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        基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 的經(jīng)典名方溫膽湯化學(xué)成分分析

        2024-03-14 11:09:26張奎斌邢斌宋紋王仁興張青青劉志東皮佳鑫

        張奎斌,邢斌,宋紋,王仁興,張青青,劉志東,皮佳鑫

        (1.天津中醫(yī)藥大學(xué)組分中藥國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 301617;2.天津中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程中心,天津 301617;3.天津宏仁堂藥業(yè)有限公司,天津 301617)

        溫膽湯源于北周名醫(yī)姚僧垣所撰《集驗(yàn)方》,始見于唐代孫思邈《急備千金要方》,謂:“治大病后,虛煩不得眠,此膽寒故也,宜服溫膽湯?!薄豆糯?jīng)典名方目錄(第一批)》中:溫膽湯由半夏二兩、竹茹二兩、枳實(shí)各二兩,橘皮三兩,生姜四兩,甘草一兩組成。現(xiàn)代臨床在該方基礎(chǔ)上進(jìn)行加減裁化以用于治療失眠、高血壓、冠心病、抑郁、精神失常等疾病,效果顯著[1-4]。目前關(guān)于溫膽湯的作用機(jī)制研究報(bào)道較多[5-6],但其物質(zhì)基礎(chǔ)并不明確,且多從單味藥入手,未考慮到復(fù)方煎煮過程的損失與新成分的生成,缺乏復(fù)方系統(tǒng)性研究。此外溫膽湯成分復(fù)雜,給其質(zhì)量控制帶來一定困難。因此,明確溫膽湯化學(xué)成分對其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及進(jìn)一步對其作用機(jī)制的闡明、質(zhì)量控制尤為必要。超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法(UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS)具有“三高”(高效率、高靈敏度、高分辨率)的特點(diǎn),通過化合物精確的分子量、元素組成以及質(zhì)譜碎片等信息,可快速確定化合物的結(jié)構(gòu)。本文采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 技術(shù)對溫膽湯的成分進(jìn)行分析。根據(jù)精確的分子量信息及質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行解析,并與對照品對照或參考相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫,從而對溫膽湯中化合物進(jìn)行鑒定。

        1 儀器與試劑

        1.1 儀器 UltiMate 3000 超高效液相色譜儀,美國Thermo 公司;Q-Exactive Orbitrap 質(zhì)譜,美國Thermo公司;Xcalibur 3.0 工作站,美國Thermo 公司;AX224ZH 萬分之一電子天平,天津奧豪斯儀器有限公司;AX205 十萬分之一天平,瑞士Mettler Toledo公司;Milli-Q 去離子水機(jī),美國Millipore 公司;FDU-2100 冷凍干燥儀,東京理化器械株;N-10000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海愛朗琴儀器有限公司。

        1.2 試劑 甘草飲片(批號:202001019,產(chǎn)地內(nèi)蒙古)、竹茹飲片(批號:202001005,產(chǎn)地江西)、枳實(shí)飲片(批號:202001007,產(chǎn)地湖南)、陳皮飲片(批號:202001011-1,產(chǎn)地湖北)、生姜飲片(批號:190301-3,產(chǎn)地河北)、半夏飲片(批號:181209,產(chǎn)地甘肅)。上述飲片均由天津宏仁堂藥業(yè)有限公司提供,均符合《中國藥典》2020 年版一部有關(guān)規(guī)定。甘草酸(上海源葉生物科技有限公司,批號:Y02J11L113432,純度≥98%);枸橘苷(成都瑞芬思生物科技有限公司,批號:G-019-171216,純度≥98%);新橙皮苷(上海源葉生物科技有限公司,批號:231J6L2067,純度≥98%);柚皮苷(四川維克奇有限公司,批號:wkq20020603,純度≥98%);圣草次苷(上海源葉生物有限公司, 批號:M17D9S77644,純度≥98%);蕓香柚皮苷(上海源葉生物科技有限公司,批號:P25J9L66554,純度≥98%);甘草苷(上海源葉生物科技有限公司,批號:213J11X108109,純度≥98%);橘皮素(天津中新藥業(yè)有限公司,批號:W14-1-2,純度≥98%);甘草素(上海源葉生物科技有限公司,批號:C26A10Q87049,純度≥98%);橙皮苷(上海源葉生物科技有限公司,批號:K09S11L123847,純度≥98%);辛弗林(中國食品藥品鑒定研究院,批號:110727-201107,純度≥99.4%);腺苷(天津中新藥業(yè)有限公司,批號:W17-0-9,純度≥98%);芹糖甘草苷(NATURE,批號:120926-46-7,純度≥98%);野漆樹苷(中國食品藥品鑒定研究院,批號:111919-201804,純度≥95.5%)異甘草素(天津中新藥業(yè)有限公司,批號:W05-1-3,純度≥98%);甲醇(色譜純,美國Fisher公司);乙腈(色譜純,美國Fisher 公司);甲酸(質(zhì)譜級,東京化學(xué)工業(yè)有限公司)。

        2 方法

        2.1 檢測條件

        2.1.1 色譜條件 色譜柱:Waters Acquity BEH C18(2.1×100 mm,1.7 μm)流動相:0.1%甲酸水(A)-乙腈(B),洗脫梯度(0~3 min,95%~86% A;3~7 min,86%~83% A;7 ~13 min,83%~75% A;13 ~15 min,75%~60% A;15~20 min,60%~20% A;20~22 min,20%~0%A;22.01~25 min,95%~95%A),進(jìn)樣量2 μL,柱溫30 ℃,流速0.3 mL/min。

        2.1.2 質(zhì)譜條件 加熱電噴霧離子源(HESI),正、負(fù)離子模式檢測,鞘氣流速35 L/min,輔助氣流速10 L/min,噴霧電壓分別為3.00 kV,毛細(xì)管溫度320 ℃,輔助器溫度350 ℃;掃描模式為Full MS/dd-MS2,掃描范圍m/z 100~1500,碰撞能量20/30/40 eV。

        2.2 對照品溶液的制備

        2.2.1 單一對照品母液的配制 精密稱取以下對照品,分別置于10 mL 容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度:蕓香柚皮苷5.58 mg、辛弗林5.37 mg、橘皮素5.81 mg、新橙皮苷3.02 mg、甘草酸6.14 mg、甘草素6.48 mg、甘草苷5.41 mg、香蜂草苷5.92 mg、圣草次苷5.73 mg、枸橘苷5.44 mg、柚皮苷5.04 mg、腺苷2.15mg。另精密稱取橙皮苷8.04 mg、芹糖甘草苷2 mg、野漆樹苷5.90 mg 置于25mL 容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度。

        2.2.2 混合對照品溶液的配制 精密量取蕓香柚皮苷、辛弗林、橘皮素、甘草酸、甘草素、甘草苷、香蜂草苷、圣草次苷、枸橘苷、柚皮苷、橙皮苷、野漆樹苷對照品母液1 mL,新橙皮苷、腺苷、芹糖甘草苷母液對照品2 mL 置于同一100 mL 容量瓶中,加甲醇定容。

        2.3 樣品制備

        2.3.1 溫膽湯干膏粉制備 根據(jù)《經(jīng)典名方開發(fā)指引》一書劑量換算,一兩折算成3 g,一升折合200 mL。此外,根據(jù)處方考證確定溫膽湯的制備工藝為稱取半夏飲片6 g,枳實(shí)飲片6 g,竹茹飲片6 g,陳皮飲片9 g,生姜飲片12 g,甘草飲片3 g,加水1 600 mL,煎煮至約400 mL,200 目紗布過濾,以60 ℃水浴減壓濃縮至微黏稠狀態(tài),置于-80 ℃冰箱預(yù)凍,再置于FDU-2100 冷凍干燥機(jī)干燥24 h,干燥后研磨得到溫膽湯干膏粉。溫膽湯各單味藥干膏粉均以此法制備。

        2.3.2 供試品溶液制備 精密稱定0.25 g 溫膽湯干膏粉及各單味藥干膏粉分別置于50 mL 具塞錐形瓶中,精密加入25 mL 50%甲醇,以320 W 功率超聲處理45 min。取1 mL 上清液加入3 mL 50%甲醇稀釋,渦旋1 min。將稀釋后的樣品以12 000 rpm離心15 min 取上清即可。

        2.4 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)一級質(zhì)譜提供的精確的相對分子質(zhì)量,采用Xcalibar 3.0 軟件計(jì)算可能的分子式(誤差范圍±5.0 ppm),將未知化合物的二級碎片離子與對照品、PubChem、Mass Bank、HMDB 以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道提供的裂解碎片進(jìn)行比對,進(jìn)一步確定未知化合物的分子式及結(jié)構(gòu),并根據(jù)二級質(zhì)譜碎片推導(dǎo)化合物的質(zhì)譜裂解途徑。

        3 結(jié)果

        3.1 色譜峰鑒定 采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 對供試品溶液進(jìn)行分析,得到正、負(fù)離子模式下的TIC(總離子流圖),見圖1。通過分析準(zhǔn)分子離子峰、碎片離子信息,結(jié)合對照品和文獻(xiàn)報(bào)道以及相關(guān)數(shù)據(jù)庫,共鑒別了121 個(gè)成分,包括70 個(gè)黃酮類成分,18 個(gè)香豆素類成分,9 個(gè)皂苷類成分,10 個(gè)生物堿類成分、3 個(gè)苯丙素類成分以及11 個(gè)其他類化合物。其中,15 個(gè)成分通過與對照品比對后確認(rèn)。此外,對成分進(jìn)行了單味藥歸屬。表1 結(jié)果見開放科學(xué)(資源服務(wù))標(biāo)識碼(OSID)。

        圖1 溫膽湯的TIC 圖

        3.2 主要化合物分析鑒定

        3.2.1 黃酮類成分 溫膽湯的黃酮類成分主要為游離的黃酮和黃酮苷以及少量的黃酮醇、查爾酮,且大部分來源于枳實(shí)與陳皮。其中黃酮苷類成分多為雙糖苷,多存在同分異構(gòu)體,如柚皮苷與蕓香柚皮苷、橙皮苷與新橙皮苷、枸橘苷與新枸橘苷等。黃酮苷類成分多先裂解糖苷鍵,脫去糖基變成游離的黃酮。糖基可逐漸脫去,亦可整體脫去。游離的黃酮母核C 環(huán)易發(fā)生RDA(麥?zhǔn)现嘏牛┝呀鈴亩纬梢幌盗刑卣餍噪x子碎片。此外帶有甲氧基的黃酮可失去甲基,繼而再失去羰基。例如44 號峰,在正離子模式下,其準(zhǔn)分離子峰的m/z 為611.196 9[M+H]+,誤差為-0.240 ppm,推測其分子式為C28H34O15。其準(zhǔn)分子離子峰發(fā)生中性丟失,丟失1 分子葡萄糖得到m/z 449.1433 1 碎片離子,再丟失1 分子鼠李糖得到m/z 303.086 49 的黃酮苷元,亦可直接從準(zhǔn)分子離子峰脫去雙糖基得到該離子碎片。該離子碎片帶有甲氧基,丟失1 分子甲基,得到m/z 286.047 76 離子碎片,從而發(fā)生RAD 裂解,C 環(huán)裂解得到m/z 195.028 96 碎片和m/z 153.018 39 碎片。m/z 195.028 96 離子碎片具有鄰二酚羥基,可脫去1 分子H2O,得到m/z 177.054 84。該峰特征碎片信息與橙皮苷對照品基本相同,且其保留時(shí)間基本一致,故可鑒定該峰為橙皮苷。見圖2。

        圖2 橙皮苷的質(zhì)譜裂解途徑

        3.2.2 香豆素類成分 溫膽湯的香豆素類成分主要為簡單香豆素類與呋喃香豆素類。簡單香豆素易失去CO 形成苯駢呋喃離子碎片。此外,若是在6 或7 位碳原子具有甲氧基亦可失去甲基。呋喃香豆素的裂解規(guī)律亦是如此。如68 號峰,其準(zhǔn)分子離子峰為m/z 193.049 79[M+H],推測其分子式為C10H8O4,誤差為0.284 ppm。該準(zhǔn)分子離子峰可先丟失1 分子甲基得到m/z 178.026 20 碎片離子,亦可先丟失1分子CO 得到m/z 165.054 76 苯駢呋喃離子,由于環(huán)內(nèi)含氧可繼續(xù)丟失CO,得到m/z 133.028 63 碎片離子,再丟失1 分子甲基得到m/z 118.034 81 碎片離子。與文獻(xiàn)中東莨菪內(nèi)酯質(zhì)譜二級碎片信息基本一致,故可鑒定68 號峰為東莨菪內(nèi)酯,見圖3。

        圖3 東莨菪內(nèi)酯質(zhì)譜裂解途徑

        3.2.3 皂苷類成分 溫膽湯的皂苷類成分,大多來源于甘草。以88 號峰為例闡述皂苷類成分結(jié)構(gòu)鑒定過程。在正離子模式下,該化合物的準(zhǔn)分子離子峰m/z 823.410 30[M+H]+,推測出分子式為C42H62O16,誤差為-0.950 ppm。該化合物依次脫去1 分子葡萄糖先后得到m/z 647.379 46 碎片離子與m/z 471.346 86 苷元離子,該碎片脫去1 分子H2O,得到m/z 453.336 64 碎片離子,再進(jìn)行RDA 裂解,得到m/z 261.112 34 碎片離子。此外通過與甘草酸對照品比對,該峰鑒定為甘草酸,見圖4。

        圖4 甘草酸的質(zhì)譜裂解途徑

        3.2.4 生物堿類成分 溫膽湯的生物堿類成分主要來源于枳實(shí)與陳皮。鑒于枳實(shí)和陳皮中均含有辛弗林,且辛弗林為枳實(shí)的質(zhì)量控制成分,因此以辛弗林為例解析其裂解規(guī)律。在正離子模式下,生物堿類成分響應(yīng)較高,其準(zhǔn)分子離子峰為m/z 168.102 10[M+H]+,脫去1 分子H2O 得到m/z 150.091 54 碎片離子,該碎片為仲胺離子可丟失1 分子甲基或丟失1 分子C2H5N,得到m/z 135.068 10 碎片離子和m/z 107.049 58 碎片離子。m/z 135.068 10 碎片亦可發(fā)生雙鍵斷裂丟失1 分子C=NH2得到m/z 107.049 58 碎片離子。該碎片脫去1 分子H2O 發(fā)生β 裂解,經(jīng)重排生成穩(wěn)定的卓鎓離子m/z 91.054 80。此外m/z135.068 10 碎片也可丟去1 分子NH3得到m/z 119.049 42 碎片離子,見圖5。

        圖5 辛弗林的質(zhì)譜裂解途徑

        4 討論

        實(shí)驗(yàn)前期采用不同的梯度洗脫條件,考察了不同比例的甲酸水以及不同有機(jī)相的分離效果,發(fā)現(xiàn)在現(xiàn)用的洗脫梯度下,0.1%甲酸水-乙腈作為流動相具有較好的峰形和分離度。

        實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明溫膽湯主要成分為黃酮成分,其次是香豆素類成分、皂苷類成分以及生物堿。這些成分主要來源于枳實(shí)、陳皮與甘草。而半夏、生姜、竹茹鑒定出的成分較少。一則可能是藥物煎煮時(shí)間過長,導(dǎo)致相關(guān)成分發(fā)生降解。例如2020 版《中國藥典》規(guī)定的生姜含量測定成分6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚均未在溫膽湯中檢出,但能檢測出6-姜烯酚。有文獻(xiàn)報(bào)道長時(shí)間的加熱,6-姜辣素會轉(zhuǎn)化為6-姜烯酚[36]。二則存在一些未鑒定出的化合物,還有待以后深入研究。

        本實(shí)驗(yàn)利用UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 技術(shù)對溫膽湯進(jìn)行快速分析。根據(jù)化合物的精確相對分子質(zhì)量、二級碎片峰信息,通過參考相關(guān)文獻(xiàn)、成分質(zhì)譜裂解規(guī)律以及與對照品比對,鑒定出溫膽湯中121 個(gè)成分,為溫膽湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)深入研究、闡明其作用機(jī)制、質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。然而,本實(shí)驗(yàn)仍有不足之處,生姜、半夏、竹茹鑒定出的成分較少,且黃酮類成分占比居多。此外,鑒定出的化合物存在同分異構(gòu)體形式,僅部分通過對照品確認(rèn),需進(jìn)一步借助核磁技術(shù)進(jìn)行鑒別和確認(rèn)。

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