張珂凡 常 昕 肖智駿 席富強

1）包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010 2）包頭醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 包頭 014040

腦卒中是世界范圍內(nèi)常見的腦血管疾病之一，可導致嚴重的認知障礙和身體殘疾，具有較高的致殘率和致死率，盡管近年來對腦卒中的防治工作取得很大進步，但其仍是一個嚴重的社會健康問題，對家庭和社會帶來極大負擔［1-3］。卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是腦卒中后最常見的非認知性神經(jīng)精神障礙并發(fā)癥，發(fā)病占比高達1/3，臨床主要表現(xiàn)為食欲或體質(zhì)量變化、興趣缺乏、情緒低落、快感缺失、內(nèi)疚或自我價值低下、認知缺陷及自殺傾向等，已成為患者非正常致殘和致死的主要原因之一，還可增加腦卒中復發(fā)的風險［4-6］。因此，PSD的防治對于加快腦卒中患者身體和認知功能康復、改善預后、提高生存率至關(guān)重要。

PSD 的發(fā)病機制尚未明確，目前國內(nèi)外普遍認為中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥與PSD 密切相關(guān)［7-8］。研究證實，Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）參與機體的諸多炎癥過程，可通過提高核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎性體的表達，促使下游白介素-1β前體（pro-IL-1β）的成熟而生成IL-1β等促炎因子，發(fā)揮炎性效應(yīng)［9-11］。微小RNA（miRNA）是一類長度為18～24個核苷酸的高度保守的內(nèi)源性非編碼RNA，主要通過調(diào)控mRNA 的翻譯實現(xiàn)對靶基因表達的調(diào)節(jié)，在細胞的增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用，研究表明miR-223在抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展中顯示出潛在的生物學活性［12-14］。然而，TLR4/NLRP3 是否與PSD 患者海馬組織炎癥有關(guān)，以及miR-223是否參與TLR4/NLRP3信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)控，目前鮮有研究報道?；诖?，本研究采用改良Koizumi 法和CUMS 構(gòu)建PSD 模型大鼠，通過給予TLR4 抑制劑TAK-242，觀察不同組別大鼠海馬組織炎癥狀態(tài)及TLR4/miR-223/NLRP3 信號通路的表達，以期探究TLR4/miR-223/NLRP3信號通路的表達與PSD 海馬炎癥反應(yīng)的關(guān)系，為臨床防治PSD 提供新的思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：30 只3 月齡SPF 級健康雄性Sprague-Dawley 大鼠，體質(zhì)量220～250 g，購自北京維通利華實驗動物中心，許可證號：SCXK（京）2023-0806，常規(guī)飼養(yǎng)于（24±2）℃、（60±5）%恒溫恒濕潔凈動物房，12 h 晝夜交替，自由攝食攝水，實驗開始前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，正常晝夜交替，本研究經(jīng)包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院動物實驗管理委員會審批通過。

1.1.2 主要藥品及試劑：TAK-242（美國Sigma 公司），10%水合氯醛溶液、BCA 蛋白定量試劑盒、ELISA 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），RNA 試劑盒、RIPA裂解液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒（美國Invitrogen公司），兔抗TLR4、NLRP3、IL-1β、IL-10抗體（美國Abcam公司）。

1.1.3 主要儀器：低溫高速離心機（美國Thermo Scientific公司），超低溫冰箱（青島海爾公司），酶標儀（美國ThermoFisher公司），PCR儀（美國Biorad公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組方案：將30只大鼠分為假手術(shù)組、PSD模型組和TLR4抑制劑組各10只。

1.2.2 腦卒中模型的建立：采用改良Koizumi法建立MCAO 大鼠模型，腹腔注射10%水合氯醛，麻醉效果滿意后，常規(guī)消毒大鼠頸正，固定于手術(shù)板上，沿頸正中線逐層切開，暴露分離頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，動脈夾夾閉頸總動脈近心端和頸內(nèi)動脈遠心端，電凝筆結(jié)扎頸外動脈遠心端，于頸內(nèi)外動脈交匯處切一小口，將栓線插入頸內(nèi)動脈18～20 mm，并松開頸內(nèi)動脈的夾閉，2 h 后拔出栓線并逐層縫合，術(shù)后腹腔注射青霉素抗感染。假手術(shù)組不插入線栓，其他操作均同模型組。

1.2.3 PSD 模型的建立：將上述造模成功的腦卒中模型大鼠單籠孤養(yǎng)，術(shù)后恢復飼養(yǎng)7 d 后，再連續(xù)給予4 周的慢性不可預見性輕度應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS），包括禁食、禁水、噪聲、晝夜調(diào)整、閃光刺激、傾斜鼠籠、潮濕墊料、行為限制、游泳、夾尾等方式，每天隨機給予1～2種刺激，相鄰2 d不給予同種刺激以防大鼠產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)。

1.2.4 PSD 大鼠模型評定：①Longa 評分：術(shù)后24 h采用Longa 5 級評分法對大鼠神經(jīng)行為學功能進行評定，4分為無法自主正?；顒?，3分為活動過程中出現(xiàn)明顯的偏癱側(cè)傾倒，2分為爬行過程向病灶對側(cè)傾倒劃圈，1分為無法完全伸展病灶對側(cè)前肢，0分為可正常自主活動，未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺失癥狀，選取1～3分的大鼠進行后續(xù)實驗，棄去0分和4分以及實驗過程中死亡的大鼠，按上述造模方法重新造模補充。②糖水偏好試驗：行糖水訓練以檢測其基線值，第1天為2瓶1%蔗糖水，第2天為蔗糖水、礦泉水各1瓶，禁食、禁水23 h 后測試1 h 內(nèi)糖水消耗量，計算糖水偏嗜比（sucrose preference，SP），SP=糖水消耗量/（糖水+礦泉水總消耗量）×100%。③移動情況（location area，LA）：將大鼠置于1 m×1 m×0.5 m的黑色塑料無蓋敞箱，分為25個等格，每次將1只大鼠放入正中格中，若至少3 爪移動至1 個格內(nèi)，記錄為1 次爬格運動，觀察各大鼠5 min內(nèi)的爬格次數(shù)。

1.2.5 給藥方案：TLR4抑制劑組按0.3 mg/kg的劑量腹腔注射TAK-242溶液，5次/周，連續(xù)給藥4周；其余各組均腹腔注射等體積的生理鹽水溶液，5次/周，連續(xù)4周。

1.2.6 取樣及處理：實驗結(jié)束后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動脈放血處死，收集腹主動脈血，3 500 r/min 離心15 min 分離上層血清，凍存?zhèn)溆?。用生理鹽水由心臟灌注固定腦組織，至肝臟、眼球以及腦組織變白之后停止灌注，取各組大鼠海馬組織，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 觀察指標：①取大鼠血清，采用ELISA法檢測其中白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-10 的表達水平。②RT-PCR測定海馬組織中TLR4/miR-223/NLRP3 信號通路相關(guān)分子mRNA 表達情況：取部分海馬組織，Trizol 試劑裂解，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 并進行PCR 擴增。參照試劑盒說明書進行PCR 反應(yīng)，引物序列見表1，以GAPDH 為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算TLR4、miR-223、NLRP3 基因的相對表達水平。③Western blot測定TLR4/miR-223/NLRP3信號通路相關(guān)蛋白的相對表達：取各組大鼠部分海馬組織稱重，冰浴上剪碎研磨，勻漿，RIPA裂解液震蕩裂解提取總蛋白，BCA 法測定總蛋白濃度，取50 μg 蛋白上樣，10% SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，洗膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加一抗，4 ℃下孵育14 h，TBST 洗滌，加二抗，室溫下孵育2 h，ECL法顯色，以GAPDH 為內(nèi)參，GE 圖像分析儀和Quantity One軟件處理分析蛋白的相對表達。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Sequence of primers for RT-PCR

1.3 統(tǒng)計學方法應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較行t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況及行為學觀察假手術(shù)組大鼠進食進水正常，毛色光亮，精神狀態(tài)佳，活動敏捷；PSD模型組大鼠進食、進水明顯減少，毛色暗淡、黏膩、無光澤，精神萎靡，活動減少，反應(yīng)遲鈍，無明顯逃避反應(yīng)，實驗過程中死亡5 只。TLR4 抑制劑組大鼠較PSD模型組有所改善，但與假手術(shù)組大鼠仍有明顯差距，實驗過程中死亡3只。實驗期間死亡大鼠均已領(lǐng)取正常大鼠按造模和給藥方案重新補充加入各組。

2.2 神經(jīng)行為學評價PSD 模型組和TLR4 抑制劑組與假手術(shù)組相比，大鼠Longa評分升高，LA和SP降低；TLR4 抑制劑組與PSD 模型組相比Longa 評分下降，LA和SP升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠神經(jīng)行為學比較 （±s）Table 2 Comparison of neurobehavioral of rats in each group （±s）

表2 各組大鼠神經(jīng)行為學比較 （±s）Table 2 Comparison of neurobehavioral of rats in each group （±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與PSD模型組相比，#P＜0.05。

組別假手術(shù)組PSD模型組TLR4抑制劑組F值P值SP 0.92±0.03 0.29±0.02*0.42±0.05*#873.421＜0.001 n 10 10 10 Longa評分/分0.52±0.09 2.32±0.19*1.85±0.24*#256.866＜0.001 LA/次81.01±13.11 23.23±5.35*40.75±10.29*#85.945＜0.001

2.3 血清IL-1β和IL-10 的表達水平PSD 模型組和TLR4 抑制劑組與假手術(shù)組相比，大鼠血清IL-1β和IL-10 的表達升高；TLR4 抑制劑組與PSD 模型組相比下降（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清IL-1β和IL-10的表達水平比較 （±s）Table 3 Comparison of serum IL-1β and IL-10 expression levels of rats in each group （±s）

表3 各組大鼠血清IL-1β和IL-10的表達水平比較 （±s）Table 3 Comparison of serum IL-1β and IL-10 expression levels of rats in each group （±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與PSD模型組相比，#P＜0.05。

組別假手術(shù)組PSD模型組抑制劑組F值P值IL-10/（ng/L）3.36±0.23 11.71±3.11*7.74±1.15#47.372＜0.001 n 10 10 10 IL-1β/（ng/L）2.45±0.83 6.12±1.78*4.23±1.34#17.875＜0.001

2.4 海馬組織中TLR4/miR-223/NLRP3 mRNA 的表達與假手術(shù)組相比，PSD 模型組大鼠海馬組織中TLR4 mRNA、miR-223 和NLRP3 mRNA 的表達均顯著升高（P＜0.05），TLR4 抑制劑組的TLR4 mRNA顯著下降，而miR-223 和NLRP3 mRNA 的表達顯著升高（P＜0.05）；與PSD 模型組相比，TLR4 抑制劑組的TLR4 mRNA 和NLRP3 mRNA 的表達顯著降低，miR-223的表達顯著升高（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠海馬組織中TLR4/miR-223/NLRP3 mRNA的表達比較 （±s）Table 4 Comparison of the expressions of TLR4/miR-223/NLRP3 mRNA in hippocampal tissues of rats in each group （±s）

表4 各組大鼠海馬組織中TLR4/miR-223/NLRP3 mRNA的表達比較 （±s）Table 4 Comparison of the expressions of TLR4/miR-223/NLRP3 mRNA in hippocampal tissues of rats in each group （±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與PSD模型組相比，#P＜0.05。

組別假手術(shù)組PSD模型組TLR4抑制劑組F值P值NLRP3 mRNA 1.19±0.15 1.59±0.22*1.31±0.23*#10.210＜0.001 n 10 10 10 TLR4 mRNA 1.12±0.15 1.43±0.29*0.83±0.26*#15.505＜0.001 miR-223 0.21±0.03 1.13±0.25*1.55±0.29*#95.539＜0.001

2.5 TLR4/miR-223/NLRP3 信號通路相關(guān)蛋白的相對表達PSD 模型組和TLR4 抑制劑組與假手術(shù)組相比，大鼠海馬組織中TLR4、NLRP3、IL-1β和IL-10蛋白表達升高，TLR4抑制劑組與PSD模型組相比降低（P＜0.05），見表5。

表5 各組大鼠TLR4、NLRP3、IL-1β和IL-10蛋白的相對表達比較 （±s）Table 5 Comparison of relative expressions of TLR4, NLRP3, IL-1β and IL-10 proteins in rats of each group （±s）

表5 各組大鼠TLR4、NLRP3、IL-1β和IL-10蛋白的相對表達比較 （±s）Table 5 Comparison of relative expressions of TLR4, NLRP3, IL-1β and IL-10 proteins in rats of each group （±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與PSD模型組相比，#P＜0.05。

組別假手術(shù)組PSD模型組TLR4抑制劑組F值P值IL-10 0.96±0.13 1.53±0.23*1.30±0.21*#21.659＜0.001 n 10 10 10 TLR4 1.05±0.07 1.69±0.38*1.31±0.34*#11.733＜0.001 NLRP3 0.98±0.23 1.61±0.31*1.29±0.25*#14.076＜0.001 IL-1β 0.97±0.11 1.55±0.19*1.32±0.21*#27.725＜0.001

3 討論

PSD 的發(fā)病機制復雜，近年來的研究普遍認可的主要有社會心理學機制和生物學機制兩大學說，前者主要包括性別、年齡、睡眠時間、高度神經(jīng)質(zhì)、精神疾病個人史及家族史等因素，后者主要包括神經(jīng)營養(yǎng)因子、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)、炎癥因子、下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）軸等因素［15-17］。研究表明，炎癥因子的表達水平與PSD的發(fā)生風險呈正相關(guān)，并可預測PSD的預后，抗炎治療可顯著降低PSD的患病概率［18］。TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子與生理病理過程密切相關(guān)，可引起HPA 軸的改變，是機體抵御應(yīng)激的內(nèi)分泌機制之一，并促進皮Cor、Ach 表達升高，影響NE 活性［19-20］。炎癥因子大量表達還可增加吲哚胺-2，3-雙加氧酶，降低腦組織5-HT表達，誘發(fā)抑郁癥狀［21-22］。由此可見，降低炎癥反應(yīng)對卒中后抑郁具有一定的防治作用。

本研究采用改良Koizumi 法和CUMS 構(gòu)建PSD模型大鼠，發(fā)現(xiàn)PSD 模型大鼠的Longa 評分較假手術(shù)組大鼠顯著升高，LA 和SP 顯著降低，同時PSD模型組大鼠表現(xiàn)為明顯的抑郁樣行為，提示PSD 模型造模成功。通過給予TLR4抑制劑TAK-242后，發(fā)現(xiàn)TLR4 抑制劑組大鼠Longa 評分較PSD 模型組顯著下降，LA 和SP 顯著升高，同時大鼠的抑郁樣行為有所緩解，提示通過抑制TLR4 信號轉(zhuǎn)導通路可改善PSD大鼠的抑郁樣行為。海馬和前額葉皮層是參與學習、認知和情緒調(diào)控等的主要部位，也是PSD發(fā)生的關(guān)鍵部位。缺血缺氧損傷可引起HPA軸的亢進和炎癥因子的大量釋放，從而抑制海馬神經(jīng)元的再生，降低腦神經(jīng)的可塑性，并最終導致PSD的發(fā)生［23-24］。

進一步分析發(fā)現(xiàn)，PSD 模型組大鼠血清IL-1β和IL-10的表達水平較假手術(shù)組顯著升高，提示炎癥反應(yīng)在PSD 的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。與PSD 模型組相比，TLR4 抑制劑組大鼠血清IL-1β和IL-10 的表達水平較PSD 模型組顯著下降，提示TLR4/miR-223/NLRP3信號轉(zhuǎn)導通路可能與PSD大鼠海馬炎癥存在一定的關(guān)系。分析其原因，炎癥反應(yīng)參與了腦卒中及PSD發(fā)生、發(fā)展的全過程，IL-1β在缺血性腦卒中、神經(jīng)退變等病程中發(fā)揮重要作用。小膠質(zhì)細胞是重要的中樞神經(jīng)系統(tǒng)常駐免疫細胞，其分泌的IL-1β可被活化的NLRP3 炎癥小體所誘導，從而加快抑郁炎癥反應(yīng)的進程［25-27］。IL-10 主要來源于中樞小膠質(zhì)細胞，相關(guān)報道提示先天性的IL-10轉(zhuǎn)錄活性異常以及促炎/抗炎因子比例的失調(diào)與PSD 的發(fā)生密切相關(guān)［28-29］。本研究進一步證明了這一說法的科學性。

本研究還發(fā)現(xiàn)，PSD 模型組大鼠海馬組織中TLR4 mRNA 和NLRP3 mRNA 的表達以及TLR4 和NLRP3蛋白的相對表達高于假手術(shù)組，提示TLR4信號通路是誘導NLRP3炎癥體的活化以及下游炎癥反應(yīng)啟動的關(guān)鍵介質(zhì)。應(yīng)用TAK-242 后，TLR4 抑制劑組TLR4 mRNA 和NLRP3 mRNA 的表達顯著降低，miR-223 的表達顯著升高，同時TLR4 抑制劑組的TLR4、NLRP3、IL-1β和IL-10 蛋白相對表達顯著降低，提示TLR4 信號通路可作為PSD 防治的靶點之一。分析其原因，TLR4 抑制劑通過阻礙TLR4 的激活，從而誘導炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 轉(zhuǎn)錄水平的低表達［30-31］；miR-223是NLRP3炎性體信號轉(zhuǎn)錄控制的關(guān)鍵調(diào)控因子，miR-223的過表達可下調(diào)NLRP3的表達，阻止炎性體的活化，抑制炎癥因子的產(chǎn)生，因此可能成為調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的一個新靶點［32-33］；NLRP3炎性體在中樞及外周炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，其通過識別和接受啟動信號，活化TLR4/NF-κB等信號轉(zhuǎn)導通路，激活NLRP3炎性體的組裝，促使半胱氨酸天冬酰胺特異蛋白酶-1前體蛋白發(fā)生自身蛋白水解，生成具有生物活性的Caspase-1，并誘導下游IL-1β、IL-18 等前體的成熟，進而生成具有生物活性的IL-1β、IL-18等炎癥因子，發(fā)揮炎性效應(yīng)，啟動下游炎癥反應(yīng)［34-35］。因此，分析其可能機制為TLR4 信號轉(zhuǎn)導通路被抑制后miR-223 在海馬組織內(nèi)的表達相應(yīng)上調(diào)，從而增強了其靶向識別IKKα調(diào)控TLR4/NF-κB 信號轉(zhuǎn)導通路的作用，降低了其下游炎性因子的表達。

本研究表明，TLR4/miR-223/NLRP3 信號轉(zhuǎn)導通路與PSD 大鼠海馬炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，通過抑制PSD大鼠TLR4的表達，可上調(diào)miR-223的表達，激活TLR4/miR-223/NLRP3 信號轉(zhuǎn)導通路，靶向抑制炎癥因子IL-1β和IL-10 的表達，緩解PSD 大鼠海馬組織炎癥反應(yīng)，調(diào)控該信號通路可能成為臨床防治PSD的新靶位和新思路。