劉峰峰，孟 霖，何結(jié)望，周迎輝，石 剛，彭五星，乾 艷，楊秀軍*，孫福山

1.湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，武漢市東西湖區(qū)?？诙? 號(hào) 430062 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，山東省青島市嶗山區(qū)科苑經(jīng)四路11 號(hào) 266000 3.湖北省煙草公司恩施州公司，湖北省恩施州宣恩縣建設(shè)路36 號(hào) 445500

目前，我國(guó)上部煙葉存在色深僵厚、化學(xué)成分不協(xié)調(diào)、工業(yè)可用性較低等問(wèn)題。已有研究發(fā)現(xiàn)，帶莖采烤上部煙葉外觀顏色淺橘黃、成熟度高、結(jié)構(gòu)疏松、身份適中、色度鮮亮，常規(guī)化學(xué)成分協(xié)調(diào)，感官質(zhì)量好，可用性高［1-4］。煙葉烘烤過(guò)程實(shí)質(zhì)上是采收后的煙葉離開煙株母體處于饑餓代謝狀態(tài)［5］，在烤房中通過(guò)調(diào)控環(huán)境溫濕度等手段，促使煙葉外觀變黃失水，煙葉內(nèi)部發(fā)生必要的生理生化變化，進(jìn)而逐步實(shí)現(xiàn)煙葉干制的過(guò)程。在此過(guò)程中，煙葉代謝活動(dòng)的能量主要來(lái)源于呼吸作用。而帶莖采烤上部煙葉時(shí)，莖稈中的水分和無(wú)機(jī)鹽離子等可向煙葉中移動(dòng)，使之處于一種半饑餓代謝狀態(tài)。帶莖采烤上部煙葉品質(zhì)形成機(jī)理與常規(guī)逐葉采烤煙葉存在一定差異。余金恒等［6］研究發(fā)現(xiàn)，在定色前期及其后的烘烤階段，帶莖采烤上部煙葉的淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶活性高于常規(guī)采烤和一次逐葉采烤的煙葉，有利于煙葉中大分子物質(zhì)向小分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，以及煙葉化學(xué)成分比例的協(xié)調(diào)。馬留軍等［7］研究認(rèn)為，帶莖采烤上部煙葉在烘烤過(guò)程中失水較難，但色素降解速率高于常規(guī)逐葉采烤煙葉；王曉賓等［8］研究表明，帶莖采烤上部煙葉總氮含量變化不大，硝酸鹽和亞硝酸含量呈先升高后下降的趨勢(shì)，鉀含量比逐葉采烤煙葉稍有增加；魏碩等［9］、滕永忠等［10］、蔣博文等［11］研究均證實(shí)了帶莖采烤上部煙葉莖稈中水分存在經(jīng)葉脈向葉片中轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。目前，帶莖采烤對(duì)上部煙葉烘烤過(guò)程生理生化特性的影響研究多集中在水分遷移、色素含量、主要化學(xué)成分含量、烤后煙葉質(zhì)量及效益等方面，而有關(guān)抗氧化生理生化方面的研究卻鮮見報(bào)道。為此，分析了帶莖采烤上部煙葉外觀質(zhì)量特點(diǎn)、圖像特征以及烘烤過(guò)程中煙葉組織結(jié)構(gòu)、活性氧、抗氧化關(guān)鍵酶活性等的變化，旨在為提高上部煙葉可用性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2021年度在湖北省恩施土家族苗族自治州宣恩縣椒園煙站進(jìn)行。供試品種為云煙87，選取標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)煙田的烤煙上部5片煙葉（從上至下數(shù)），待煙葉充分成熟時(shí)采收，采用氣流上升式密集烤房烘烤，以上部煙葉第3葉位為研究材料。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)置兩個(gè)處理，①帶莖采烤：采收時(shí)上部5 片煙葉連同莖稈一起砍下，掛在煙竿上，每竿30株；②逐葉采烤：作為對(duì)照，依次采收上部5片煙葉，按葉位標(biāo)記編竿，每竿150片。

每個(gè)處理3竿，重復(fù)3次，均裝在密集烤房2層，并設(shè)置取樣窗。按當(dāng)?shù)赝扑]的密集烘烤工藝進(jìn)行烘烤，在鮮煙葉和烘烤階段干球溫度關(guān)鍵穩(wěn)溫點(diǎn)末（即變黃階段的38 ℃末、40 ℃末、42 ℃末，定色階段的46 ℃末、50 ℃末、54 ℃末，干筋階段的68 ℃末），每個(gè)處理取上部煙第3葉位的煙葉9片，在烤房?jī)?nèi)將葉片去除主脈后置于離心管內(nèi)，并迅速放入液氮中保存，用于煙葉組織結(jié)構(gòu)觀察和相關(guān)酶活性（50 ℃以上煙葉細(xì)胞已消融，呼吸代謝停止，未檢測(cè)酶活性）測(cè)定?？竞竺總€(gè)處理每次重復(fù)分別取上部煙第3葉位的煙葉10 片，進(jìn)行外觀質(zhì)量評(píng)價(jià)和顏色亮度值（L*）、紅綠值（a*）、黃藍(lán)值（b*）測(cè)定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 外觀質(zhì)量評(píng)價(jià)

由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所5 名煙葉分級(jí)高級(jí)技師以上專家，對(duì)煙葉外觀質(zhì)量顏色、成熟度、結(jié)構(gòu)、身份、油分、色度6個(gè)因素的評(píng)價(jià)檔次進(jìn)行賦分，見表1。

表1 烤后煙葉外觀質(zhì)量指標(biāo)的評(píng)價(jià)賦分Tab.1 Appearance quality scoring criteria of cured tobacco leaves

1.3.2 煙葉顏色特征值測(cè)定

采用相機(jī)尼康D6500［尼康光學(xué)儀器（中國(guó)）有限公司］拍照煙葉正面，在暗箱中標(biāo)準(zhǔn)光源下，成像高度100 cm，采用Matlab 2019進(jìn)行圖像處理，計(jì)算提取煙葉的黃色面積百分比，L*、a*和b*值。其中，L*越大亮度越高；a*從負(fù)數(shù)變?yōu)檎龜?shù)，對(duì)應(yīng)顏色從綠色變?yōu)榧t色，b*從負(fù)數(shù)變?yōu)檎龜?shù)，對(duì)應(yīng)顏色從藍(lán)色變?yōu)辄S色。

1.3.3 組織結(jié)構(gòu)

在各關(guān)鍵溫度點(diǎn)分別取兩處理上部煙葉第3 葉位各1 片，取葉片中部主脈兩側(cè)5 cm 對(duì)稱0.5 cm×0.5 cm 正方形小塊，立即置于FAA 固定液中固定24 h，采用番紅-固綠染色制作常規(guī)石蠟切片，具體操作參考文獻(xiàn)［12］進(jìn)行。

1.3.4 酶活性與相關(guān)物質(zhì)測(cè)定

采用微量法用酶活性專用試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）測(cè)定酶活性及相關(guān)物質(zhì)含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。從超低溫冰箱（-80 ℃）取出整片煙葉樣品，置于低溫研磨機(jī)中磨粉，根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。采用NBT 法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活性［13］；采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶（POD）活性［13］；采用紫外吸收法測(cè)定過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽還原酶（GR）活性和丙二醛（MDA）含量［14］；采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法測(cè)定膜脂過(guò)氧化物（LPO）含量［15］；采用鄰苯三酚法測(cè)定超氧陰離子（O2-·）產(chǎn)生速率［14］；采用間苯二酚（PAR）比色法測(cè)定過(guò)氧化氫（H2O2）含量［15］；采用FRAP 法測(cè)定總抗氧化能力（T-AOC）［16］。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用SAS 9.4軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用新復(fù)極差法（SSR）進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。采用Excel 2020軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同采烤方式烤后上部煙葉外觀質(zhì)量與圖像特征比較

由表2可知，兩種采烤方式外觀質(zhì)量總分存在顯著差異，帶莖采烤的烤后煙葉外觀質(zhì)量總分為8.13分，顯著高于逐葉采烤煙葉，主要表現(xiàn)在煙葉顏色、結(jié)構(gòu)和身份得分較高。其中，結(jié)構(gòu)和身份得分差異達(dá)到顯著水平。

表3 表明，與逐葉采烤相比，帶莖采烤煙葉黃色面積百分比、L*值和b*值均較高，說(shuō)明帶莖采烤煙葉黃色面積較多、均勻，顏色較鮮亮。而a*值較低，說(shuō)明帶莖采烤煙葉紅色較少。

表3 不同采烤方式上部煙葉的顏色特征值Tab.3 Color characteristic values of upper tobacco leaves harvested and cured by different methods

2.2 不同采烤方式上部煙葉烘烤過(guò)程中葉片組織結(jié)構(gòu)的變化

由圖1 可知，隨著烘烤階段的推進(jìn)，煙葉組織細(xì)胞形態(tài)由完整逐漸消融、皺縮，破壞程度逐漸增大，帶莖采烤煙葉組織細(xì)胞形態(tài)消融、皺縮和被破壞程度滯后逐葉采烤的煙葉。

圖1 不同采烤方式上部煙葉烘烤過(guò)程中煙葉組織結(jié)構(gòu)Fig.1 Microstructure of upper tobacco leaves harvested and cured by different methods during curing progress

在變黃階段干球溫度關(guān)鍵穩(wěn)溫點(diǎn)38 ℃末，兩處理煙葉組織細(xì)胞排列及形態(tài)基本無(wú)差異；在變黃階段40 ℃末，兩處理煙葉柵欄組織和海綿組織均出現(xiàn)略微的皺縮，開始出現(xiàn)差異。帶莖采烤煙葉細(xì)胞液未滲出，而逐葉采烤煙葉則開始出現(xiàn)細(xì)胞液外滲，說(shuō)明變黃階段40 ℃末帶莖采烤煙葉細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)仍保持完整，而逐葉采烤的細(xì)胞膜開始被破壞。在變黃階段42 ℃末，帶莖采烤煙葉組織細(xì)胞液開始出現(xiàn)外滲，而逐葉采烤煙葉組織細(xì)胞膜明顯破損，細(xì)胞液明顯滲外。

在定色階段干球溫度關(guān)鍵穩(wěn)溫點(diǎn)46 ℃末，帶莖采烤煙葉組織細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破損，但仍具備細(xì)胞形態(tài)，而逐葉采烤煙葉部分組織細(xì)胞形態(tài)開始瓦解，出現(xiàn)多個(gè)細(xì)胞粘連，細(xì)胞邊界不清晰；在定色階段50 ℃末，帶莖采烤煙葉組織細(xì)胞出現(xiàn)消融，部分不完整，逐葉采烤煙葉組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)皺縮，無(wú)法分辨，此時(shí)煙葉組織細(xì)胞遭到破壞，說(shuō)明葉片失去生理活性。定色階段54 ℃末，帶莖采烤煙葉組織明顯皺縮，細(xì)胞消融較明顯，仍可觀察到細(xì)胞核及部分細(xì)胞器，逐葉采烤煙葉組織明顯皺縮，細(xì)胞消融明顯，無(wú)法觀察到細(xì)胞器結(jié)構(gòu)。

在干筋階段干球溫度關(guān)鍵穩(wěn)溫點(diǎn)68 ℃末，帶莖采烤煙葉組織細(xì)胞多皺縮在一起，但仍能觀察到組織細(xì)胞排列狀態(tài)，而逐葉采烤煙葉組織細(xì)胞則散亂分布。

總體而言，烘烤過(guò)程中葉片組織細(xì)胞呈現(xiàn)出逐步消融、皺縮、失活、干燥，在定色階段50 ℃末時(shí)煙葉組織細(xì)胞失去完整性和生理活性，而帶莖采烤煙葉組織細(xì)胞完整性較好，消融破壞程度相對(duì)滯后。

2.3 不同采烤方式上部煙葉烘烤過(guò)程中細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化物和活性氧（ROS）的變化

圖2 顯示，隨著烘烤階段的推進(jìn)，煙葉細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化物（LPO）、丙二醛（MDA）含量總體均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，在關(guān)鍵穩(wěn)溫點(diǎn)定色階段46 ℃末均達(dá)到最高。但兩種采烤方式存在一定差異。在烘烤干球溫度關(guān)鍵穩(wěn)溫點(diǎn)，與逐葉采烤相比，在變黃階段38 ℃末時(shí)，帶莖采烤煙葉LPO、MDA含量均較高，在變黃階段40 ℃末、變黃階段42 ℃末、定色階段46 ℃末時(shí)均顯著較低，且在轉(zhuǎn)入定色階段關(guān)鍵穩(wěn)溫點(diǎn)46 ℃末時(shí)，帶莖采烤的LPO 和MDA 含量分別降低21.02%和32.01%。說(shuō)明在烘烤中帶莖采烤煙葉細(xì)胞膜脂過(guò)氧化水平較低，有利于較長(zhǎng)時(shí)間地維持細(xì)胞完整性。

圖2 不同采烤方式上部煙葉烘烤過(guò)程中LPO、MDA和ROS的變化Fig.2 Variations of LPO，MDA and ROS of upper tobacco leaves harvested and cured by different methods during curing progress

H2O2和超O2-·是活性氧的重要組成，隨著烘烤進(jìn)程的推進(jìn)，煙葉H2O2含量、O2-·產(chǎn)生速率總體均呈逐漸升高趨勢(shì)。與逐葉采烤相比，在變黃階段關(guān)鍵穩(wěn)溫點(diǎn)38 ℃末、40 ℃末、42 ℃末時(shí)，帶莖采烤煙葉H2O2含量和O2-·產(chǎn)生速率均較低，且除在變黃階段38 ℃末時(shí)O2-·產(chǎn)生速率差異不顯著，其他差異均達(dá)到顯著水平，這與上述膜脂質(zhì)過(guò)氧化物含量的動(dòng)態(tài)變化一致；而在轉(zhuǎn)入定色階段關(guān)鍵穩(wěn)溫點(diǎn)46 ℃末時(shí)，帶莖采烤煙葉H2O2含量和O2-·產(chǎn)生速率均顯著提高，分別提高28.77%和40.26%。這一發(fā)現(xiàn)與MDA和LPO 含量變化趨勢(shì)相反，說(shuō)明轉(zhuǎn)入定色階段后帶莖采烤煙葉清除活性氧能力減弱或滯后，造成活性氧的積累。

2.4 不同采烤方式上部煙葉烘烤過(guò)程中抗氧化酶活性的變化

圖3 所示，隨著烘烤階段的推進(jìn)，兩處理煙葉SOD 活性變化規(guī)律整體表現(xiàn)不同。其中，帶莖采烤的呈先下降再上升又快速下降的趨勢(shì)，而逐葉采烤的則一直呈下降趨勢(shì)，兩處理在轉(zhuǎn)入定色階段關(guān)鍵穩(wěn)溫點(diǎn)46 ℃末時(shí)降低到同一水平。在變黃階段關(guān)鍵穩(wěn)溫點(diǎn)除38 ℃末時(shí)，帶莖采烤煙葉SOD活性顯著低于逐葉采烤的，變黃階段40 ℃末和42 ℃末時(shí)，帶莖采烤煙葉SOD 活性均顯著高于逐葉采烤的，分別提高32.54%和46.61%。

圖3 不同采烤方式上部煙葉烘烤過(guò)程中抗氧化酶活性的變化Fig.3 Variations of antioxidant enzyme activities of upper tobacco leaves harvested and cured by different methods during curing progress

兩處理煙葉CAT活性總體呈現(xiàn)先升高再降低的變化趨勢(shì)。帶莖采烤煙葉在變黃階段關(guān)鍵穩(wěn)溫點(diǎn)40 ℃末時(shí)達(dá)到高峰，為382.90 U/g，且比逐葉采烤提高27.82%；逐葉采烤的在變黃階段42 ℃末時(shí)達(dá)到高峰，為373.46 U/g，且顯著高出帶莖采烤17.27%，在定色階段關(guān)鍵穩(wěn)溫點(diǎn)46 ℃末時(shí)達(dá)到最低，且顯著低于帶莖采烤26.63%。

隨著烘烤階段的推進(jìn)，帶莖采烤煙葉GR 活性呈現(xiàn)逐步升高又降低趨勢(shì)，在變黃階段關(guān)鍵穩(wěn)溫點(diǎn)42 ℃末時(shí)達(dá)到高峰，而逐葉采烤的GR 活性呈慢-快-慢升高趨勢(shì)，在定色階段關(guān)鍵穩(wěn)溫點(diǎn)46 ℃末時(shí)達(dá)到最高。在變黃階段關(guān)鍵穩(wěn)溫點(diǎn)38 ℃末、40 ℃末、42 ℃末時(shí)，帶莖采烤煙葉GR 活性均顯著高于逐葉采烤煙葉，在轉(zhuǎn)入定色階段關(guān)鍵穩(wěn)溫點(diǎn)46 ℃末時(shí)，低于逐葉采烤45.49%，此時(shí)兩處理差異最大。這一變化趨勢(shì)與H2O2含量和O2-·產(chǎn)生速率恰好相反，意味著GR 可能在H2O2和O2-·的清除中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

隨著烘烤階段的推進(jìn)，兩處理煙葉T-AOC 總體呈逐步上升趨勢(shì)。與逐葉采烤相比，帶莖采烤煙葉抗氧化酶活性總體較高，且在烘烤關(guān)鍵穩(wěn)溫點(diǎn)變黃階段40 ℃末、定色階段46 ℃末差異達(dá)到顯著水平，說(shuō)明帶莖采烤煙葉抗氧化能力較強(qiáng)。

3 討論

烤煙上部煙帶莖采烤和逐葉采烤處理烤后煙葉外觀質(zhì)量特征和圖像特征分析表明，上部煙帶莖采烤煙葉外觀質(zhì)量好于逐葉采烤，帶莖采烤煙葉圖像特征L*值、b*值均高于逐葉采烤，這與已有研究報(bào)道結(jié)果一致［4，17-18］。在煙葉烘烤過(guò)程中，葉片組織細(xì)胞逐步消融、失活和干燥，在定色階段50 ℃末，帶莖采烤煙葉片組織細(xì)胞出現(xiàn)消融、部分不完整，這有利于葉片組織細(xì)胞完整性保持較長(zhǎng)時(shí)間，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞滯后。這與劉朝營(yíng)等［19］研究結(jié)果基本一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了上部煙帶莖采烤中煙葉細(xì)胞抗氧化能力較強(qiáng)，有利于保持葉片組織細(xì)胞生理活性［9-11］。

植物葉片中參與氧化、抗氧化活動(dòng)的酶類較多，煙草上SOD、CAT 和GR 3 種抗氧化酶研究較多［20-22］。其中，SOD廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，且是體內(nèi)清除活性氧的第一防線，可催化超氧化物的歧化反應(yīng)，在逆境脅迫條件下增強(qiáng)植物的耐受能力［23］。本研究中的SOD 活性變化趨勢(shì)與Siddiqui等［24］對(duì)大豆高溫脅迫下的研究結(jié)果一致，在大豆中研究發(fā)現(xiàn)輕度高溫脅迫下葉片SOD 活性增強(qiáng)，但不同品種對(duì)脅迫的響應(yīng)不一致。持續(xù)高溫下SOD出現(xiàn)持續(xù)下降的現(xiàn)象，原因在于高溫破壞了SOD 的構(gòu)象。在干旱、光照、重金屬及高滲透壓等逆境條件下，植物體內(nèi)CAT 的表達(dá)量及活性都有所提高［25］，說(shuō)明CAT在植物抗逆方面發(fā)揮著重要作用。而煙葉烘烤也是在人為提供較高溫度的脅迫條件下進(jìn)行的，本研究中帶莖采烤煙葉3種抗氧化酶活性在變黃階段總體高于逐葉采烤且差異達(dá)到顯著水平。MDA是一類重要的LPO，其含量常被用來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞的消融破裂程度［26］。本研究中發(fā)現(xiàn)帶莖采烤煙葉MDA 和LPO 含量始終低于逐葉采烤，H2O2和O2-·兩種重要的活性氧成分含量和產(chǎn)生速率與膜脂過(guò)氧化狀態(tài)密切相關(guān)，高濃度的活性氧會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜過(guò)氧化，促進(jìn)MDA 的積累，過(guò)高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡［27］。本研究中還發(fā)現(xiàn)帶莖采烤定色階段46 ℃末H2O2含量和O2-·產(chǎn)生速率均高于逐葉采烤，且GR 活性高低變化趨勢(shì)與H2O2含量、O2-·產(chǎn)生速率相反，說(shuō)明GR 是影響H2O2和O2-·清除的關(guān)鍵酶之一，深入研究煙葉烘烤中活性氧和酶活性有利于探明煙葉烘烤中品質(zhì)形成的代謝生理基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

上部煙帶莖采烤和逐葉采烤煙葉外觀質(zhì)量以及烘烤中葉組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和抗氧化能力存在差異。與逐葉采烤相比，帶莖采烤煙葉外觀質(zhì)量較好，顏色黃色面積、L*值和b*值較高；在烘烤過(guò)程中煙葉細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性維持時(shí)間較長(zhǎng)。在變黃階段煙葉抗氧化酶活性較高，活性氧清除能力較強(qiáng)，細(xì)胞過(guò)氧化程度較低，有利于保持煙葉細(xì)胞生理活性，促進(jìn)物質(zhì)轉(zhuǎn)化，煙葉顏色變淺，上部煙葉的可用性得到改善。