易三鳳,屈銀宗,龔承先,趙艷潔,楊建美

(1.湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院消化內(nèi)科,湖北 武漢 430015;2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科,山東 青島 266003)

食管癌是全球高發(fā)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,發(fā)病率及病死率均較高,給人類健康帶來重大威脅[1-3]。深入研究新的分子治療靶點(diǎn)和潛在的診斷標(biāo)志物對(duì)改善食管癌患者預(yù)后至關(guān)重要。環(huán)狀RNA(Circular RNA,circRNA)是一種閉環(huán)狀RNA,沒有蛋白質(zhì)編碼功能,呈現(xiàn)顯著的細(xì)胞特異性和組織特異性[4]。研究[5-6]表明,絕大多數(shù)癌癥均存在circRNA表達(dá)失調(diào),其表達(dá)水平與癌癥患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后以及復(fù)發(fā)有關(guān)。在食管癌中circRNA充當(dāng)腫瘤促進(jìn)因子或腫瘤抑制因子,影響食管癌細(xì)胞的分化、脂肪代謝和鐵死亡等過程,是食管癌發(fā)生和進(jìn)展的重要生物標(biāo)志物[7]。探究circRNA與食管癌治療的潛在關(guān)系,可能有利于食管癌的臨床病理診斷和靶向治療。環(huán)狀RNA GRIN2B(Circular RNA GRIN2B,circ-GRIN2B)位于人基因組12p13.1區(qū)域,由12號(hào)外顯子首尾相接而成,在食管癌中的表達(dá)和活性鮮有報(bào)道?；虮磉_(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus,GEO)分析顯示circ-GRIN2B在食管癌組織中的表達(dá)明顯低于正常組織。研究證實(shí),微小RNA(microRNA,miR)-135b在多種惡性腫瘤如卵巢癌、食管癌中表達(dá)上調(diào),發(fā)揮癌基因功能,沉默miR-135b表達(dá)能夠抑制腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[8]。本研究探討circ-GRIN2B是否通過調(diào)控miR-135b影響食管癌細(xì)胞增殖和侵襲。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與主要試劑 食管癌細(xì)胞株(Eca109、TE-13、KYSE30、OE33、EC9706)和正常食管上皮細(xì)胞株HET-1A購自美國ATCC公司?？蛰d對(duì)照質(zhì)粒、circ-GRIN2B過表達(dá)質(zhì)粒(批號(hào):TSP12-13、TSP12-49)購自北京擎科生物科技有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、Lipofectamine 2000(批號(hào):AM1660TS、AM826PE)購自美國賽默飛公司;總RNA提取試劑盒(批號(hào):15596026)購自美國Invitrogen公司;胎牛血清(FBS)、蛋白定量試劑盒(批號(hào):T8593E、T9300A)購自日本Takara公司;Transwell小室、雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)(批號(hào):PICM0RG50、PICM0TO10)購自美國Merck Millipore公司;熒光素酶質(zhì)粒circ-GRIN2B-wt和circ-GRIN2B-mut及基質(zhì)膠(批號(hào):84574、84575、66589)購自美國Proteintech公司;抗體周期蛋白依賴性激酶8(CDK8)、周期素C(Cyclin C)、β-微管蛋白(β-tubulin)和纖維結(jié)合蛋白(FN)、轉(zhuǎn)錄因子8(ZLF8)、叉頭盒蛋白C2(FOXC2)(批號(hào):ab229192、ab85927、ab18207、ab2413、ab168527、ab308055)購自美國Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:采用含13% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)Eca109、TE-13、KYSE30、OE33、EC9706 和HET-1A細(xì)胞。取對(duì)數(shù)期的EC9706細(xì)胞消化并接種在6孔板,培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。采用Lipofectamine 2000試劑分別轉(zhuǎn)染circ-GRIN2B過表達(dá)質(zhì)粒(circ-GRIN2B組)和空載對(duì)照質(zhì)粒(NC組)至EC9706細(xì)胞。轉(zhuǎn)染50 h后,驗(yàn)證質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)circ-GRIN2B和miR-135b表達(dá):使用總RNA提取試劑盒裂解并提取細(xì)胞總RNA,以500 ng RNA為模板合成cDNA。以U6和GAPDH為內(nèi)參,引物序列見表1。以2-ΔΔCt法分析circ-GRIN2B和miR-135b相對(duì)表達(dá)量。

表1 各基因引物序列

1.2.3 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EC9706細(xì)胞增殖:轉(zhuǎn)染20 h后,胰酶消化并重懸EC9706細(xì)胞,每組加入約900個(gè)細(xì)胞至6孔板,最終培養(yǎng)體積為3 ml,保證每孔底呈單細(xì)胞狀態(tài),培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)13 d。棄去剩余培養(yǎng)基,流水洗滌5次,用1%多聚甲醛固定50 min。加入0.3%結(jié)晶紫染色50 min后進(jìn)行觀察、拍照并統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EC9706細(xì)胞侵襲:取200 μl基質(zhì)膠均勻鋪在Transwell室上部,培養(yǎng)箱內(nèi)靜置形成基質(zhì)屏障。轉(zhuǎn)染20 h后,胰酶消化并重懸EC9706細(xì)胞,在Transwell室上部每組加入3.5×105個(gè)EC9706細(xì)胞,培養(yǎng)基體積為200 μl。在Transwell室下部加750 μl含30% FBS的培養(yǎng)基,保證Transwell室上下均無氣泡,培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)25 h。流水洗滌5次,用1%多聚甲醛固定50 min后加入0.3%結(jié)晶紫染色50 min。在倒置光學(xué)顯微鏡下拍照并統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)circ-GRIN2B與miR-135b靶向關(guān)系:將對(duì)數(shù)生長期的EC9706細(xì)胞鋪于6孔板,分別共轉(zhuǎn)染circ-GRIN2B-wt和miR-NC、circ-GRIN2B-mut和miR-NC、circ-GRIN2B-wt和miR-135b、circ-GRIN2B-mut和miR-135b,每組轉(zhuǎn)染終濃度為150 nmol/L。轉(zhuǎn)染45 h后,裂解每組細(xì)胞,分別檢測(cè)海腎熒光素酶活性和螢火蟲熒光素酶活性作為對(duì)照和校正參數(shù)。

1.2.6 Western blot檢測(cè)EC9706細(xì)胞增殖和侵襲相關(guān)蛋白:使用蛋白裂解液充分裂解EC9706細(xì)胞,高速離心30 min收集總蛋白后煮沸9 min。采用11% SDS-PAGE膠電泳分離,恒溫下轉(zhuǎn)移到聚偏二氯乙烯膜,10%質(zhì)量濃度脫脂牛奶封膜3 h。稀釋一抗,均勻覆蓋在聚偏二氯乙烯膜,室溫反應(yīng)6 h。將稀釋后的二抗均勻覆蓋在聚偏二氯乙烯膜,室溫孵育2.5 h。將ECL試劑盒的A液和B液混合,均勻覆蓋在膜蛋白面,在化學(xué)發(fā)光儀中曝光、顯影,以β-tubulin為內(nèi)參,對(duì)條帶進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同食管癌細(xì)胞株circ-GRIN2B表達(dá)比較 見圖1。RT-qPCR結(jié)果顯示,與HET-1A細(xì)胞比較,circ-GRIN2B在食管癌細(xì)胞株Eca109、TE-13、KYSE30、OE33、EC9706表達(dá)降低,且EC9706細(xì)胞中最低(均P<0.05)。故采用EC9706細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

注:與HET-1A細(xì)胞比較,*P<0.05;與EC9706細(xì)胞比較,#P<0.05圖1 不同食管癌細(xì)胞株circ-GRIN2B表達(dá)比較

2.2 NC組與circ-GRIN2B組circ-GRIN2B表達(dá)量比較 在EC9706細(xì)胞中轉(zhuǎn)染circ-GRIN2B質(zhì)粒后,NC組與circ-GRIN2B組circ-GRIN2B表達(dá)量分別為1.01±0.38和10.56±2.02,circ-GRIN2B組circ-GRIN2B表達(dá)量高于NC組(t=4.657,P<0.01)。

2.3 circ-GRIN2B對(duì)EC9706細(xì)胞增殖的影響 見圖2。平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,NC組和circ-GRIN2B組EC9706細(xì)胞集落數(shù)量分別為(149.80±11.68)個(gè)和(41.24±6.47)個(gè),circ-GRIN2B組EC9706細(xì)胞集落數(shù)量少于NC組(t=8.127,P<0.01)。

圖2 兩組EC9706細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果(結(jié)晶紫染色,×100)

2.4 circ-GRIN2B對(duì)EC9706細(xì)胞侵襲的影響 見圖3。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示,NC組和circ-GRIN2B組EC9706細(xì)胞侵襲數(shù)目分別為(90.25±7.48)個(gè)和(41.43±8.48)個(gè),circ-GRIN2B組EC9706細(xì)胞侵襲數(shù)目少于NC組(t=4.317,P<0.01)。

圖3 兩組EC9706細(xì)胞Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果(結(jié)晶紫染色,×100)

2.5 circ-GRIN2B對(duì)miR-135b的靶向調(diào)控作用 見圖4、5。circRNADb軟件預(yù)測(cè)顯示,circ-GRIN2B與miR-135b間存在結(jié)合序列。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示,與miR-NC+circ-GRIN2B-wt組比較,miR-135b+circ-GRIN2B-wt組EC9706細(xì)胞熒光素酶活性下降(P<0.01)。

圖4 circ-GRIN2B與miR-135b結(jié)合位點(diǎn)

2.6 circ-GRIN2B對(duì)EC9706細(xì)胞miR-135b表達(dá)的影響 NC組與circ-GRIN2B組EC9706細(xì)胞miR-135b表達(dá)量分別為(7.07±0.90)和(1.01±0.18),circ-GRIN2B組miR-135b表達(dá)量低于NC組(t=6.596,P<0.01)。

2.7 circ-GRIN2B對(duì)EC9706細(xì)胞增殖和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 見圖6。Western blot結(jié)果顯示,circ-GRIN2B組EC9706細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白(CDK8、Cyclin C)和侵襲相關(guān)蛋白(FN、ZLF8、FOXC2)表達(dá)水平較NC組降低(均P<0.05)。

注:與NC組比較,*P<0.05圖6 circ-GRIN2B對(duì)EC9706細(xì)胞增殖和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

食管癌屬于原發(fā)性消化道腫瘤,其發(fā)生與原癌基因的激活和抑癌基因的缺失相關(guān)[9-11]。circRNA廣泛參與腫瘤如喉癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、胸腺瘤等惡性演進(jìn)過程,調(diào)控細(xì)胞周期、近端浸潤和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移,其突變或失活與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[12-14]。近年來研究[15-17]顯示,circRNA參與調(diào)控關(guān)于食管癌細(xì)胞的生長、侵襲、放療敏感性等,可能是食管癌的潛在診療靶點(diǎn)。例如,食管癌組織和細(xì)胞中circ_0006948表達(dá)上調(diào),circ_0006948表達(dá)減少可抑制食管癌細(xì)胞的生長、遷移、侵襲和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[17]。circ_141539在食管癌組織中顯著上調(diào),其高表達(dá)與患者TNM分期、分化程度和預(yù)后不良顯著相關(guān),具有較高的診斷價(jià)值;circ_141539過表達(dá)通過海綿化 miR-4469和激活細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶3表達(dá),促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖和侵襲[18]。研究[19]發(fā)現(xiàn),在食管癌組織和細(xì)胞株中檢測(cè)到circ-VIM表達(dá)顯著上調(diào),通過吸附miR-124在體外促進(jìn)食管癌細(xì)胞的免疫逃逸和惡性轉(zhuǎn)化,在體內(nèi)促進(jìn)異種移植物的生長和肺轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),circ-GRIN2B在食管癌Eca109、TE-13、KYSE30、OE33、EC9706細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào),且EC9706細(xì)胞中最低,因此后續(xù)選用EC9706細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)circ-GRIN2B能夠顯著抑制EC9706細(xì)胞的增殖和侵襲,同時(shí)使EC9706細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白(CDK8、Cyclin C)和侵襲相關(guān)蛋白(FN、ZLF8、FOXC2)表達(dá)水平下調(diào),表明circ-GRIN2B參與食管癌的發(fā)生和發(fā)展。

研究[20-22]表明,circRNA在細(xì)胞中扮演miRNA的海綿分子,通過調(diào)節(jié)miRNA含量影響細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變和生物學(xué)過程。例如,circ-PSMC3在吉非替尼耐藥食管鱗癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),過表達(dá)circ-PSMC3通過靶向抑制miR-135b表達(dá)增加了食管鱗癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性,促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的凋亡[22]。本研究通過circRNADb軟件預(yù)測(cè)并經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí),circ-GRIN2B與miR-135b存在靶向調(diào)控關(guān)系。研究[23]顯示,miR-135b在細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)配體識(shí)別,影響多種信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo),與細(xì)胞免疫應(yīng)答有關(guān)。miR-135b可能在非小細(xì)胞肺癌、胃癌、胰腺癌等惡性腫瘤中表達(dá)升高,能夠顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和化療耐藥性[24-25]。DI等[26]研究發(fā)現(xiàn),食管癌組織樣本中miR-135b表達(dá)升高,并且在Eca109、EC9706、KYSE150細(xì)胞中的表達(dá)高于正常食管上皮細(xì)胞,沉默miR-135b表達(dá)在體外能夠抑制Eca109和EC9706細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,在體內(nèi)能夠抑制異種移植腫塊的生長。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),circ-GRIN2B能負(fù)調(diào)控miR-135b的表達(dá),表明了circ-GRIN2B抑制食管癌細(xì)胞的增殖、侵襲可能與調(diào)控miR-135b表達(dá)有關(guān)。

綜上所述,circ-GRIN2B在食管癌細(xì)胞中低表達(dá),其可能通過下調(diào)miR-135b表達(dá)抑制食管癌細(xì)胞的增殖和侵襲。circ-GRIN2B未來有望成為一種新的食管癌治療靶點(diǎn)。本研究的不足之處在于,未能證明circ-GRIN2B在體內(nèi)對(duì)食管癌細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用,下一步研究將通過裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證circ-GRIN2B在體內(nèi)的抑癌作用。