齊育麟，白立鼎，邱先哲，司雨萌，李琳，王炎炎，陳璐，李玉紅，

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)組分中藥國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617）

心肌梗死（MI，以下簡稱心梗），是一種嚴(yán)重的冠心病類型，其主要特點(diǎn)是心肌因缺血而無法獲得足夠的氧氣而導(dǎo)致的心肌壞死[1]。心肌梗死會(huì)造成多種并發(fā)癥，包括心力衰竭、休克、心臟破裂等[2]。據(jù)《中國心血管健康與疾病報(bào)告2021》顯示，心梗死亡率仍處于高位，每年有16.7%的心梗患者由于心力衰竭而再次入院，現(xiàn)已成為危害人類健康的重大衛(wèi)生問題[3]。

淋巴管新生是心臟健康的重要組成部分，在修復(fù)心肌梗死造成的心肌水腫、炎癥、纖維化中發(fā)揮著重要作用[4]。有研究表明，MI 后增強(qiáng)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子受體3（VEGFR3）的表達(dá)能夠促進(jìn)淋巴管新生，并通過引流梗死區(qū)域的組織間液來減輕心臟水腫，進(jìn)而改善心功能[5]。此外，盡管中藥在治療MI 方面顯示出潛在的優(yōu)勢，但是關(guān)于中藥通過促進(jìn)淋巴管新生有益于MI 后心臟功能恢復(fù)的研究報(bào)道仍然較少。因此，本研究擬通過生物信息學(xué)分析，鑒定MI 患者中與淋巴管新生相關(guān)的關(guān)鍵基因，分析這些基因參與的生物途徑，并利用機(jī)器學(xué)習(xí)方法篩選出核心基因。通過對核心基因和相關(guān)中藥的關(guān)聯(lián)分析，旨在為基于淋巴管新生治療MI 的中藥研究及臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)篩選與預(yù)處理 在GEO 數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nim.nih.gov/geo/）中以“myocardial infarction”為關(guān)鍵詞檢索相關(guān)數(shù)據(jù)集，根據(jù)數(shù)據(jù)集提供的相關(guān)信息，獲得所需芯片GSE66360 作為訓(xùn)練集。GSE66360 共有99 個(gè)樣品，其中包括了49 個(gè)MI 患者與50 個(gè)健康人樣品。選取GSE48060 作為驗(yàn)證集，GSE48060 共有52 個(gè)樣品，其中包括了31 個(gè)MI患者與21 個(gè)健康人樣品。注釋數(shù)據(jù)后通過“l(fā)imma”包對GSE66360 與GSE48060 中的表達(dá)譜基因進(jìn)行差異化分析，同時(shí)根據(jù)|log2FC|＞1&FDR＜0.05 對于基因進(jìn)行差異化篩選，得到差異表達(dá)譜文件diffGeneExp。使用在線生物信息學(xué)分析工具HIPLOT 網(wǎng)站（http：//hiplot.com.cn）對diffGeneExp進(jìn)行基因聚類可視化分析。

1.2 淋巴管新生相關(guān)基因的篩選 在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（http：//www.genecards.org）中以“l(fā)ymphangiogenesis”為關(guān)鍵詞檢索相關(guān)基因構(gòu)建淋巴管新生基因庫，利用“tidyverse”包將diffGeneExp 與淋巴管新生數(shù)據(jù)庫取交集，得到心梗-淋巴管新生DEGs 集。

1.3 Metascape 分析 利用Metascape 基因功能分析數(shù)據(jù)庫（http：//www.metascape.org）將心梗-淋巴管新生DEGs 進(jìn)行初步的功能與通路分析。

1.4 功能富集分析 對于心梗-淋巴管新生DEGs進(jìn)行GO 與KEGG 富集分析，使用“org.Hs.eg.db”包對于DEGs 進(jìn)行GO 與KEGG 注釋，使用在線生物信息學(xué)分析工具HIPLOT 網(wǎng)站對注釋信息進(jìn)行富集分析。

1.5 GSEA 富集分析 利用“l(fā)imma”“org.Hs.eg.db”“clusterProfiler”與“enrichPlot”包對GSE66360 數(shù)據(jù)集進(jìn)行GSEA 富集分析，以FDR＜0.05 篩選在正常人與MI 患者中表達(dá)最顯著的前5 條通路。

1.6 Lasso 回歸篩選特征基因 利用“glmnet”包進(jìn)行Lasso 回歸分析，選擇交叉誤差最小的點(diǎn)篩選心梗-淋巴管新生DEGs 中的特征基因。

1.7 SVM-RFE 機(jī)器學(xué)習(xí)篩選特征基因 利用“e1701”，“kernlab”與“caret”包對心梗-淋巴管新生DEGs 進(jìn)行機(jī)器學(xué)習(xí)，使用“svmRadial”方法選擇交叉驗(yàn)證誤差最小的點(diǎn)篩選特征基因。

1.8 交集特征基因的提取 分別提取Lasso 回歸分析與SVM-RFE 機(jī)器學(xué)習(xí)中的特征基因，利用在線生物信息學(xué)分析平臺(tái)微生信（http：//www.bioinformatics.com）取二者交集構(gòu)建特征基因集并進(jìn)行可視化。

1.9 繪制受試者工作特征（ROC）曲線 利用“pROC”包繪制每個(gè)特征基因的ROC 曲線，判斷特征基因在MI 中的預(yù)測診斷能力，以ROC 曲線下面積（AUC）＞0.8 進(jìn)行篩選，得到預(yù)測診斷效果較好的基因。

1.10 二次驗(yàn)證與相關(guān)性分析 利用“l(fā)imma”包與“ggpubr”包對MI 相關(guān)的驗(yàn)證集GSE48060 中基因表達(dá)譜進(jìn)行差異化分析并與預(yù)測診斷效果較好的基因進(jìn)行二次驗(yàn)證，構(gòu)建核心基因集。此外，利用“corrplot”與“circlize”包對核心基因集進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.11 免疫細(xì)胞浸潤分析 基于CIBERSORT 算法，按照P＜0.05 的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算22 種免疫細(xì)胞在GSE66360數(shù)據(jù)集樣本中的占比情況，對MI 患者及健康人血液樣本中的免疫細(xì)胞進(jìn)行差異分析，并用“reshape2”，“ggpubr”與“ggplot2”包對結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.12 驗(yàn)證核心基因與免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析 利用“l(fā)imma”，“reshape2”，“tidyverse”與“ggplot2”包將核心基因與免疫細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.13 心梗-淋巴管新生DEGs 的中藥篩選 將核心基因作為預(yù)測靶標(biāo)，在醫(yī)學(xué)本體信息檢索數(shù)據(jù)庫（https：//coremine.com）中篩選對各預(yù)測靶標(biāo)具有生物學(xué)效應(yīng)的前5 位中藥，并進(jìn)行四氣五味、歸經(jīng)分析。

2 結(jié)果

2.1 心梗-淋巴管新生DEGs 的篩選 研究設(shè)計(jì)如圖1 所示，從GEO 數(shù)據(jù)庫中下載GSE66360 作為訓(xùn)練集，GSE48060 作為驗(yàn)證集開展實(shí)驗(yàn)。用“l(fā)imma”包篩選訓(xùn)練集中心梗患者血液樣品中的差異基因，共得到390 個(gè)差異基因，其中80 個(gè)上調(diào)基因與310個(gè)下調(diào)基因（圖2A）。從GeneCards 數(shù)據(jù)庫下載與淋巴管新生相關(guān)的數(shù)據(jù)集，并與訓(xùn)練集中的差異基因取交集，共得到26 個(gè)在心梗患者血液中與淋巴管新生存在聯(lián)系的差異基因，構(gòu)建心梗-淋巴管新生DEGs 集（圖2B）。并對心梗-淋巴管新生DEGs 集進(jìn)行基因相關(guān)性分析，結(jié)果顯示除XIST 外，其他基因均表現(xiàn)出不同程度的協(xié)同作用（圖2C）。

圖1 研究設(shè)計(jì)示意圖

圖2 差異基因篩選

2.2 Metascape 分析 如圖3 所示，將26 個(gè)心梗-淋巴管新生DEGs 輸入Metasacpe，對基因的生物學(xué)功能進(jìn)行初步分析，發(fā)現(xiàn)差異基因主要參與了白介素信號(hào)通路、脂多糖反應(yīng)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、肺纖維化與一氧化氮合成等生物學(xué)過程。

圖3 Metascape 分析

2.3 功能富集分析 為進(jìn)一步探究心梗-淋巴管新生DEGs 的生物學(xué)功能，對26 個(gè)差異基因進(jìn)行GO與KEGG 富集分析。GO 結(jié)果顯示，在生物過程中這些基因主要參與一氧化氮生物合成、脂多糖反應(yīng)等方面。在細(xì)胞組分中與三級(jí)顆粒腔、血小板a 顆粒腔、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔顯著相關(guān)。在分子功能中與細(xì)胞因子活性、配體結(jié)合活性、黏多糖結(jié)合等生物學(xué)功能相關(guān)（圖4A）。KEGG 富集分析結(jié)果，DEGs 參與了瘧疾（Malaria）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）、核因子κB（NF-κB）、腫瘤壞死因子（TNF）、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥狀硬化（Lipid and atherosclerosis）等信號(hào)通路（圖4B）。

2.4 GSEA 分析 如圖5A、5B 所示，為探究MI 患者與健康人的差異生物學(xué)功能，對GSE66360 進(jìn)行GSEA 分析，結(jié)果顯示正常人的基因集涉及分子功能與生物學(xué)過程主要包括了趨化因子信號(hào)通路、補(bǔ)體與凝血信號(hào)通路、細(xì)胞因子-受體相互作用通路，而MI 患者基因集涉及分子功能與生物學(xué)過程主要包括了N 聚糖生物合成信號(hào)通路、核苷酸切割修復(fù)信號(hào)通路、免疫缺陷等信號(hào)通路。

圖5 GSEA 分析

2.5 機(jī)器學(xué)習(xí)模型與關(guān)鍵基因篩選 為了評(píng)價(jià)心梗-淋巴管新生DEGs 的診斷潛力，分別用Lasso 回歸與SVM-REF 機(jī)器學(xué)習(xí)的方法對心梗-淋巴管新生DEGs 進(jìn)行篩選，以均方誤差最小時(shí)為最佳診斷模型，可見Lasso 回歸分析篩選得到15 個(gè)基因構(gòu)成的診斷模型（圖6A）。SVM-RFE 算法共篩選出了28 個(gè)特征基因（圖6B），將Lasso 與SVM-RFE 算法得到的特征基因取交集，共鑒定出15 種特征基因（ADM、AREG、CEBPD、EDN1、EPAS1、IL1B、IL1RN、PELI1、PFKFB3、PLAU、SULF2、THBS1、TNF、TNFAIP6、XIST）用于后續(xù)分析（圖6C）。

圖6 機(jī)器學(xué)習(xí)模型與關(guān)鍵基因篩選

2.6 二次驗(yàn)證與相關(guān)性分析 如圖7A 所示，對上述的15 個(gè)特征基因繪制ROC 曲線，以ROC 曲線下面積＞0.8 進(jìn)行篩選共得到了11 個(gè)預(yù)測診斷基因（ADM、AREG、EDN1、EPAS1、IL1B、IL1RN、PELI1、PFKFB3、PLAU、SULF2、THBS1）。此外，對驗(yàn)證集GSE48060 表達(dá)譜進(jìn)行基因差異化分析，與11 個(gè)預(yù)測診斷基因進(jìn)行對比，最終得到了4 個(gè)在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中均具有預(yù)測診斷價(jià)值的核心基因（ADM、IL1B、IL1RN、PFKFB3）（圖7B）。并對這4 個(gè)核心基因進(jìn)行基因間相關(guān)性分析，結(jié)果顯示4 個(gè)基因均呈正相關(guān)（圖7C）。

圖7 二次驗(yàn)證與相關(guān)性分析

2.7 免疫浸潤分析 如圖8 所示，對GSE66360 數(shù)據(jù)集進(jìn)行免疫浸潤分析，結(jié)果顯示與健康人相比，MI 患者血液樣品中含更高的濾泡輔助性T 細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞、靜息NK 細(xì)胞、活化的NK 細(xì)胞、單核細(xì)胞、M2 型巨噬細(xì)胞、活化的樹突狀細(xì)胞、活化的肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞與中性粒細(xì)胞，與此同時(shí)，MI 患者的CD8T 細(xì)胞、CD4 記憶T 細(xì)胞、γδT 細(xì)胞與M0 巨噬細(xì)胞的數(shù)量顯著下降。

圖8 心梗的免疫浸潤分析

2.8 核心基因與免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析 如圖9所示，通過對免疫細(xì)胞與核心基因進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示PFKFB3 與調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)；IL1RN、IL1B 與活化肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、活化NK 細(xì)胞等免疫細(xì)胞呈正相關(guān)，而與CD4 記憶T 細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)。此外，ADM 基因高表達(dá)時(shí)，活化肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞與嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量也會(huì)同時(shí)增多。

圖9 淋巴管新生與免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析

2.9 核心基因的中藥篩選 經(jīng)過篩選共得到了18味中藥（圖10A）。四氣五味、歸經(jīng)分析結(jié)果顯示，藥物四氣多為寒、溫，五味多屬苦、甘、辛，歸經(jīng)主要集中于肺、腎、脾經(jīng)（圖10 B、10C、10D）。

圖10 中藥篩選與分類分析

3 討論

MI 是由動(dòng)脈斑塊引起進(jìn)入心臟的攜氧血液減少而導(dǎo)致的缺氧性心肌損傷，常伴隨著炎癥、水腫與心肌纖維化，其臨床表現(xiàn)為胸痛、呼吸急促、出汗、心臟跳動(dòng)異常等[6]。盡管近年來在MI 治療方面取得了進(jìn)展，如連續(xù)藥物治療、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入手術(shù)治療等，但MI 發(fā)病率和死亡率仍處于高位。因此尋找新的治療方式，特別是治療靶點(diǎn)，對預(yù)防疾病的進(jìn)一步發(fā)展具有重要意義[7]。

淋巴管系統(tǒng)幾乎滲透到所有組織與器官，在維持間質(zhì)體液穩(wěn)態(tài)與免疫監(jiān)控中發(fā)揮著重要作用[8]。近年來，越來越多的證據(jù)表明淋巴管新生在修復(fù)心肌梗死造成的心臟損傷中發(fā)揮著重要的作用。心肌梗死后滲出的炎性細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子VEGF-C 與VEGF-D，使附近淋巴管中的VEGFR表達(dá)增多，促進(jìn)梗死邊緣區(qū)與梗死區(qū)的淋巴管新生，引流梗死區(qū)的組織間液，排出缺氧后的組織代謝產(chǎn)物，緩解心臟水腫，改善心臟功能[9]。在本研究中，GO富集分析顯示交集基因主要與一氧化氮合成、脂多糖反應(yīng)等生物學(xué)功能相關(guān)。KEGG 富集分析結(jié)果顯示基于淋巴管新生治療MI 可能與瘧疾、IL-17、NFKB、TNF 等信號(hào)通路有關(guān)。IL-17 信號(hào)通路可刺激VEGF-C 的產(chǎn)生促進(jìn)淋巴管新生[10]，而是否能夠通過干預(yù)該通路治療MI 還有待進(jìn)一步的研究。

基于機(jī)器學(xué)習(xí)算法，本研究中共篩選4 個(gè)具有診斷意義的核心基因。PFKFB3 是一種將果糖-6-二磷酸轉(zhuǎn)化為果糖-2，6-二磷酸的代謝酶，是限速酶磷酸果糖激酶-1 最有效的變構(gòu)激活劑[11]，其生物學(xué)活性主要是通過激活磷酸果糖激酶-1 參與糖酵解反應(yīng)。有研究表明靶向抑制PFKFB3 被證實(shí)與淋巴管新生相關(guān)，其作用機(jī)制可能是通過抑制巨噬細(xì)胞中PFKFB3 的表達(dá)，刺激該免疫細(xì)胞中VEGF-C的產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)了淋巴管新生[12-13]。然而本研究僅發(fā)現(xiàn)PFKFB3 與適應(yīng)性T 細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，并未發(fā)現(xiàn)PFKFB3 與巨噬細(xì)胞之間的相關(guān)性，是否適應(yīng)性T細(xì)胞中的分泌的某種信號(hào)因子影響了巨噬細(xì)胞中PFKFB3 的表達(dá)還有待進(jìn)一步研究。IL1RN 具有編碼IL-1Ra 的功能，有證據(jù)表明上調(diào)IL-1a 可以減少IL-1 引起的炎癥反應(yīng)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)IL1RN 在MI患者為上調(diào)基因，目前尚未有關(guān)于IL1RN 基因與淋巴管新生和MI 的文獻(xiàn)報(bào)道。IL1B 又稱分解代謝素，是白細(xì)胞介素-1 細(xì)胞因子家族的成員。IL1B 參與多種自身免疫性炎癥反應(yīng)和多種細(xì)胞活動(dòng)，包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡[15]。越來越多的證據(jù)表明IL1B與MI 的治療相關(guān)。在MI 大鼠模型中，microRNA-132 通過下調(diào)IL-1B 抑制心肌梗死后的大鼠心肌細(xì)胞凋亡改善心臟功能[16]。ADM 是一種在心臟、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞中均有所表達(dá)的血管擴(kuò)張肽[17]，有研究發(fā)現(xiàn)ADM 與淋巴管新生相關(guān)，在ADM 過表達(dá)小鼠心梗模型中發(fā)現(xiàn)ADM 可以通過Cx43 驅(qū)動(dòng)淋巴管新生與心臟功能恢復(fù)[18]。

中醫(yī)將MI 歸屬于“心痛”“胸痹”范疇[19]，其發(fā)病因素復(fù)雜，主要有寒邪內(nèi)侵、飲食不節(jié)、情志失調(diào)、年老體弱等，其病機(jī)屬本虛標(biāo)實(shí)，虛為陰陽氣血虧虛，實(shí)為陰寒、痰濁、瘀血。本研究對心梗-淋巴管新生核心基因進(jìn)行中藥預(yù)測與篩選，發(fā)現(xiàn)預(yù)測的藥物四氣或溫或寒，針對陰陽氣血虧虛，多用溫藥以補(bǔ)陽虛，寒藥以補(bǔ)陰虛；五味多屬苦、甘、辛，針對MI的陰寒、瘀血的病因病機(jī)，用辛味中藥溫通、散寒、活血；針對致病因素痰濁，辛苦類中藥多溫燥化寒痰，甘苦咸涼類中藥化熱痰。歸經(jīng)主要集中于肺、腎、脾經(jīng)，與眾多學(xué)者從肺、腎、脾論治胸痹的觀點(diǎn)一致[20]。

綜上，本研究以生物信息學(xué)、Lasso 回歸、SVMRFE 機(jī)器學(xué)習(xí)等方法對于MI 患者血液中與淋巴管新生相關(guān)的差異基因進(jìn)行篩選，共得到了4 個(gè)具有潛在治療意義的基因靶點(diǎn)（PFKFB3、IL1B、IL1RN、ADM），同時(shí)基于這4 個(gè)靶點(diǎn)預(yù)測了相關(guān)防治中藥，為后續(xù)基于淋巴管新生研究治療MI 的中藥奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[21-22]。