王馨芳 張婉霞 史美玲 張梓坤 寇志安 田永強

摘要：將貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）BQ作為最新發(fā)現(xiàn)的潛力生防菌。通過平板對峙、孢子萌發(fā)、生防機制和離體防治試驗檢測該菌株對黨參根腐病的防治效果。平板對峙試驗表明，貝萊斯芽孢桿菌BQ可明顯抑制黨參根腐病病原菌尖孢鐮孢菌DS的生長，菌絲生長抑制率達50.55%，對峙區(qū)菌絲發(fā)生明顯形變；孢子萌發(fā)結(jié)果表示，貝萊斯芽孢桿菌BQ的代謝產(chǎn)物能有效抑制病原菌DS的孢子萌發(fā)；對貝萊斯芽孢桿菌的生防機制進行初探，貝萊斯芽孢桿菌BQ的代謝產(chǎn)物能引起病原菌DS的細胞膜通透性增加，從而導(dǎo)致核酸內(nèi)容物釋放量增加，細胞破裂至死亡。離體防治結(jié)果顯示，貝萊斯芽孢桿菌BQ對黨參根腐病的治療效果達到46.13%，預(yù)防效果達到了63.62%。可見，貝萊斯芽孢桿菌BQ有防治黨參根腐病的潛力，可作為生物防治劑進行開發(fā)。

關(guān)鍵詞：黨參；貝萊斯芽孢桿菌; 根腐病病原菌; 尖孢鐮孢菌；生物防治；抑制效應(yīng)

中圖分類號：Q939.9；S567? ? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? ? 文章編號：2097-2172（2024）02-0167-07

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2024.02.013

Evaluation on the Control Effects of Bacillus velezensis BQ

against Codonopsis pilosula Root Rot

WANG Xinfang， ZHANG Wanxia， SHI Meiling， ZHANG Zikun， KOU Zhian， TIAN Yongqiang

（College of Biological and Pharmaceutical Engineering， Lanzhou Jiaotong University， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract： Bacillus velezensis BQ was regarded as the newly discovered potential biocontrol bacteria， and its control effects on root disease of Codonopsis pilosula was studied by the dual confrontation test， spore germination， biological control mechanism and in vitro control test. The results of the dual confrontation test showed that Bacillus velezensis BQ could obviously inhibit the growth of Fusarium oxysporum DS， the mycelium growth inhibition rate reached 50.55%， and the mycelium in the confrontation area was obviously deformed. The results of spores germination showed that the metabolites of Bacillus velezensis BQ could effectively inhibit the spores germination of pathogen DS. The metabolites of Bacillus velezensis BQ could increase the permeability of cell membrane of pathogenic bacteria DS， which led to the increase of nucleic acid release and cell rupture to death. In vitro control results showed that Bacillus velezensis BQ had a therapeutic effect of 46.13% and a preventive effect of 63.62% on Codonopsis pilosula root rot. Bacillus velezensis BQ has the potential to control Codonopsis pilosula root rot and can be developed as a biological control agent.

Key words： Codonopsis pilosula; Bacillus velezensis; Root rot pathogen; Fusarium oxysporum; Biological control; Inhibiting effect

黨參［Codonopsis pilosula （Franch） Nannf.］是桔?？贫嗄晟荼局参铮侵袊鴤鹘y(tǒng)的中藥材之一，黨參的根具有滋養(yǎng)脾肺、增強造血功能及免疫力的功效。甘肅是我國黨參種植大省，黨參種植面積約占全國的90%，已成為部分地區(qū)農(nóng)戶的主要收入來源［1 ］。然而近年來，由于連作等原因引起了黨參的多種土傳病害，導(dǎo)致黨參幼苗存活率不高［2 ］。黨參根腐病是由尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）引起的最嚴重的黨參土傳病害之一，其孢子可在土壤中存活約8～10 a［3 ］。有研究證實，尖孢鐮孢菌的孢子在根尖分泌物的驅(qū)化作用下發(fā)育成菌絲［4 - 6 ］，隨后尖孢鐮刀菌通過分泌產(chǎn)生的細胞壁降解酶（Cell wall degrading enzymes，CWDEs）進入根部皮層［7 - 8 ］，接著尖孢鐮孢菌定殖在宿主植物體內(nèi)，并產(chǎn)生植物毒素來幫助尖孢鐮孢菌繼續(xù)入侵。尖孢鐮孢菌的大量生長和繁殖會產(chǎn)生大量化合物，從而堵塞植物的維管束，引起植物根系腐爛壞死［9 ］。

黨參在幼苗階段易被尖孢鐮孢菌侵染，感染后根部維管束組織發(fā)生褐變，但莖葉部分無明顯變化［10 - 11 ］；隨著病害加劇，植株莖葉部分迅速萎蔫枯萎，直至植株死亡，根部往往腐爛直至死亡［10， 12 - 13 ］。黨參根腐病發(fā)病迅速，難以控制，能造成黨參減產(chǎn)50%以上，經(jīng)濟損失嚴重［1 - 2 ］。黨參根腐病感染初期較難發(fā)現(xiàn)，一旦發(fā)生后，除灌根外的其他傳統(tǒng)方法達不到殺滅尖孢鐮孢菌的目的。而化學(xué)農(nóng)藥的大量使用易導(dǎo)致土壤污染和作物的農(nóng)藥殘留積累，對中藥材的生產(chǎn)、質(zhì)量和安全產(chǎn)生負面影響［14 - 15 ］。因此，黨參生產(chǎn)上迫切需要一種環(huán)境上可接受、可靠有效的方法來防治黨參根腐病。

在可持續(xù)農(nóng)業(yè)中，微生物生物防治劑具有代替化學(xué)農(nóng)藥來防治植物病害的潛力，能有效抑制植物病原菌，并促進植物生長［16 - 17 ］。大多數(shù)用作生物防治劑的細菌菌株均屬于芽孢桿菌［18 ］。芽孢桿菌的抗真菌活性與其抗真菌次級代謝產(chǎn)物有關(guān)，這些成分能抑制病原菌的繁殖、菌絲形變或破裂，或引起其核酸內(nèi)容物的釋放量增加，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)環(huán)境失衡甚至死亡［19 - 21 ］。貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）屬芽孢桿菌屬，其在繁殖與生長階段能夠分泌產(chǎn)生許多抗菌成分，且表現(xiàn)出廣譜、高效的抗菌活性。貝萊斯芽孢桿菌的次生代謝產(chǎn)物含有多種蛋白酶、脂肽類抗生素等，而脂肽類抗生素是其最重要的抗菌物質(zhì)［22 - 25 ］。有研究證明，貝萊斯芽孢桿菌對尖孢鐮孢菌古巴專化型有較好的防治效果［26 ］。將貝萊斯芽孢桿菌的產(chǎn)物進行粗提后發(fā)現(xiàn)，其粗提物中含有抗菌脂肽類物質(zhì)為Bacillomycin D 及Surfactin 等多個組分，能有效抑制尖孢鐮孢菌的生長［27 ］。此外，貝萊斯芽孢桿菌對番茄灰斑病、小麥紋枯病等多種植物病害均有較好的防治效果［28 - 29 ］。

本研究利用實驗室前期分離純化得到的1株貝萊斯芽孢桿菌菌株BQ進行研究，初步探究了其對黨參根腐病抗菌機理和防治效果，以期為貝萊斯芽孢桿菌菌株BQ應(yīng)用于防治黨參根腐病提供初步的理論依據(jù)。

1? ?材料與方法

1.1? ?材料

1.1.1? ? 供試菌種? ? 供試菌株為貝萊斯芽孢桿菌BQ，來自蘭州交通大學(xué)生物農(nóng)藥工程中心，保藏號為ACCC61708。通過對菌株BQ基因分析，證實菌株BQ為芽孢桿菌屬貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），對黨參根腐病病原菌具有較強抑制作用。供試尖孢鐮孢菌菌株DS自黨參根腐病發(fā)病植株的根部分離篩選所得，對病原菌分離并通過過真菌形態(tài)學(xué)和16srDNA分子鑒定，最終確定菌株DS為尖孢鐮孢菌，保存于蘭州交通大學(xué)生物農(nóng)藥工程中心。

1.1.2? ? 供試植株? ? 一年生白條黨參品種渭黨2號，來自甘肅省渭源縣黨參種植基地。

1.1.3? ? 供試培養(yǎng)基? ? LB培養(yǎng)基（固）：蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 10 g/L、瓊脂 20 g/L，pH自然。LB培養(yǎng)基（液）：蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 10 g/L，pH自然。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato dextrose ager，PDA）：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖 20 g/L、瓊脂 20 g/L，pH自然。

1.2? ?實驗方法

1.2.1? ? 菌種培養(yǎng)? ? 菌株BQ采用在LB固體平板上劃線的方式接種傳代。將菌株BQ接種至LB液體培養(yǎng)基，30 ℃下以180 rpm/min培養(yǎng)36～48 h來制備種子液。將種子液以V∶V=1∶10接種至LB液體培養(yǎng)基，在30℃下以180 rpm/min培養(yǎng)36～48 h，獲得菌株BQ的發(fā)酵液。試驗之前，需測定發(fā)酵液的細菌數(shù)并用LB液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至1×109 CFU/mL。將病原菌DS的菌餅（直徑為5 mm）接種至PDA培養(yǎng)平板的中心，在25 ℃條件下暗培養(yǎng)7 d進行繁殖。在菌落邊緣取5個菌餅（直徑為5 mm）接種至PDA培養(yǎng)基，在25 ℃條件下以180 rpm/min暗培養(yǎng)48 h，獲得病原菌DS的發(fā)酵液。試驗之前，也需測定發(fā)酵液的孢子數(shù)并用PDB培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至1×105 CFU/mL。

1.2.2? ? 平板對峙? ? 在病原菌DS的平板邊緣取菌餅（直徑為5 mm）接種至PDA平板中心，挑取菌株BQ的菌落，在病原菌DS菌餅兩側(cè)距離平板邊緣約1 cm的位置劃線［30 ］。以僅接種病原菌DS菌餅的平板為對照，每處理重復(fù)3次。所有平板置于28 ℃下進行暗培養(yǎng)，直至對照組的DS菌絲生長到平板邊緣。在光學(xué)顯微鏡下觀察對峙區(qū)的病原菌菌絲。

1.2.3? ? 孢子抑制? ? 將菌株BQ的發(fā)酵液以5 000 rpm/min離心20 min后取上清液，將上清液用無菌濾膜（0.45 μm）過濾，獲得菌株BQ的無菌上清濾液。將其無菌上清濾液用LB液體培養(yǎng)基稀釋至濃度0.5%、1.0%、5.0%、50.0% 、100.0%（V/V）。將病原菌DS的發(fā)酵液和BQ菌株的無菌上清液濾液以V∶V=1∶1混合［無菌上清濾液的終濃度分別為0.25%、0.50%、1.00%、5.00%、50.00% （V/V）］，并取2 mL加入24孔板的菌株中，在25 ℃條件下培養(yǎng)8 h。以空白LB液體培養(yǎng)基代替無菌上清濾液為對照（CK）。每處理組重復(fù)3次。在光學(xué)顯微鏡下觀察DS的孢子萌發(fā)情況，并計算孢子萌發(fā)率和抑制率［31 - 32 ］。

孢子萌發(fā)率（%）=×100%

式中， G1是每處理組中觀察得到的孢子總數(shù)，G2是每處理組中觀察到的萌發(fā)的孢子數(shù)。

抑制率（%）=×100%

式中， C1是空白對照組的孢子萌發(fā)率，C2是各個處理組的孢子萌發(fā)率。

1.2.4? ? 根腐病? ? 病原菌細胞膜相對電導(dǎo)率和核酸內(nèi)容物釋放將病原菌DS的發(fā)酵液用2層無菌紗布過濾，得到DS的菌絲體。用10 mL無菌的磷酸鹽緩沖液（PBS，100 mmol/L，pH 7.2）將菌絲體洗滌3次，之后將菌絲體置于100 mL的無菌PBS中，將無菌上清濾液以V∶V=1∶10接種至含菌絲體的PBS中，以含有等量LB液體培養(yǎng)基的PBS用作空白對照。每個處理組在28 ℃下以180 rpm/min在黑暗中培養(yǎng)，并分別在0、3、6、9、12、24 h后測定每個組的細胞外電導(dǎo)率（用梅特勒托利多電導(dǎo)率測定儀測定）和260 nm處的吸光度（德國斯派克光譜儀測定）［33 - 34 ］。每個處理重復(fù)3次。將培養(yǎng)24 h后獲得的各處理組的病原菌DS菌絲在掃描電鏡下觀察。

1.2.5? ? 防治效果? ? 評價選取粗細大小一致的一年生黨參根，清洗后分別用75%酒精消毒15 s，用30%次氯酸鈉溶液消毒1 min，再用無菌水清洗3次。為測定菌株BQ對黨參根腐病的治療效果，在消毒后的黨參根上進行針刺，并在每個傷口接種病原菌DS的菌餅（直徑5 mm），使帶有菌絲的一面緊貼傷口［35 ］。48 h后，取5 mL菌株BQ的發(fā)酵液均勻地噴灑在黨參根表面。為測定菌株BQ對黨參根腐病的預(yù)防效果，將黨參根針刺后，先將5 mL菌株BQ的發(fā)酵液噴灑在黨參根系表面，48 h后再接種病原菌DS的菌餅。以只接種 LB液體培養(yǎng)基為空白對照，以只接種病原菌DS菌餅的處理為陰性對照。各處理組內(nèi)的黨參均置于鋪有無菌濕濾紙的平板（直徑18 cm）內(nèi)，在25 ℃黑暗中培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后，觀測黨參根系的發(fā)病情況，計算發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果［36 - 37 ］。每個處理組重復(fù)3次，每個處理組內(nèi)包括10條一年生黨參根。

黨參根腐病分級標準為：0級，根部無病斑；1級，根系患病面積占1% ～ 10%，根系剖面無明顯變化；2級，根部發(fā)病面積占11% ～ 20%，根部剖面開始變褐；3級，根部發(fā)病面積占20% ～ 30%，剖面變成褐色；4級，根部病變面積占30% ～ 40%，病變變軟，整個根部變成褐色至黑褐色，甚至長出白色菌絲；5級，根部發(fā)病面積占40% ～ 50%，整個根部開始變軟，菌絲覆蓋面積擴大，根部變成黑褐色；6級，50% ～ 60%面積感染，整個根部開始軟化腐爛，菌絲大面積覆蓋；7級，根部發(fā)病面積占60%以上，根部腐爛，出現(xiàn)大量水漬［38 ］。

發(fā)病率=×100%

式中，D1是發(fā)病黨參根系的數(shù)量，D2是調(diào)查的黨參根系總數(shù)。

病情指數(shù)=×100

式中， E1是病害各個級別的發(fā)病黨參根系總數(shù)，E2是病害相級別數(shù)值，E3是調(diào)查的黨參根系總數(shù)，E4是最高級數(shù)值。

防治效果=×100%

式中，F(xiàn)1是陰性對照的病情指數(shù)，F(xiàn)2是處理組的病情指數(shù)。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?平板對峙

菌株BQ對病原菌DS的對峙效果如封三圖1所示，菌株BQ可明顯抑制病原菌DS的生長。在培養(yǎng)7 d后，菌株BQ對病原菌DS菌絲的抑制率達到50.55%。在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲結(jié)構(gòu)可知，對照組的病原菌DS菌絲呈線狀平滑生長，而處理組的病原菌DS菌絲發(fā)生了明顯的形變，出現(xiàn)了出現(xiàn)了菌絲葫蘆狀膨大、節(jié)間縮小，以及出現(xiàn)了菌絲橫斷。表明菌株BQ對病原菌DS的生長狀態(tài)具有一定影響，具有較強的生防潛力。

2.2? ?孢子萌發(fā)

菌株BQ對病原菌DS的孢子萌發(fā)抑制效果如封三圖2所示。與對照組相比，含有無菌上清液的培養(yǎng)基能顯著抑制病原菌DS的孢子萌發(fā)。隨著上清液添加比例的增加，菌株 BQ對DS分生孢子的抑制作用越來越強。當(dāng)上清液添加量為50.00%（v/v）時，其抑制效果最強，孢子萌發(fā)抑制率達到（95.85±0.31）%；當(dāng)上清液添加量降至1.00%時，抑制率仍高達（41.11±0.18）%（表1）。表明菌株BQ的代謝產(chǎn)物中含有的抗菌成分能顯著抑制病原菌DS的孢子萌發(fā)，有作為生物防治劑進行開發(fā)的潛力。

2.3? ?細胞膜電導(dǎo)率和核酸內(nèi)容物釋放量

以菌株BQ的無菌上清液濾液對病原菌DS的細胞膜相對電導(dǎo)率及核酸內(nèi)容物釋放量來探究其對病原菌DS生長狀態(tài)的影響，結(jié)果如圖3所示，與對照組相比，菌株BQ的無菌上清液濾液能使病原菌DS的細胞膜相對電導(dǎo)率和核酸內(nèi)容物含量顯示出顯著的上升趨勢（P < 0.05）。這表明菌株BQ的發(fā)酵產(chǎn)物能破壞病原菌DS的細胞膜，從而使病原菌DS細胞膜通透性增加，以及核酸內(nèi)容物釋放加劇，并引起細胞破裂至死亡。

此外，掃描電鏡的結(jié)果顯示（封三圖4），菌株BQ的無菌上清液濾液能顯著改變病原菌DS菌絲的形態(tài)，能引起菌絲發(fā)生嚴重膨脹、起皺，并塌陷和斷裂。相比之下，對照組中的菌絲表現(xiàn)為飽滿、規(guī)則且光滑，并正常生長的狀態(tài)。

綜上可知，菌株BQ的發(fā)酵產(chǎn)物能大大影響病原菌DS的細胞膜通透性，從而影響菌體的生長狀態(tài)，導(dǎo)致病原菌滲透壓平衡紊亂，最終導(dǎo)致菌體破裂至死亡。

2.4? ?對黨參根腐病的防治效果

以一年生健康黨參離體根為材料，研究了貝萊斯芽孢桿菌菌株BQ對黨參根腐病的防治效果，各處理組除空白對照組外，發(fā)病率均為100.00%（封三圖5）。與空白對照組相比，陰性對照組表現(xiàn)出典型的黨參根腐病的病理癥狀，其中根部腐爛并變成褐色，生長白色菌絲，7 d后維管束變褐色，病情指數(shù)高達70.73±1.07。而與陰性對照組相比，2個處理組內(nèi)的菌株BQ均可以明顯降低病害發(fā)生的嚴重程度。其中，治療組BQ菌株對黨參根腐病的防治效果為46.13%，黨參根部表面病變較輕，但維管束內(nèi)發(fā)生明顯褐變，病情指數(shù)為38.10±0.87；在預(yù)防組中，BQ菌株對黨參根腐病的防治效果為63.62%，黨參根部表面病斑部位較少，維管束的褐變程度較輕，病情指數(shù)較低，僅為25.73±0.45（表2）?？芍闎Q對黨參根腐病有較好的防治效果，且預(yù)防效果強于治療效果。

3? ?討論與結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌BQ對引起黨參根腐病的尖孢鐮孢菌DS菌絲生長和孢子萌發(fā)均具有明顯的抑制作用。在平板對峙實驗中，對峙區(qū)的尖孢鐮刀菌DS菌絲發(fā)生了較大的形變，菌絲生長抑制率達50.55%，出現(xiàn)了菌絲葫蘆狀膨大、節(jié)間縮小，以及出現(xiàn)了菌絲橫斷。掃描電鏡下更是觀察到了菌絲變粗及內(nèi)容物泄漏，以及菌絲橫斷。以上結(jié)果表明貝萊斯芽孢桿菌BQ及其代謝產(chǎn)物能對尖孢鐮刀菌DS的生長狀態(tài)造成較大影響，其次級代謝產(chǎn)物中含有能破壞菌絲生長的成分。此外，隨著菌株BQ無菌上清液比例的增加，對病原菌DS的孢子萌發(fā)表現(xiàn)出較強的抑制作用，這表明菌株BQ分泌出了能有效抑制病原菌DS抗真菌物質(zhì)的代謝產(chǎn)物。

生防菌的抗真菌活性與其能引起病原菌分生孢子結(jié)構(gòu)破壞和細胞膜破裂的抗真菌次級代謝產(chǎn)物有關(guān)［21， 39 - 40 ］。結(jié)合對引起黨參根腐病的病原菌尖孢鐮孢菌DS菌絲的相對電導(dǎo)率和核酸內(nèi)容物釋放量的測定，貝萊斯芽孢桿菌菌株BQ對病原菌尖孢鐮孢菌DS細胞膜通透性及核酸內(nèi)容物釋放量均有較大影響，從而導(dǎo)致細胞滲透壓紊亂。綜合以上結(jié)果可知，無菌上清液濾液破壞了尖孢鐮孢菌的細胞膜完整性，導(dǎo)致菌絲通透性增加和核酸內(nèi)容物滲漏，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)環(huán)境失衡甚至死亡。這些結(jié)果與先前研究的結(jié)論一致，即細胞質(zhì)滲漏是由細胞質(zhì)膜的滲透性增加引起的［19 - 20， 41 ］。

此外，從對黨參根腐病離體防治的防治效果來看，對黨參根腐病的治療效果達到46.13%，預(yù)防效果達到了63.62%，可見貝萊斯芽孢桿菌菌株BQ有著良好的治療效果和預(yù)防效果，且預(yù)防效果優(yōu)于治療效果。有研究認為，拮抗菌對病原菌的保護作用優(yōu)于治療作用，這意味著先進的接種細菌具有強大的定殖能力［42 ］，但這些推測有待進一步驗證。

綜上所述，貝萊斯芽孢桿菌BQ對黨參根腐病具有較好的防治效果，對引起黨參根腐病的病原菌尖孢鐮孢菌DS有抑制作用，能有效抑制其菌絲生長及孢子萌發(fā)。此外，通過對其抗菌機理初步探索發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌BQ的次級代謝產(chǎn)物含有的抗菌成分，能增加尖孢鐮孢菌DS的菌體細胞膜通透性和加劇核酸內(nèi)容物釋放，并引起細胞破裂至死亡?？梢?，貝萊斯芽孢桿菌BQ有防治黨參根腐病的潛力，可作為生物防治劑進行開發(fā)加以利用。

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