李國光 郜晉楠 任靜 楊麗華 韓文彪

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，鄂爾多斯固體廢棄物資源化工程技術(shù)研究所，內(nèi)蒙古鄂爾多斯 017000）

0 引言

利用沼氣工程處理城市日益增長的有機(jī)廢棄物是一種行之有效的途徑［1］，但是沼氣工程也會產(chǎn)生大量的沼液副產(chǎn)物。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國沼氣工程每年產(chǎn)生的沼液數(shù)量達(dá)8 ～10 億t［2］。城市有機(jī)廢棄物厭氧發(fā)酵后的沼液因其濁度、色度、鹽度較大，有機(jī)物、重金屬、氮和磷等污染物含量較高，通常被視為高濃度污水［3］，必須經(jīng)過合適的處理才能用作農(nóng)肥或者達(dá)標(biāo)排放。

生物處理方法是一種有效降低沼液中污染物質(zhì)的方法之一。通過人工選育和基因重組等生物技術(shù)手段，得到一種或多種以目標(biāo)污染物為營養(yǎng)源的高效微生物菌種，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后吸附在載體上，投加至沼液處理系統(tǒng)中，從而降低其中大量的有機(jī)物，同時(shí)還能降低內(nèi)部重金屬、氮和磷等污染物，使沼液成為液態(tài)肥合理利用［4］。在實(shí)際應(yīng)用中，單一菌株對沼液中污染物的去除效果有限，而將多種目標(biāo)微生物單獨(dú)培養(yǎng)后，再按一定比例進(jìn)行復(fù)配，制備成復(fù)合微生物菌劑，對沼液中目標(biāo)污染物可取得最佳的處理效果［5］。

本實(shí)驗(yàn)研究了污水處理中常見的7 株功能微生物對城市有機(jī)廢棄物厭氧發(fā)酵沼液廢水處理效果，并將其中4 株處理效果較好的單一菌株構(gòu)建為復(fù)合菌劑用于處理沼液，同時(shí)考察了高效降解菌在硅藻土、麩皮、玉米粉、秸稈粉等復(fù)合載體上的生物活性，為處理沼液廢水高效復(fù)合菌劑的開發(fā)和應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 沼液來源

供試沼液取自鄂爾多斯市沙圪堵鎮(zhèn)沼氣示范工程項(xiàng)目現(xiàn)場，該廠沼液發(fā)酵原料為城市生活垃圾、畜禽糞便和餐廚垃圾。沼液經(jīng)充分腐熟、靜置沉降后，取上清液并進(jìn)行過濾備用。所得沼液的理化性質(zhì)見表1，因原始沼液污染物濃度太高，影響菌種活性和測定結(jié)果，故將原始沼液稀釋5 倍后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 原始沼液理化性質(zhì) 單位：mg/L（pH 值除外）

1.2 供試菌種

本試驗(yàn)所用7 株具有降解水體中污染物能力的功能菌分別為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus Meyer and Gottheil）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、裂解亞氯酸假單胞菌（Pseudomonas chloritidismutans）、產(chǎn)氣克雷伯氏菌（Klebsiella aerogenes）、華仙腸桿菌（Enterobacter huaxiensis）、帚石南棒桿菌（Corynebacterium callunae）和副球菌（Paracoccus denitrifications），這些菌種均從自然界中通過富集培養(yǎng)、分離純化得到，并保藏于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物與發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室。在前期預(yù)試驗(yàn)中已測得各菌種在LB 培養(yǎng)基中生長曲線，并以沼液COD為去除率為目標(biāo)，確定了各菌種最適接種量，為后期菌劑復(fù)配比例提供依據(jù)。7 株菌種生物學(xué)特性見表2。

表2 菌種生物學(xué)特性

1.3 載體來源

本試驗(yàn)所使用的載體為玉米秸稈粉、玉米粉、麩皮及硅藻土，其中硅藻土為市售，其他3 種取自周邊農(nóng)戶，經(jīng)粉碎后過20 目篩備用。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 單一菌株處理沼液廢水試驗(yàn)

利用LB 液體培養(yǎng)基將上述7 株菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，將各菌的培養(yǎng)液以最適接種量（見表2）分別接入100 mL已滅菌的沼液中，然后將搖瓶置于30 ℃、150 r/min 的搖床中振蕩培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結(jié)束后，將各處理沼液以8 000 r/min 離心10 min，取上清液并檢測其中氨氮、COD、總磷濃度，并計(jì)算其去除率。每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)平行，并以不接菌的滅菌沼液為空白對照。

1.4.2 復(fù)合菌的構(gòu)建及處理沼液廢水試驗(yàn)

將1.4.1 節(jié)試驗(yàn)效果較好的短小芽孢桿菌、裂解亞氯酸假單胞菌、帚石南棒桿菌和產(chǎn)氣克雷伯氏菌4株菌進(jìn)行平板對峙培養(yǎng)試驗(yàn)，確定彼此沒有拮抗作用后，分別在LB 液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后按照其最適接種量比例進(jìn)行復(fù)配，制得由4 種菌株組成的復(fù)合菌液，將復(fù)合菌液以2%的接種量接入100 mL滅菌沼液中，以相同體積的無菌水代替復(fù)合菌液接入沼液作為對照，然后將搖瓶置于30 ℃、150 r/min 的搖床中振蕩培養(yǎng)7 d，離心處理后，取上清液檢測其中氨氮、COD、總磷濃度，并計(jì)算其去除率。

1.4.3 復(fù)合菌吸附載體選擇試驗(yàn)

采用玉米秸稈粉、玉米粉、麩皮及硅藻土作為復(fù)合菌劑吸附載體，將前3 種載體進(jìn)行等比例隨機(jī)復(fù)配，設(shè)置玉米秸稈粉+玉米粉、玉米秸稈粉+麩皮、玉米粉+麩皮、玉米秸稈粉+玉米粉+麩皮4 個(gè)處理，每個(gè)處理總重為1 kg。為防止復(fù)合載體結(jié)塊，在每個(gè)處理中加入300 g的硅藻土作為分散吸附劑，同時(shí)加入20 g發(fā)酵引物紅糖，均勻攪拌后，用無菌水將各處理組的濕度調(diào)節(jié)到50%左右后進(jìn)行高溫滅菌，然后分別接入200 mL 復(fù)合菌液，在30 ℃下恒溫保濕培養(yǎng)7 d后，置于35℃恒溫烘箱中，進(jìn)行鼓風(fēng)干燥處理，制得固體復(fù)合菌劑。分別取10 g 樣品并加入100 mL無菌水，在150 r/min 下振蕩2 h 后，用稀釋平板計(jì)數(shù)法，測定各處理的活菌數(shù)。

1.5 主要分析項(xiàng)目和計(jì)算方法

采用重鉻酸鉀法測定COD［6］，納氏試劑分光光度法測定氨氮（GB 7479—1987），鉬酸銨分光光度法測定總磷（GB 11893—1989），血球計(jì)數(shù)法測定復(fù)合菌劑中有效活菌數(shù)。

氨氮、COD、總磷去除率Q的計(jì)算公式如下：

式中，Q為去除率，%；X為原始沼液的氨氮、COD 或總磷含量，mg/L；Y為處理后沼液氨氮、COD 或總磷含量，mg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨氮去除效果與分析

圖1 為7 株菌在各自最適接種量下對城市有機(jī)廢棄物厭氧發(fā)酵沼液廢水中氨氮的處理效果。從圖中可知，7 株菌種都具有降解沼液中氨氮的能力，除了副球菌外，其他各菌株去除率均在60%以上。其中對沼液氨氮去除率最高的是裂解亞氯酸假單胞菌，去除率可達(dá)85.1%，其次是產(chǎn)氣克雷伯氏菌、短小芽孢桿菌和帚石南棒桿菌，三者對沼液氨氮的去除率相差不大，分別為78.7%、77.1%和72.0%。對沼液氨氮去除率最低的是副球菌，僅有54.0%。

圖1 不同菌株對沼液氨氮去除率

假單胞菌屬、芽孢桿菌屬和副球菌屬中的多株細(xì)菌已經(jīng)被證實(shí)有較好的去除污水中氨氮的能力，如尹紅梅等［7］在養(yǎng)豬場篩選到的地衣芽孢桿菌，對養(yǎng)豬廢水氨氮的去除率可達(dá)80.0%以上；楊繼偉等［8］在污泥中篩選的假單胞菌，對人工模擬污水中氨氮的去除率可達(dá)84.7%，這與本試驗(yàn)研究的沼液中氨氮去除率結(jié)果相近；劉勝格［9］從城市排污口淤泥中分離的副球菌對廢水中的氨氮去除率達(dá)70.0%以上，而本試驗(yàn)中副球菌對沼液中氨氮的去除率僅有54.0%，這可能是沼液復(fù)雜的成分組成對副球菌的生長代謝造成了一定的影響。克雷伯氏菌屬在廢水脫氮的應(yīng)用也有報(bào)道，趙迪［10］從硝基苯污水處理池中篩選分離得到一株具有高效降解硝態(tài)氮的克雷伯氏菌，而本試驗(yàn)所用產(chǎn)氣克雷伯氏菌對氨氮也具有較高去除率，說明該菌既可降解硝態(tài)氮，又可降解氨態(tài)氮。

2.2 COD 去除效果與分析

城市有機(jī)廢棄物厭氧發(fā)酵沼液廢水中的COD值較大，處理較困難，本試驗(yàn)所用的7 株菌對其均有較好的去除效果，如圖2 所示，7 株菌對沼液中COD的去除率相差不大，均在65.0%以上，其中去除率最高的是帚石南棒桿菌，去除率可達(dá)82.7%。短小芽孢桿菌、裂解亞氯酸假單胞菌、副球菌和華仙腸桿菌也有較高的去除率，均在70.0%以上。解淀粉芽孢桿菌對沼液中COD 的去除率相對較低，只有66.3%。

圖2 不同菌株對沼液COD 去除率

芽孢桿菌屬中的許多菌株具有降解廢水中COD的能力，惠治兵等［11］從馬鈴薯淀粉廢水中分離出一株解淀粉芽孢桿菌，對COD 的去除率達(dá)71.7%；伍華雯等［12］利用固體化菌種枯草芽孢桿菌和彎曲芽孢桿菌處理養(yǎng)殖廢水，廢水中的COD 去除率也非常明顯。本試驗(yàn)使用的解淀粉芽孢桿菌同樣具有去除沼液中COD 的效果，只是處理效果不及惠治兵等人分離的菌株，這也說明不同來源的同種菌株對不同處理對象可能存在著效果差異。

2.3 總磷去除效果與分析

總磷去除效果如圖3 所示。從圖中可看出，供試7 株菌對城市有機(jī)廢棄物厭氧發(fā)酵沼液廢水中總磷的去除效果不及氨氮和COD，各菌去除率均不高。除了產(chǎn)氣克雷伯氏菌達(dá)到30.5%之外，其余各菌均在30.0%以下。這可能與微生物脫氮和除磷機(jī)制相關(guān)，生物除磷法主要是聚磷微生物在交替的厭氧和好氧條件下，吸收系統(tǒng)中的PO43-并形成含poly-P污泥，從而通過排放含poly-P 富磷污泥將磷從污水中去除；而生物脫氮主要包括硝化反硝化、厭氧氨氧化、異養(yǎng)硝化-好氧反硝化等作用將氮素進(jìn)行轉(zhuǎn)化利用。在微生物脫氮除磷系統(tǒng)中，可能積累了過量的NO2-，從而抑制了各菌缺氧吸磷的過程，這可能是氨氮去除效果優(yōu)于總磷的原因之一。裂解亞氯酸假單胞菌和帚石南棒桿菌對沼液總磷的去除率僅次于產(chǎn)氣克雷伯氏菌，為28.5%和24.5%，去除率最低的是副球菌，僅有15.4%。

圖3 不同菌種對沼液總磷去除率

在污水系統(tǒng)中，除磷菌降解性能除了與自身特性有關(guān)外，也與所處環(huán)境有著密切關(guān)系。城市有機(jī)廢棄物厭氧發(fā)酵后的沼液中，濁度、色度、鹽度較大，懸浮物、重金屬等污染物含量較高，這些物質(zhì)成分較為復(fù)雜，可能影響了各菌種對總磷的去除效果［13］。有研究表明，將多種特定功能的單一菌種進(jìn)行復(fù)配，構(gòu)建為復(fù)合菌劑，能夠極大地提升廢水中污染物的去除率，這為沼液中總磷的高效去除提供了研究思路。

2.4 復(fù)合菌去除效果分析

從以上試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，短小芽孢桿菌、裂解亞氯酸假單胞菌、帚石南棒桿菌和產(chǎn)氣克雷伯氏菌對沼液中污染物去除效果較好，故將這4 株菌按照最適接種量進(jìn)行復(fù)配，并構(gòu)建為復(fù)合菌，考察其對沼液廢水的處理效果，結(jié)果見圖4。圖中表明，復(fù)合菌對沼液中3 種污染物的去除效果與單一菌相比均有提升，氨氮的去除率達(dá)87.5%，較單一菌最高值增加了2.4%，COD去除率達(dá)86.4%，較單一菌最高值增加了3.7%，二者提升幅度較小。但是總磷的去除率有較大提升，去除率達(dá)63.2%，較單一菌最高值增加了32.7%，充分發(fā)揮了菌群互作的優(yōu)勢。

圖4 復(fù)合菌對沼液廢水處理效果

之所以有這樣的結(jié)果可能原因是4 株菌之間產(chǎn)生了某種協(xié)同作用，從而促進(jìn)了某些功能基因的表達(dá)，但具體機(jī)制有待確定［5］。王亞軍等［14］就將一株克雷伯氏菌與一株銅綠假單胞菌進(jìn)行復(fù)配，發(fā)現(xiàn)二者能協(xié)同增強(qiáng)除磷，在最適比例下，生活污水中總磷降解率能達(dá)到99.4%。樊婷婷等［15］將惡臭假單胞菌、銅綠假單胞菌、地衣芽孢桿菌和土生克雷伯氏菌組成的復(fù)合菌劑用于處理河道污水，對總氮、氨氮、總磷、COD 有最高的去除率，分別達(dá)到78.3%、82.8%、86.6%、83.9%，極大地發(fā)揮了復(fù)合菌的功能優(yōu)勢。

復(fù)合微生物菌劑在廢水處理實(shí)際應(yīng)用中也存在一些問題，如各菌種間的相互作用不都為協(xié)同作用，也可能存在拮抗作用；菌種在不同吸附載體上，因生長速率不同可能會造成混合菌群各菌種比例失調(diào)，從而影響菌劑應(yīng)用效果。因此，需要進(jìn)一步研究復(fù)合微生物菌劑在不同載體上的生長情況，優(yōu)化其培養(yǎng)條件。

2.5 復(fù)合菌劑載體選擇及活菌數(shù)分析

從實(shí)際應(yīng)用角度考慮，復(fù)合菌劑中有效活菌數(shù)越多，高效降解菌種類越多，該菌劑處理效果會越好，而吸附載體是菌劑構(gòu)建能否成功的關(guān)鍵。良好的吸附載體不僅能吸附污水中的污染物，其表面的微孔更有利于微生物的附著，同時(shí)也可以為微生物提供豐富的食物來源和適宜的生長環(huán)境，從而將載體的吸附和生物降解2 個(gè)過程充分耦合起來，具有極強(qiáng)的污水處理累加效應(yīng)［16］。因此本試驗(yàn)選擇了秸稈粉、玉米粉、麩皮等常用的生物質(zhì)吸附載體對復(fù)合菌劑中微生物的生物活性進(jìn)行了研究。不同載體構(gòu)建的菌劑中有效活菌數(shù)見表3?？梢钥闯?，秸稈粉+玉米粉+硅藻土的載體組合有效活菌數(shù)最高，達(dá)到了2.91×108CFU/g，說明復(fù)合菌在該載體上吸附量更高，生長繁殖更好；最低的是秸稈粉+麩皮+硅藻土組合，僅有4.8×107CFU/g，可能是該載體組合的營養(yǎng)成分不足，不能滿足復(fù)合菌株的正常生長，從而使菌劑中活菌數(shù)降低。

表3 不同載體菌劑中有效活菌數(shù)

單一載體對菌劑中生物活性的保護(hù)有限，而將多種友好型載體以一定比例進(jìn)行復(fù)合，可提高復(fù)合菌劑穩(wěn)定性和有效活菌數(shù)。而在載體的選擇上，最常用的就是植物源載體與非金屬礦物質(zhì)載體進(jìn)行復(fù)配組合。馬曉亮［17］將玉米粉、蠶蛹粉、鋸末、麥麩、硅藻土等5 種載體進(jìn)行復(fù)合制作固化菌劑，發(fā)現(xiàn)5 種載體以不同的比例進(jìn)行復(fù)合時(shí)，可使菌劑中有效活菌數(shù)最大。本試驗(yàn)中使用的植物源載體秸稈粉、玉米粉和非金屬礦物質(zhì)載體硅藻土組合同樣具有最高生物活性。

圖5 是試驗(yàn)制備的不同載體構(gòu)建的復(fù)合菌劑，可以看出不同載體組合構(gòu)建的復(fù)合菌劑粒徑不同，顏色各異，總體為土黃色粉末狀固體，具有發(fā)酵物特有的氣味，使用時(shí)只需直接投加，且便于保藏和運(yùn)輸，大大提高了應(yīng)用范圍。

圖5 不同載體組合構(gòu)建的復(fù)合菌劑

3 結(jié)論

通過單菌對比及復(fù)合菌劑構(gòu)建試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生物處理法對城市有機(jī)廢棄物厭氧發(fā)酵沼液降解效果明顯，試驗(yàn)表明：

（1）7 株菌種都具備降解沼液中氨氮、COD和總磷的能力，其中氨氮去除率最高的是裂解亞氯酸假單胞菌和產(chǎn)氣克雷伯氏菌，去除率分別達(dá)85.1%和78.7%；COD 去除率最高的是帚石南棒桿菌和短小芽孢桿菌，去除率可達(dá)82.7%和76.1%；總磷去除率相對最高的是產(chǎn)氣克雷伯氏菌，去除率達(dá)到30.5%，而其余均在30%以下。

（2）將短小芽孢桿菌、裂解亞氯酸假單胞菌、帚石南棒桿菌和產(chǎn)氣克雷伯氏菌按照最適接種量進(jìn)行復(fù)配構(gòu)建為復(fù)合菌后，對沼液中氨氮的去除率達(dá)87.5%，COD 去除率達(dá)86.4%，總磷的去除率達(dá)63.2%，3 種物質(zhì)的去除率較單一菌最高值均有提升，但是總磷去除率效果最好，充分發(fā)揮了菌群互作的優(yōu)勢。

（3）秸稈粉+玉米粉+硅藻土更適合做吸附載體，復(fù)合菌在該載體上吸附量更大，生長繁殖更好，有效活菌數(shù)最高，達(dá)到了2.91×108CFU/g，為復(fù)合菌劑的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。