)骨折愈合情況,骨折愈合評(píng)價(jià)采用盲法進(jìn)行,由不知實(shí)驗(yàn)分組的本院骨科醫(yī)師完成。

1.2.3ELISA法測(cè)大鼠血清OCN、BAP、PDGF、TGF-β、IGF-1R水平變化:將大鼠麻醉,取腹主動(dòng)脈血,按ELISA試劑盒說明書方法檢測(cè)血清OCN、BAP、PDGF、TGF-β、IGF-1R水平。

1.2.4Micro-CT法檢骨痂組織結(jié)構(gòu)變化:處死大鼠6只,取右側(cè)股骨組織,按照文獻(xiàn)[7]方法對(duì)大鼠股骨進(jìn)行Micro-CT掃描,并計(jì)算骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度、骨體積/總體積、骨密度等指標(biāo)變化。取骨痂組織進(jìn)行螯合劑乙烯二胺四乙酸(EDTA)脫鈣、透明、石蠟包埋后,切成厚度為5 μm切片,備用。

1.2.5堿性磷酸酶鈣-鈷法染色及抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法分別檢測(cè)成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞數(shù)目:取1.2.4項(xiàng)下的骨痂組織切片,按分別按堿性磷酸酶鈣-鈷及抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒說明書方法染色、孵育、封片后,置于顯微鏡下觀察拍照,用Image Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)計(jì)算單位面積內(nèi)陽性染色的細(xì)胞數(shù)目。

1.2.6免疫組化染色法檢測(cè)骨痂組織Notch1陽性表達(dá)水平:取1.2.4項(xiàng)下的剩余骨痂石蠟切片,二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,微波法修復(fù)抗原后,3%過氧化氫孵育10 min,并用10%山羊血清封閉10 min;加入一抗(Notch1,1∶500)4 ℃孵育過夜,洗去一抗,加入羊抗兔二抗(1∶800)室溫孵育1.5 h,DAB顯色、蘇木精復(fù)染封片后,于光鏡下觀察Notch1陽性表達(dá)(細(xì)胞呈棕黃色)并拍照,用Image Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)分析單位面積內(nèi)陽性染色區(qū)域的積分光密度值。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野,取均值。

1.2.7Western Blot法測(cè)骨痂組織BMP、OPG、RANKL蛋白表達(dá)水平:將剩余大鼠處死,取骨痂組織,液氮中凍存后,研磨、加勻漿液勻漿后提取蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度,取20 μg蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜反應(yīng)后,加入一抗BMP、OPG、RANKL(1∶800)、β-actin(1∶500)4 ℃孵育過夜,加入羊抗兔二抗(1∶800)37 ℃孵育2.5 h后,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色,以凝膠成像儀觀察條帶并拍照,并以Image-J軟件分析各組蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PRP對(duì)OP性骨折大鼠骨折愈合變化的影響

正常骨折組大鼠骨折線模糊不清,骨折斷端骨痂形成明顯,骨折愈合較好。模型組及PRP+DAPT組大鼠骨折線清晰,有少量骨痂形成,但未連接,骨折愈合不佳。與模型組相比,PRP組大鼠骨折線模糊或消失,骨折斷端有大量骨痂形成,且骨痂在骨折斷端呈連續(xù)性包繞貫穿,骨折處髓腔再通。DAPT組大鼠骨折線清晰,骨折斷端幾乎未見骨痂形成,骨折愈合欠佳,見圖1。

圖1 各組大鼠骨折部位X線掃描圖Fig.1 X-ray scan of fracture site of rats in each group

2.2 PRP對(duì)OP性骨折大鼠股骨骨密度、骨痂體積/總體積、骨小梁數(shù)量、骨小梁分離度的影響

與正常骨折組相比,模型組大鼠骨密度、骨痂體積/總體積、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度均降低(P<0.05)。與模型組相比,PRP組大鼠骨密度、骨痂體積/總體積、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度均升高(P<0.05);DAPT組大鼠骨密度、骨痂體積/總體積、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度進(jìn)一步降低(P<0.05)。PRP+DAPT組大鼠上述指標(biāo)變化與PRP組相反(P<0.05),見圖2、表1。

表1 各組大鼠股骨骨密度、骨體積/總體積、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度比較

圖2 Micro-CT檢測(cè)各組大鼠骨微結(jié)構(gòu)變化Fig.2 Micro-CT detected the changes of bone microstructure in each group

2.3 PRP對(duì)OP性骨折大鼠骨痂組織成骨細(xì)胞數(shù)目及破骨細(xì)胞數(shù)目表達(dá)的影響

堿性磷酸酶鈣-鈷法染色顯示,成骨細(xì)胞胞核呈圓形,細(xì)胞質(zhì)染色呈黑色,其表面有細(xì)小凸起,主要靠近骨小梁邊緣,緊密排列成立方體或矮柱狀,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色顯示,破骨細(xì)胞呈紅色或暗紅色,由多核巨細(xì)胞組成,分布于骨髓腔邊緣。與正常骨折組相比,模型組大鼠成骨細(xì)胞數(shù)目降低(P<0.05),破骨細(xì)胞數(shù)目升高(P<0.05)。與模型組相比,PRP組大鼠成骨細(xì)胞數(shù)目升高(P<0.05),破骨細(xì)胞數(shù)目降低(P<0.05)。DAPT組大鼠成骨細(xì)胞數(shù)目進(jìn)一步降低(P<0.05),破骨細(xì)胞數(shù)目進(jìn)一步升高(P<0.05)。PRP+DAPT組大鼠上述指標(biāo)變化與PRP組相反(P<0.05),見圖3、表2。

表2 各組大鼠骨痂組織成骨細(xì)胞數(shù)目及破骨細(xì)胞數(shù)目比較個(gè)/mm2)

圖3 各組大鼠骨痂組織成骨細(xì)胞(堿性磷酸酶鈣-鈷法染色,400×)及破骨細(xì)胞(抗酒石酸酸性磷酸酶法染色,200×)比較Fig.3 Osteoblasts (Calcium Cobalt alkaline phosphatase staining, 400×) and osteoclasts (tartrate-resistant acid phosphatase staining, 200×) were compared in each group

2.4 PRP對(duì)OP性骨折大鼠骨痂組織中Notch1陽性表達(dá)的影響

免疫組化顯示Notch1在正常骨折組大鼠骨痂組織中呈強(qiáng)陽性表達(dá)。與正常骨折組相比,模型組大鼠Notch1陽性表達(dá)降低[(6.19±0.64)平均光密度/mm2比(21.13±2.11)平均光密度/mm2,P<0.05]。與模型組相比,PRP組大鼠Notch1陽性表達(dá)升高[(20.71±0.69)平均光密度/mm2比(6.19±0.64)平均光密度/mm2,P<0.05]。DAPT組大鼠Notch1陽性表達(dá)進(jìn)一步降低[(1.11±0.22)平均光密度/mm2比(6.19±0.64)平均光密度/mm2,P<0.05]。與PRP組相比,PRP+DAPT組大鼠Notch1陽性表達(dá)降低[(6.28±0.61)平均光密度/mm2比(20.71±0.69)平均光密度/mm2,P<0.05],見圖4。

圖4 大鼠骨痂組織Notch1免疫組化染色圖(400×)Fig.4 Notch1 immunohistochemical staining of rat callus tissue (400×)

2.5 PRP對(duì)OP性骨折大鼠血清OCN、BAP、PDGF、TGF-β、IGF-1R水平的影響

與正常骨折組相比,模型組大鼠血清OCN、BAP、PDGF、TGF-β、IGF-1R等水平降低(P<0.05)。與模型組相比,PRP組大鼠OCN、BAP、PDGF、TGF-β、IGF-1R等水平升高(P<0.05)。DAPT組大鼠OCN、BAP、PDGF、TGF-β、IGF-1R等水平進(jìn)一步降低(P<0.05)。PRP+DAPT組大鼠上述指標(biāo)變化與PRP組相反(P<0.05),見表3。

表3 各組大鼠血清OCN、BAP、PDGF、TGF-β、IGF-1R水平比較Table 3 Comparison of serum levels of OCN, BAP, PDGF, TGF-β and IGF-1R in each group

2.6 PRP對(duì)OP性骨折大鼠骨痂組織BMP、OPG、RANKL蛋白表達(dá)的影響

與正常骨折組相比,模型組大鼠骨痂組織BMP、OPG蛋白表達(dá)降低(P<0.05),RANKL蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。與模型組相比,PRP組大鼠骨痂組織BMP、OPG蛋白表達(dá)升高(P<0.05),RANKL蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。DAPT組大鼠骨痂組織BMP、OPG蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低(P<0.05),RANKL蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高(P<0.05)。PRP+DAPT組大鼠上述指標(biāo)變化與PRP組相反(P<0.05),見圖5、表4。

表4 各組大鼠骨痂組織BMP、OPG、RANKL蛋白表達(dá)比較Table 4 Comparison of BMP, OPG and RANKL protein expression in callus tissue of rats in each group

圖5 各組大鼠骨痂組織BMP、OPG、RANKL蛋白表達(dá)免疫印跡圖Fig.5 Western Blot of BMP, OPG and RANKL protein expression in callus tissue of rats in each group

3 討論

OP患者骨量減少、骨結(jié)構(gòu)異常、骨脆性增加,是導(dǎo)致骨折發(fā)生率升高的重要原因之一[10]。維甲酸又叫維A酸,可影響骨的正常生長(zhǎng)、發(fā)育及代謝,引起OP形成[11]。本研究用維甲酸誘導(dǎo)建立大鼠模型后發(fā)現(xiàn),大鼠股骨骨密度降低,預(yù)示大鼠OP模型建立成功。本研究結(jié)果顯示,與正常骨折組相比,OP性大鼠骨折線清晰、骨痂體積減少、骨小梁密度及厚度降低、骨細(xì)胞指數(shù)降低、骨愈合時(shí)間延長(zhǎng),與骨形成有關(guān)的血清骨鈣素、骨性堿性磷酸酶(BAP)含量明顯減少,提示OP性骨折組大鼠出現(xiàn)骨密度降低、骨痂形成減少及骨愈合延遲的現(xiàn)象,表明造模成功。

骨折時(shí),骨折斷端聚集的大量血小板,可釋放大量的PDGF、TGF-β、IGF等來促進(jìn)成骨增殖、調(diào)節(jié)骨細(xì)胞功能和代謝等,而參與骨修復(fù)與再生過程[12-13]。PRP中含有大量的PDGF、TGF-β、IGF等生長(zhǎng)因子,且自體提取制備的PRP,具有制備簡(jiǎn)單、可行性高、價(jià)格低廉、生物安全性高及并發(fā)癥少等優(yōu)點(diǎn),被證實(shí)具有加速骨細(xì)胞活化、促進(jìn)骨缺損修復(fù)、骨誘導(dǎo)再生等作用,而在骨折治療中有廣闊的應(yīng)用前景[14-15]。冀少林等[8]建立大鼠OP性骨折模型,證實(shí)PRP可促進(jìn)OP性骨折大鼠骨痂形成。本研究發(fā)現(xiàn),PRP組大鼠干預(yù)治療后,大鼠血清中DGF、TGF-β、IGF水平異常升高,骨痂體積、骨小梁形成及骨愈合水平均高于OP性骨折模型組,證實(shí)PRP具有較好的促進(jìn)OP性骨折愈合作用。但其具體分子生物學(xué)機(jī)制還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

Notch信號(hào)通路是骨代謝過程中的重要通路[16]。大量文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)Notch信號(hào)出現(xiàn)異常時(shí),會(huì)引起骨發(fā)育失調(diào)、骨質(zhì)疏松、骨軟化等[17]。周靈通等[18]發(fā)現(xiàn),Notch可表達(dá)于成骨細(xì)胞中,可通過抑制破骨細(xì)胞分化和成熟來促進(jìn)骨礦物質(zhì)沉積。Ballhause等[19]發(fā)現(xiàn),Notch活化可通過促進(jìn)BMP、OPG等促成骨活化因子表達(dá),抑制破骨細(xì)胞活化來影響骨代謝及骨重建過程。本研究發(fā)現(xiàn),OP性骨折組大鼠骨密度降低、骨愈合延遲的同時(shí),骨痂組織中Notch1表達(dá)顯著降低,BMP、OPG等促成骨活化因子表達(dá)降低,RANKL等骨吸收反應(yīng)相關(guān)因子表達(dá)增加,進(jìn)一步抑制大鼠Notch1表達(dá),大鼠骨密度進(jìn)一步降低,骨折愈合更加緩慢。本研究發(fā)現(xiàn),PRP促進(jìn)大鼠骨密度升高、加快骨折愈合的同時(shí),Notch1及BMP、OPG表達(dá)也升高,提示PRP促進(jìn)OP性骨折大鼠骨量增加及骨折愈合的作用,也可能與促進(jìn)Notch1通路激活有關(guān)。Notch通路抑制劑-DAPT可逆轉(zhuǎn)PRP的上述作用。

綜上所述,PRP促進(jìn)OP性骨折大鼠骨量增加及骨折愈合的作用,也可能與促進(jìn)Notch1通路激活有關(guān)。這可能為闡明PRP改善OP性骨折的分子生物學(xué)機(jī)制,提供一定參考。但OP性骨折骨密度降低及骨折愈合的調(diào)控機(jī)制復(fù)雜,涉及多條通路多個(gè)細(xì)胞因子共同調(diào)節(jié),Notch可能只是其中的一條途徑。PRP促進(jìn)OP性骨折愈合的其他分子機(jī)制,仍需繼續(xù)深入研究。