許衛(wèi)星,張 薇,陳姣敏,尹鳳雷,王 娟

(滄州市中心醫(yī)院血液內一科,河北 滄州 061001)

彌漫性大B細胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤中最常見的病理類型,約占所有確診非霍奇金淋巴瘤病例的30%～40%,具有很大的異質性,呈彌漫性生長[1-2]。DLBCL的主要治療方案是利妥昔單抗加環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿和潑尼松,大約40%～50%患者通過該方法可治愈[3],但由于超過一半的患者出現(xiàn)化療耐藥、復發(fā)和轉移,DLBCL患者的5年生存率非常低[4],因此研究新的藥物對于DLBCL患者的治療非常重要。芍藥苷(Paeoniflorin,PAE)從白芍中獲得,具有預防低血壓綜合征、預防驚厥以及免疫調節(jié)等多種功能,還被證明在多種人類惡性腫瘤中具有抗癌活性[5],但其在DLBCL中的研究鮮有報道。絲氨酸/蘇氨酸激酶(Serine/threonine kinase,AKT)信號通路是經(jīng)典的細胞內信號通路,可抑制細胞凋亡,調節(jié)糖原代謝,通過一系列機制參與許多不同類型腫瘤的發(fā)展,如AKT/鼠雙微基因2(Murine double minute 2,MDM2)/p53信號通路在細胞凋亡和增殖的調節(jié)中起重要作用[6]。已有研究[7]顯示,抑制MDM2/p53信號通路可以抑制DLBCL的發(fā)展。本研究研究探討PAE通過調節(jié)AKT/MDM2/p53信號通路對DLBCL細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 DLBCL細胞株OCI-LY3細胞由吉雅生物技術研究所提供,在補充有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),在37 ℃、5% CO2的潮濕空氣中孵育,當細胞融合度達到80%～90%時進行實驗。

1.2 主要試劑與儀器 Gibco提供RPMI-1640培養(yǎng)基(批號:A1049105);GIBCO提供青霉素-鏈霉素(批號:15140-122);Excell Bio提供胎牛血清(批號:FCS500);西安開米生物工程有限公司提供PAE(批號:K120505);南京恩晶生物科技有限公司提供CCK-8試劑盒(批號:E1CK-000208)、RIPA裂解液(批號:E1WP106)、SDS-PAGE變性蛋白上樣緩沖液(批號:E1WP303);上海碧云天生物技術有限公司提供BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號:P10010);Abcam公司提供AKT激活劑SC79(批號:ab146428)、p-AKT(批號:ab8933)、p-MDM2(批號:ab16895)、AKT(批號:ab8805)、MDM2(批號:ab22710)、p53(批號:ab26)單克隆抗體;BD Biosciences公司提供Annexin V-FITC/碘化丙錠(PI)雙染試劑盒(批號:559763)。Thermo Fisher Scientific提供Multiskan MK3酶標儀;BD BioScience提供BD FACSCanto Ⅱ流式細胞儀;Thermo公司提供HERAcell 150i CO2培養(yǎng)箱;南京麥高德生物科技有限公司提供Tanon VE-180B轉膜儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞分組及處理[8-9]:OCI-LY3細胞分別經(jīng)15、30、60 μmol/L PAE處理,標記為PAE低濃度組、PAE中濃度組和PAE高濃度組;并設置在60 μmol/L PAE進行處理前,以8 μg/ml SC79孵育細胞24 h,標記為PAE高濃度+SC79組;同時以未經(jīng)處理的細胞為對照組。各組處理48 h后進行指標分析。

1.3.2 CCK-8法檢測細胞增殖:取OCI-LY3細胞(1×103個/孔)接種到96孔板中,置于37 ℃濕潤培養(yǎng)箱中,按照上述分組處理后向每個孔中加入10 μl CCK-8試劑,并在37 ℃孵育2 h。最后使用酶標儀測定450 nm處的吸光度值,分析細胞增殖。

1.3.3 平板克隆形成實驗分析細胞克隆形成能力:將OCI-LY3細胞接種到6孔板中,加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d,每3天更換1次培養(yǎng)基,之后經(jīng)4%多聚甲醛固定、結晶紫染色,在室溫下孵育30 min,用去離子水洗去多余的染料,進行克隆形成計數(shù)。

1.3.4 流式細胞術分析細胞周期:收集OCI-LY3細胞,用PBS洗滌,固定在預冷的75%乙醇中,并在20 ℃下儲存過夜。用PBS洗滌后,用PI在室溫下染色15 min,通過流式細胞儀分析細胞周期變化。

1.3.5 Annexin V/PI雙染法分析細胞凋亡:將PBS洗滌的細胞懸浮在100 μl FITC結合緩沖液中,最低濃度為1×106個/ml,在4 ℃下與5 μl膜聯(lián)蛋白V/FITC結合15 min。然后加入10 μl PI在室溫下黑暗中孵育30 min,流式細胞儀及FlowJo軟件分析凋亡細胞變化。

1.3.6 Western blot檢測p-AKT、p-MDM2、AKT、MDM2、p53蛋白水平:從OCI-LY3細胞中提取蛋白質,經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉移到聚偏氟乙烯膜上。然后用5%脫脂牛奶封閉膜1 h,并在4 ℃下與p-AKT、p-MDM2、AKT、MDM2、p53一抗一起孵育過夜。用Tris緩沖溶液洗滌膜3次后,室溫下將辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗與膜孵育1 h,使用增強化學發(fā)光試劑盒檢測免疫反應性蛋白條帶,以單克隆GAPDH抗體為對照,使用圖像分析程序定量分析條帶。

2 結 果

2.1 PAE對OCI-LY3細胞增殖的影響 與對照組(100.00±0.00)比較,細胞增殖率在PAE低濃度組(75.28±7.56)、PAE中濃度組(52.38±5.26)、PAE高濃度組(32.55±3.27)中降低(q=11.973、23.064、32.668,均P<0.05)。與PAE高濃度組比較,PAE高濃度+SC79組細胞增殖率(56.77±5.69)增加(q=11.731,P<0.05)。

2.2 PAE對OCI-LY3細胞克隆形成能力的影響 見圖1。對照組、PAE低濃度組、PAE中濃度組、PAE高濃度組和PAE高濃度+SC79組細胞克隆形成數(shù)依次為(176.52±17.68)個、(123.34±12.36)個、(86.34±8.77)個、(42.22±4.26)個和(87.61±8.81)個。與對照組比較,PAE低濃度組、PAE中濃度組、PAE高濃度組細胞克隆形成數(shù)降低(q=11.532、19.555、29.122,均P<0.05)。與PAE高濃度組比較,PAE高濃度+SC79組細胞克隆形成數(shù)增加(q=9.842,P<0.05)。

圖1 各組細胞克隆形成數(shù)變化(結晶紫染色)

2.3 PAE對OCI-LY3細胞周期的影響 見表1。與對照組比較,PAE低濃度組、PAE中濃度組、PAE高濃度組G0/G1期增加,G2/M、S期降低(均P<0.05)。與PAE高濃度組比較,PAE高濃度+SC79組G0/G1期降低,G2/M、S期增加(P<0.05)。

表1 各組OCI-LY3細胞周期比較(%)

2.4 PAE對OCI-LY3細胞凋亡的影響 見圖2。對照組、PAE低濃度組、PAE中濃度組、PAE高濃度組和PAE高濃度+SC79組細胞凋亡率依次為(6.82±0.70)%、(13.55±1.36)%、(27.88±2.88)%、(39.88±4.02)%和(26.75±2.71)%。與對照組比較,細胞凋亡率在PAE低濃度組、PAE中濃度組、PAE高濃度組增加(q=6.301、19.742、30.991,均P<0.05)。與PAE高濃度組比較,PAE高濃度+SC79組細胞凋亡率降低(q=12.308,P<0.05)。

圖2 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況

2.5 PAE對OCI-LY3細胞p-AKT/AKT、p-MDM2/MDM2、p53表達的影響 見表2。與對照組比較,PAE低濃度組、PAE中濃度組、PAE高濃度組p53表達增加,p-AKT/AKT、p-MDM2/MDM2表達降低(均P<0.05)。與PAE高濃度組比較,PAE高濃度+SC79組p53表達水平降低,p-AKT/AKT、p-MDM2/MDM2表達增加(均P<0.05)。

表2 各組細胞p-AKT/AKT、p-MDM2/MDM2、p53表達比較

3 討 論

DLBCL是一種起源于B淋巴細胞的惡性腫瘤,有遺傳異質性和顯著的表型。在目前的臨床治療中,大多數(shù)DLBCL患者生存時間短,雖然其治愈率得到改善,但臨床療效仍不令人滿意,多數(shù)患者在腫瘤復發(fā)后病死[10-12],因此迫切需要開發(fā)新的治療策略提高DLBCL的治療效果。

尋找中藥活性成分并揭示其潛在抗腫瘤作用機制已成為當今醫(yī)藥研究的熱點[13]。PAE是芍藥的主要成分之一。作為一種活性化合物,PAE通過影響細胞凋亡、周期停滯、上皮-間質轉化和遷移等不同細胞生物學過程,在各種類型的腫瘤中表現(xiàn)出潛在的抗腫瘤作用[14]。SI等[15]研究發(fā)現(xiàn),PAE可減少結腸腫瘤的數(shù)量和大小,提高小鼠的存活率。PAE可抑制人B細胞急性淋巴細胞白血病Nalm-6和SUP-B15細胞增殖,誘導細胞凋亡和細胞周期阻滯,為白血病的治療提供潛在藥物[16]。細胞周期對于控制細胞增殖至關重要,而對細胞增殖的抑制是由于細胞生長停滯在細胞周期的G1或G0/G1期[17],本研究發(fā)現(xiàn)PAE可以劑量依賴的方式抑制細胞克隆形成數(shù)及增殖率,使細胞周期停滯G0/G1期,提示PAE具有抗腫瘤細胞增殖的作用。腫瘤的發(fā)展受細胞增殖和凋亡間的平衡控制,誘導細胞凋亡被認為是一種有吸引力的治療策略[18]。本研究發(fā)現(xiàn),PAE可以劑量依賴的方式誘導細胞凋亡,表明PAE的抗腫瘤作用可能通過抑制OCI-LY3細胞增殖促進其凋亡的實現(xiàn)。

AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,作為一種經(jīng)典的細胞內信號軸,可通過多種機制與腫瘤發(fā)生相關,許多類型惡性腫瘤如子宮內膜癌、肺癌、乳腺癌和肝癌的發(fā)生均與AKT異常磷酸化水平的增加有關[19]。例如,抑制磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT信號表達可抑制人結直腸癌的生長,促進其凋亡[20]。作為AKT的重要下游靶標,MDM2可在AKT活化后磷酸化并易位至細胞核,從而抑制腫瘤抑制蛋白p53表達,因此AKT/MDM2/p53信號通路在細胞周期、增殖和凋亡的調節(jié)中具有重要作用[21-22],抑制這一途徑的新型藥物是治療腫瘤的途徑之一[23]。例如,小檗胺治療后可抑制三陰性乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲,可能是通過調節(jié)PI3K/AKT/MDM2/p53信號通路初步實現(xiàn)的[24]。在結直腸癌研究中,木香烴內酯被證明是一種新的AKT抑制劑,通過抑制AKT的磷酸化來抑制MDM2泛素化,從而激活和誘導p53的穩(wěn)定性,進而抑制大腸癌細胞生長并誘導細胞凋亡[25]。本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)PAE處理OCI-LY3細胞后,可顯著抑制AKT磷酸化水平,進而降低MDM2水平,上調p53表達,進而抑制OCI-LY3細胞增殖,誘導細胞周期停滯,促進其凋亡,提示在DLBCL發(fā)展過程中AKT/MDM2通路作用可能被促進,進而抑制了抑癌基因p53表達,使得癌細胞的功能增強,但PAE可能作為一種AKT抑制劑逆轉了上述通路的表達,從而抑制了OCI-LY3細胞的惡性行為發(fā)展。最后實驗以AKT/MDM2/p53信號通路激活劑SC79進行了回復驗證,結果發(fā)現(xiàn)經(jīng)PAE高濃度+SC79共同處理后,細胞凋亡率、p53表達、G0/G1期顯著降低,細胞克隆形成數(shù)、增殖率、p-AKT/AKT表達、p-MDM2/MDM2表達、G2/M期、S期顯著增加,表明SC79逆轉了PAE高濃度對OCI-LY3細胞惡性行為的抑制作用,提示PAE可能通過抑制AKT/MDM2/p53信號通路抑制DLBCL細胞增殖,誘導其凋亡及細胞周期停滯。

綜上所述,PAE通過抑制AKT/MDM2上調p53表達,抑制DLBCL細胞增殖、細胞周期進展,誘導其凋亡,可作為AKT抑制劑參與治療DLBCL。但由于細胞研究單一且缺乏動物體內實驗,實驗結論仍需針對上述不足進一步完善。