陳雅慧,馬芬芬,田藝苑,鄧智中,蘭忠平

(延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院,陜西 延安 716000)

七氟醚是常用吸入麻醉藥,具有潛在神經(jīng)元毒性作用,會導(dǎo)致認知功能障礙。有研究[1]發(fā)現(xiàn),七氟醚可誘導(dǎo)新生大鼠神經(jīng)元樹突棘發(fā)育異常,使大鼠發(fā)生認知障礙。有研究[2-5]發(fā)現(xiàn),七氟醚可使腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細胞介素(Interleukin,IL)-1β過度表達而損傷神經(jīng)元,其損傷神經(jīng)元的機制與誘導(dǎo)皮質(zhì)神經(jīng)元發(fā)生鐵死亡有關(guān)。然而,七氟醚對發(fā)育期大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響是否與吸入時間、次數(shù)相關(guān),目前研究報道較少。因此,本研究針對這一問題進行實驗研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠40只,雌雄各半,3周齡,體重45～55 g,由西安交通大學(xué)實驗動物中心提供,合格證號:SCXK(陜)2022-010。

1.2 主要試劑 吸入七氟醚(國藥準字H20070172)購自上海恒瑞醫(yī)藥有限公司;乙酰膽堿酯酶(AchE)檢測試劑盒(批號: 20220515)和一氧化氮合酶(NOS)檢測試劑盒(批號: 20220837) 購自南京建成生物工程研究所;半胱氨酸蛋白酶-3(Capase-3)和B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)試劑購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同時長七氟醚麻醉幼鼠模型制備:將SD幼鼠分為四組,每組10只。A組不吸入七氟醚;B組吸入3%七氟醚2 h;C組吸入3%七氟醚2 h,每周1次,共2次;D組吸入3%七氟醚2 h,每周1次,共3次。除A組外,將其余各組幼鼠置于麻醉箱中,自制透明麻醉箱上方接口與動物呼吸麻醉機通氣孔相連通,箱內(nèi)通入3%七氟醚和30%氧氣(氧氣流量為3 L/min)混合氣體。麻醉期間仔細觀察幼鼠狀態(tài)如肢端皮膚和黏膜顏色。麻醉結(jié)束后打開麻醉箱,待幼鼠自然清醒后放回飼養(yǎng)籠中,其余時間正常飼養(yǎng)。

1.3.2 Morris水迷宮實驗:各組大鼠飼養(yǎng)至42日齡后,進行連續(xù)6 d的Morris水迷宮實驗。前5 d進行水迷宮定位航行實驗,第6天進行空間探索實驗。①水迷宮定位航行實驗:將平臺隱蔽水下2 cm,水中加入牛奶,掩蓋平臺分別從四個象限固定點。將大鼠放入水中,設(shè)定120 s,記錄大鼠找到平臺所需時間(潛伏期)。如果大鼠失敗,則將其引導(dǎo)至平臺,停留10～15 s,潛伏期記錄為120 s。將每天4次獲得的潛伏期求取平均值,所得數(shù)值即為大鼠當(dāng)天的潛伏期。②空間探索實驗:讓大鼠從四個象限固定點入水,記錄大鼠平臺所在區(qū)域有效穿梭次數(shù)和停留時間,然后求取平均值。

1.3.3 海馬組織NOS含量和AchE活性測定:水迷宮空間探索實驗后, 1%戊巴比妥鈉麻醉49日齡大鼠后,迅速打開胸腔,暴露心臟,從右心室主動脈灌流PBS以去除腦組織中的血液,直至大鼠通體變白。冰盤上快速分離出海馬組織,稱重分裝后投入無RNA酶的1.5 ml EP管中,迅速放入液氮速凍和-80 ℃保存?zhèn)溆?。加入預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液,用勻漿器按1∶9的比例制成10%組織勻漿,于4 ℃下3000 r/min離心10 min,提取上清液-20 ℃凍存待測。采用比色法檢測AchE活性和NOS含量。

1.3.4 海馬組織中凋亡蛋白水平檢測:取海馬組織約300 mg放入液氮預(yù)冷研缽中,加入含1%蛋白酶抑制劑RIPA裂解液2 ml,添加液氮并迅速研磨,此過程中不斷加入液氮以防止蛋白降解。將研磨液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷離心管中,于冰盒中裂解20 min,4 ℃下12000 r/min離心30 min,吸取上清液后凍存于-80 ℃。收集蛋白上清于新的EP管中,加入上樣緩沖液,98 ℃變性10 min。BCA定量,電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉1 h,孵育一抗,4 ℃過夜。TBST洗膜10 min×3次,室溫搖床孵育二抗1 h。TBST洗膜10 min×3次,化學(xué)發(fā)光顯色并使用Image J進行灰度值分析,計算Caspase-3和 Bcl-2蛋白相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠定位航行實驗潛伏期比較 見表1。第1天,各組大鼠尋找平臺的潛伏期比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05) 。從第2天開始,B、C、D組潛伏期較A組明顯延長(均P<0.05)。在第3、4、5天,D組潛伏期較B組和C組明顯延長(均P<0.05)。

2.2 各組大鼠空間探索實驗穿越平臺次數(shù)和停留時間比較 見表2。在空間搜索實驗中,B、C、D組穿越平臺次數(shù)和停留時間與A組比較明顯減少(均P<0.05) 。D組與B、C組比較,穿越平臺次數(shù)和停留時間減少(均P<0.05)。

表2 各組大鼠空間探索實驗穿越平臺次數(shù)和停留時間比較

2.3 各組大鼠海馬組織NOS含量和AchE活性比較 見表3。B、C、D組大鼠海馬組織NOS含量低于A組,且C、D組低于B組,D組低于C組(均P<0.05)。B、C、D組大鼠海馬組織AChE活性高于A組,且C、D組高于B組,D組高于C組(均P<0.05)。

表3 各組大鼠海馬組織NOS含量和AchE活性比較

2.4 各組大鼠海馬組織Capase-3和Bcl-2蛋白表達比較 見圖1。B、C、D組大鼠海馬組織Capase-3蛋白高于A組,且C、D組高于B組,D組高于C組(均P<0.05)。C、D組大鼠海馬組織Bcl-2蛋白低于A、B組,且D組低于C組(均P<0.05)。

注:左圖為Capase-3和Bcl-2蛋白電泳圖。柱狀圖為各組大鼠海馬組織Capase-3和Bcl-2蛋白表達比較,與A組比較,*P<0.05;與B組比較,#P<0.05;與C組比較,&P<0.05圖1 各組大鼠海馬組織Capase-3和Bcl-2蛋白表達比較

3 討 論

認知是機體對獲取信息的加工過程,學(xué)習(xí)記憶是其重要的環(huán)節(jié)。七氟醚是一種臨床上兒科常用揮發(fā)性麻醉藥,吸入七氟醚對兒童遠期認知的影響目前研究尚無清晰的定論。幼兒時期吸入七氟醚對認知功能的影響可能是多方面的。本研究探索在幼兒期增加吸入七氟醚次數(shù)對幼鼠學(xué)習(xí)記憶的影響。Morris水迷宮實驗可以反映動物的認知功能、空間學(xué)習(xí)和記憶能力,也是常用的研究學(xué)習(xí)記憶的手段。Morris水迷宮實驗包括定位航行實驗和空間搜索實驗。定位航行實驗中的潛伏期反映大鼠學(xué)習(xí)成績,空間搜索實驗中大鼠穿越原平臺象限的次數(shù)反映大鼠的記憶保存能力。既往研究[6]發(fā)現(xiàn),七氟醚可誘導(dǎo)幼年小鼠神經(jīng)元凋亡,損傷其學(xué)習(xí)與記憶能力。晉菲菲等[7]研究發(fā)現(xiàn),幼年動物在吸入性麻醉劑七氟醚中暴露時間越長,腦神經(jīng)細胞死亡數(shù)越多,動物后來的學(xué)習(xí)記憶及行為發(fā)育越遲緩。

本實驗發(fā)現(xiàn),幼鼠吸入七氟醚次數(shù)越多,幼鼠找到平臺的時間越長,吸入七氟醚的幼鼠找到平臺的潛伏期比對照組明顯延長,空間搜索實驗中吸入七氟醚的幼鼠穿越平臺次數(shù)減少,說明幼鼠吸入七氟醚次數(shù)越多,學(xué)習(xí)記憶能力越差。以往研究[8]發(fā)現(xiàn),幼年小鼠連續(xù)3 d每天用七氟醚麻醉2 h,其空間記憶能力受損,Morris水迷宮實驗中學(xué)習(xí)記憶能力較差,本研究結(jié)果與之基本一致。

學(xué)習(xí)記憶的維持與腦神經(jīng)突觸可塑性密切相關(guān),而突觸可塑性與腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的變化有關(guān)。腦內(nèi)遞質(zhì)一氧化氮(NO)和乙酰膽堿(Ach)是進行及維持高級神經(jīng)系統(tǒng)功能的重要介質(zhì)。Ach水平與學(xué)習(xí)記憶的增強呈量效關(guān)系。研究[9]發(fā)現(xiàn),七氟醚可導(dǎo)致基底前腦AchE的表達及酶活性下降,從而導(dǎo)致腦內(nèi)Ach合成減少,最終導(dǎo)致幼鼠認知功能損害。學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的長時程增強(LTP)的形成和建立離不開NO的參與。NOS是合成NO的關(guān)鍵酶,當(dāng)NOS缺乏時NO生成不足,必將影響LTP的形成和突觸可塑性的建立,進而影響正常學(xué)習(xí)記憶行為。本研究發(fā)現(xiàn),吸入七氟醚后大鼠腦內(nèi)NOS含量降低,AchE活性增加。也有研究[10]認為,腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)是大腦發(fā)育中影響突觸可塑性的主要分子介質(zhì),七氟醚能通過降低BDNF水平及其受體酪氨酸激酶B的磷酸化來抑制BDNF酪氨酸激酶B信號轉(zhuǎn)導(dǎo),降低突觸密度,導(dǎo)致突觸超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,LTP減少,從而損害認知功能。SHEN等[11]研究發(fā)現(xiàn),LTP減少還可能與突觸蛋白的異常表達有關(guān),反復(fù)接觸七氟醚的大鼠海馬突觸后致密區(qū)G蛋白受體和谷氨酸受體1表達水平降低,導(dǎo)致突觸結(jié)構(gòu)被破壞,LTP減少。

研究[12-16]發(fā)現(xiàn),將幼齡動物重復(fù)多次或者長時間進行全麻藥物的暴露可以使大腦組織中凋亡蛋白 Bax-2和Caspase-3增加,使神經(jīng)細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2含量減少,從而促進神經(jīng)細胞發(fā)生凋亡。PENG等[17]研究發(fā)現(xiàn),暴露于七氟醚6 h會顯著增加Caspase-3和Bax蛋白的表達,從而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2 表達,加速程序性細胞死亡。同樣,LEI等[18]將出生7 d的SD大鼠暴露于3%七氟醚6 h,發(fā)現(xiàn)幼鼠頂葉皮質(zhì)Caspase-3蛋白表達增加,海馬DG區(qū)神經(jīng)元祖細胞活性明顯降低,而水迷宮實驗發(fā)現(xiàn)七氟醚組潛伏期明顯長于對照組。研究[8]發(fā)現(xiàn),幼鼠經(jīng)七氟醚暴露后4周,學(xué)習(xí)和記憶出現(xiàn)障礙,海馬神經(jīng)元干細胞凋亡數(shù)量增加。陳勇等[19]研究發(fā)現(xiàn),大鼠吸入七氟醚濃度的增加會降低海馬去甲腎上腺素、5-羥色胺水平,增強對三磷酸腺苷受體P2X3表達的抑制作用,增加海馬區(qū)細胞凋亡,降低大鼠記憶行為能力。張晚來等[20]研究發(fā)現(xiàn),七氟醚可以通過miR-21-5p/RTN4軸促進大鼠神經(jīng)干細胞凋亡和抑制其增殖。本研究結(jié)果顯示,D組Caspase-3蛋白高于A組,Bcl-2蛋白低于A組,說明幼鼠吸入七氟醚次數(shù)越多,海馬中神經(jīng)元凋亡越多,神經(jīng)損傷越大。

為減輕七氟醚對神經(jīng)元凋亡的影響,大多研究主要集中于聯(lián)合用藥。唐心愿[21]在探討七氟醚麻醉對小鼠神經(jīng)元的興奮性作用及其對神經(jīng)元凋亡的影響時發(fā)現(xiàn),右美托咪定可以增強七氟醚的麻醉鎮(zhèn)靜效果,降低小鼠活動性,降低神經(jīng)元蛋白C-Fos表達,減少細胞凋亡,減少小鼠腦皮質(zhì)內(nèi)磷酸化Tau蛋白含量。高榮等[22]研究認為,孕酮對孕中期吸入七氟醚致子鼠神經(jīng)損傷的改善作用可能與其抑制小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞活化介導(dǎo)的海馬細胞凋亡率上升和突觸相關(guān)蛋白表達水平下降有關(guān)。李珍等[23]研究發(fā)現(xiàn),miR-124可以使海馬組織中BDNF、PI3K、AKT2蛋白表達升高,減少海馬神經(jīng)元細胞凋亡。熊璐等[24]研究發(fā)現(xiàn),神經(jīng)生長因子(NGF)可減輕七氟醚誘導(dǎo)的基底前腦膽堿能系統(tǒng)退變及認知障礙。張力召等[25]研究發(fā)現(xiàn),嬰幼兒磁共振成像檢查時七氟醚吸入麻醉聯(lián)合右美托咪定滴鼻可增強鎮(zhèn)靜效果,安全性更高。

綜上所述,吸入七氟醚次數(shù)增加會損傷新生幼鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,臨床上應(yīng)盡量減少七氟醚的使用次數(shù),并聯(lián)合其他措施盡可能降低七氟醚對學(xué)習(xí)記憶能力的影響。