朱文壯,楊 念,張躍平,張 迪

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 獸醫(yī)公共衛(wèi)生安全全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 海淀 100193;2. 北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京 海淀 100875)

偽中間型葡萄球菌是一種凝固酶陽性的葡萄球菌,是犬、貓皮膚和黏膜的共生菌,是犬、貓正常菌群的一部分,寄生在犬、貓的口、鼻、頭部、腹股溝和肛門等皮膚和黏膜處[1]。其也是一種機(jī)會(huì)性致病菌,當(dāng)犬、貓的抵抗力降低或各種原因?qū)е缕つw的屏障功能減弱時(shí),可引起感染,導(dǎo)致膿皮病和外耳炎等局部感染,以及泌尿道、呼吸道和生殖道等全身感染[2]。其中,皮膚感染最為常見,高達(dá)92%的膿皮病患犬中主要的病原體為偽中間型葡萄球菌[2]。此外,偽中間型葡萄球菌也被認(rèn)為與大多數(shù)社會(huì)源和醫(yī)源性感染有關(guān)[3-4]。

由于抗生素的廣泛使用,獸醫(yī)臨床中偽中間型葡萄球菌的耐藥問題愈發(fā)顯著。目前已知葡萄球菌對(duì)臨床所有可用的抗菌藥均具有耐藥機(jī)制[5]。尤其是耐甲氧西林偽中間型葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphycoccuspseudintermedius,MRSP),在犬膿皮病中,MRSP占偽中間型葡萄球菌的比例高達(dá)59%以上[1]。如果耐藥問題得不到有效控制,臨床獸醫(yī)將面臨少藥甚至無藥可用的局面[6-7]。因此,人們開始將目光轉(zhuǎn)向?qū)ふ倚碌目咕镔|(zhì)。細(xì)菌裂解酶可以裂解宿主細(xì)胞壁,導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)部滲透壓過大,細(xì)胞膜破裂,細(xì)菌死亡,從而發(fā)揮殺菌作用[8]。細(xì)菌裂解酶具有高效、特異和不產(chǎn)生耐藥菌株等特點(diǎn),且作用完畢后最終代謝成氨基酸,無毒無害,是替代抗生素的最佳候選之一,具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值[9]。本試驗(yàn)使用的細(xì)菌裂解蛋白SALy102為經(jīng)過反復(fù)篩選得到的一種噬菌體裂解酶。前期試驗(yàn)證明,SALy102對(duì)從牛乳腺炎中分離的金黃色葡萄球菌有較好的抑菌效果。

本試驗(yàn)以偽中間型葡萄球菌為研究對(duì)象,探究SALy102對(duì)犬皮膚和耳道感染病灶分離的偽中間型葡萄球菌的抗菌活性,為SALy102裂解蛋白在偽中間型葡萄球菌感染的臨床應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC29213),由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院外科實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑 SALy102凍干粉,通過大腸桿菌表達(dá)、鎳柱純化獲得SALy102蛋白后,使用凍干機(jī)制成。細(xì)菌培養(yǎng)所用BHI肉湯培養(yǎng)基、BHI瓊脂培養(yǎng)基和MHB培養(yǎng)基,均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;PCR引物,由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成;PremixTaq酶RR902(TaKaRa)和細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒,均購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器 光學(xué)顯微鏡(ICC50 HD),購自德國徠卡(Leica)公司;PCR儀(C1000),購自伯樂(Bio-Rad)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司;酶標(biāo)儀(MuLtiiskan MK3),購自賽默飛世爾(上海)科技公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱(HPX-9272MBE),購自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.4 細(xì)菌的分離和鑒定 臨床樣本采集自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院已確診皮膚或耳道感染的患犬。將皮膚和耳道拭子接種于BHI瓊脂培養(yǎng)基上,37 ℃恒溫培養(yǎng)16～24 h。挑取單菌落于BHI瓊脂培養(yǎng)基上劃線,37 ℃恒溫培養(yǎng)16～24 h。直至獲得大小形態(tài)均一的單克隆。觀察菌落形態(tài),挑取中等大小的白色、圓形、光滑、突起的菌落進(jìn)行革蘭染色,在顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài),呈球形、藍(lán)色、排列呈葡萄串狀的細(xì)菌初步判定為葡萄球菌。使用細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒提取菌株的DNA。經(jīng)PCR擴(kuò)增分離菌株的16S rRNA區(qū)域,所用引物序列為27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后,通過NCBI Blast比對(duì)分析,以鑒定細(xì)菌種類。

1.5 SALy102的抗菌活性 采用比濁法測定SALy102的抗菌活性[10]。當(dāng)裂解蛋白發(fā)揮裂解活性時(shí),細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜破裂,細(xì)菌懸濁液濁度下降,因此,通過檢測細(xì)菌于600 nm處的光密度(Optical density in 600 nm,OD600 nm)值的變化情況即可確定SALy102是否發(fā)揮抗菌活性。分別取新鮮培養(yǎng)的偽中間型葡萄球菌和金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株菌液,用BHI肉湯培養(yǎng)基稀釋至108CFU/mL,制備菌懸液。SALy102凍干粉用1×PBS溶解。在96孔板中加入50 μL菌懸液和10 μL SALy102溶液,使SALy102的終濃度為250 μg/mL,37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。以相同體積的1×PBS代替SALy102溶液作為陰性對(duì)照孔。使用酶標(biāo)儀檢測每孔培養(yǎng)前(初始)和培養(yǎng)后OD600 nm值,按公式(1)計(jì)算裂解率。

裂解率(%)=(試驗(yàn)孔OD600 nm的減少值-陰性對(duì)照孔OD600 nm的減少值)÷初始OD600 nm×100%

(1)

1.6 SALy102對(duì)偽中間型葡萄球菌的時(shí)間-殺菌曲線 選取1株分離鑒定的偽中間型葡萄球菌繪制時(shí)間-殺菌曲線。偽中間型葡萄球菌菌懸液的制備同1.5。SALy102凍干粉用1×PBS梯度稀釋至不同初始濃度(1 500、750、375、187.50和93.75 μg/mL)。按照SALy102 10 μL/孔、菌懸液50 μL/孔先后加入至96孔板,使SALy102的終濃度為15.63、31.25、62.50、125和250 μg/mL(表1),于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0、1、2、3和5 h,檢測每孔OD600 nm值。對(duì)照組中使用10 μL 1×PBS 替代10 μL SALy102溶液。

表1 細(xì)菌裂解蛋白SALy102體外抗菌試驗(yàn)各組溶液配制方法

1.7 SALy102對(duì)偽中間型葡萄球菌的最小抑菌濃度(Minimal inhibit concentration,MIC)和最小殺菌濃度(Minimum bactericidal concentration,MBC) MIC和MBC的測定方法參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法[11]。具體操作:偽中間型葡萄球菌于MHB培養(yǎng)液中37 ℃培養(yǎng)6 h,調(diào)整菌液濃度為1×106CFU/mL。將SALy102凍干粉用1×PBS倍比稀釋至濃度分別為512、256、128、64、32、16、8、4、2和1 μg/mL。于96孔板前10列各孔中加入50 μL倍比稀釋的SALy102,然后加入調(diào)整濃度的菌液50 μL。于第11列各孔中加入MHB培養(yǎng)基和調(diào)整濃度的菌液各50 μL,作為陽性對(duì)照。于第12列各孔中加入100 μL MHB培養(yǎng)基,作為陰性對(duì)照。37 ℃培養(yǎng)16～20 h,無渾濁或無菌體沉淀的孔對(duì)應(yīng)的最小濃度即為MIC。從藥物濃度高于MIC的各孔中分別吸取50 μL混合液,涂布于BHI固體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)18～24 h后,觀察有無細(xì)菌生長,無細(xì)菌生長平板對(duì)應(yīng)的最低濃度即為MBC。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 每個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù),數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以P>0.05為差異不顯著,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離和鑒定 經(jīng)PCR擴(kuò)增和序列比對(duì),本試驗(yàn)從皮膚或耳道感染的患犬中共分離鑒定出12株偽中間型葡萄球菌臨床分離菌株。

2.2 SALy102的抗菌活性 結(jié)果如圖1所示,培養(yǎng)1 h后,終濃度為250 μg/mL的SALy102裂解蛋白對(duì)12株偽中間型葡萄球菌的裂解率介于55.6%～93.4%,對(duì)金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的裂解率為72.6%。說明SALy102對(duì)12株偽中間型葡萄球菌和金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株均有非常強(qiáng)的抗菌活性。

圖1 SALy102的抗菌活性

2.3 SALy102對(duì)偽中間型葡萄球菌的時(shí)間-殺菌曲線 結(jié)果如圖2所示,SALy102可以快速裂解偽中間型葡萄球菌,且SALy102終濃度為15.63 μg/mL時(shí),也可在1 h內(nèi)使偽中間型葡萄球菌的濁度明顯降低(P<0.05),說明SALy102對(duì)偽中間型葡萄球菌具有非常高的裂解活性。

圖2 SALy102對(duì)偽中間型葡萄球菌的時(shí)間-殺菌曲線

2.4 SALy102對(duì)偽中間型葡萄球菌的MIC和MBC 測定SALy102對(duì)12株偽中間型葡萄球菌臨床分離株的MIC和MBC,結(jié)果顯示,當(dāng)SALy102的濃度為32 μg/mL時(shí),孔中未見菌液渾濁和菌體沉淀,故SALy102對(duì)偽中間型葡萄球菌的MIC為32 μg/mL;從藥物濃度高于32 μg/mL的各孔中分別吸取混合液接種于BHI固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng),當(dāng)SALy102濃度為64 μg/mL時(shí),未見細(xì)菌生長,故SALy102對(duì)偽中間型葡萄球菌的MBC為64 μg/mL。

3 討論

偽中間型葡萄球菌能夠引起皮膚、耳道和其他組織的嚴(yán)重感染,是犬膿皮病的主要病因[1]。隨著抗生素的廣泛使用,獸醫(yī)臨床中耐藥偽中間型葡萄球菌的情況也越來越嚴(yán)重,這給臨床治療帶來了極大的困難。因此,研發(fā)新型抗偽中間型葡萄球菌的藥物具有非常重要的意義。

裂解酶可以特異性水解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖使細(xì)菌裂解。因肽聚糖結(jié)構(gòu)在細(xì)菌中高度保守,且產(chǎn)生裂解酶抗性的突變對(duì)細(xì)菌來說非常有害,使得細(xì)菌對(duì)裂解酶產(chǎn)生耐藥性的可能性很小[12]。已有研究證明,裂解酶在體外能高效且特異性殺死耐藥細(xì)菌[13-14]。裂解酶的作用靶點(diǎn)在細(xì)胞外,其殺菌機(jī)制不依賴胞內(nèi)靶蛋白,故不受細(xì)菌耐藥性的影響。研究發(fā)現(xiàn),噬菌體裂解酶與抗生素聯(lián)合用藥可以降低抗生素的用量,降低細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的速率,也可以使耐藥細(xì)菌再次對(duì)抗生素敏感[15-16]。因此,裂解酶正逐漸成為預(yù)防和治療細(xì)菌感染的替代藥物。

本試驗(yàn)使用比濁法測定SALy102裂解蛋白對(duì)偽中間型葡萄球菌的裂解活性,結(jié)果顯示,SALy102對(duì)偽中間型葡萄球菌具有較高的裂解率;MIC和MBC試驗(yàn)結(jié)果也顯示,SALy102對(duì)從臨床中分離的偽中間型葡萄球菌表現(xiàn)出優(yōu)良的抗菌活性;時(shí)間-殺菌曲線結(jié)果顯示,SALy102的裂解率在1 h內(nèi)即可達(dá)到峰值,表明其可在1 h之內(nèi)快速裂解偽中間型葡萄球菌。相較于抗生素需要數(shù)小時(shí)才能發(fā)揮抗菌作用,裂解蛋白的抗菌速度更快,這是SALy102在臨床應(yīng)用中的優(yōu)勢之一。值得注意的是,在時(shí)間-殺菌曲線中,當(dāng)SALy102濃度為125和250 μg/mL時(shí),隨著時(shí)間的延長,OD600 nm值未見明顯增加,說明SALy102在此濃度下可以較好的抑制和裂解偽中間型葡萄球菌。但當(dāng)SALy102濃度≤ 62.5 μg/mL時(shí),隨著時(shí)間的延長,OD600 nm值明顯增加,原因可能是SALy102在較低的濃度下無法完全裂解偽中間型葡萄球菌,故偽中間型葡萄球菌持續(xù)生長。這表明SALy102的殺菌效果具有劑量依賴性。此外,本試驗(yàn)測定SALy102對(duì)偽中間型葡萄球菌的MBC為62.5 μg/mL,而在時(shí)間-殺菌曲線中,當(dāng)SALy102濃度為62.5 μg/mL時(shí),作用1 h后菌液OD600 nm值仍然增加,可能是因?yàn)樵跁r(shí)間-殺菌曲線中的菌液濃度比MBC測定時(shí)的菌液濃度至少高100倍,導(dǎo)致MBC濃度菌液無法完全裂解偽中間型葡萄球菌,細(xì)菌繼續(xù)生長。

綜上所述,本試驗(yàn)初步評(píng)估裂解蛋白SALy102對(duì)犬源偽中間型葡萄球菌的抗菌作用,結(jié)果顯示,SALy102對(duì)偽中間型葡萄球菌的抗菌作用顯著,具有用于臨床治療犬皮膚偽中間型葡萄球菌感染的潛力。下一步試驗(yàn)將集中分析SALy102對(duì)偽中間型葡萄球菌的作用特點(diǎn),為后續(xù)SALy102的臨床應(yīng)用提供更完善的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。