戎成寶, 孫 輝, 于 斌

(1.浙江理工大學 紡織科學與工程學院(國際絲綢學院), 浙江 杭州 310018;2.浙江省現代紡織技術創(chuàng)新中心, 浙江 紹興 312000)

在過去的幾十年里,全世界范圍內細菌抗生素耐藥性的增加已經對公共健康構成了嚴重威脅。不良的殺菌、抗菌方法可能會增加與傷口感染有關的風險[1]?？咕徔椘穼毦那秩胗凶韪糇饔?且能夠抑制細菌的生長和繁殖,因此,開發(fā)綠色、安全和耐用的抗菌紡織品,以保護傷口不受耐藥性細菌的影響十分必要。

抗菌納米纖維膜因其比表面積高[2]、納米多孔、價低、制備方法簡單等特點,已成為研究人員關注的焦點[3-6]。用于抗菌敷料的靜電紡絲纖維膜不僅能保護傷口免受感染,同時也應對人體無毒、對環(huán)境友好[7]。聚乳酸(PLA)由于其獨特的生物降解性和生物相容性,已被廣泛應用于生物醫(yī)學、皮膚組織工程和食品包裝等行業(yè)[8-9]。但PLA自身不具有抗菌性,在抗菌材料的應用方面受到了限制,通常需對PLA進行抗菌改性來解決這一問題。

納米合金由于其較高的比表面積和表面活性,對細菌的黏附、生長和擴散具有強大的抑制能力,即使在較低的濃度下也顯示出明顯的抗菌特性[10]。近年來,銀-銅雙金屬納米粒子由于原子間的靈活配置,可形成多種微觀結構,且加入的元素之間具有突出的協(xié)同效應,在抗菌方面取得了新的進展與應用[11-12]。Nowak等[13]研究表明,銀-銅雙金屬體系的抑菌性能相對于單金屬銀、銅得到了很大的提高。Benjamín等[14]發(fā)現銀-銅雙金屬納米顆粒(Ag-Cu NPs)通過細胞膜錯位破壞細菌的生長能力,導致細菌滲漏和細胞死亡,并系統(tǒng)闡述了Ag-Cu NPs在廣譜抗菌機制中的構效關系。與單一金屬體系相比,Ag-Cu NPs的活性范圍更廣,活性更強,對更多的細菌菌株有效[15-16],是一種很有前景的抗菌劑。

本文通過簡單綠色的方法合成了粒徑約為32 nm的Ag-Cu NPs,并通過調整Ag-Cu NPs與PLA的共混比例制備了不同組成的Ag-Cu NPs/PLA復合納米纖維膜。研究了纖維膜的形貌、組成結構和親水性等,測試分析了其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性,以期為具有抗菌性能的PLA復合納米纖維膜在醫(yī)療衛(wèi)生領域的應用提供參考。

1 實驗部分

1.1 實驗材料和儀器

材料:硝酸銅三水合物(Cu(NO3)2·3H2O,上海易恩化學技術有限公司);硝酸銀(AgNO3,常州市國宇環(huán)?？萍加邢薰?;二氯甲烷、L-抗壞血酸(上海麥克林生化科技有限公司);氫氧化鈉(NaOH,天津市永大化學試劑有限公司);PLA(相對分子質量為160 000,美國 Nature Works 公司);丙酮(杭州雙林化工試劑有限公司);氯化鈉(杭州高晶精細化工有限公司);營養(yǎng)瓊脂、酵母浸粉、蛋白胨(杭州百思生物技術有限公司);金黃色葡萄球菌、大腸桿菌(北京保藏生物科技有限公司)。

儀器:Ultra55 型熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡、Zeiss Ultra 55元素面能譜儀(德國Carl Zeiss AG公司);D8 Discover 型高分辨X 射線衍射儀(德國Bruker AXS公司);Nicolet5700 型傅里葉紅外光譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司);DZF-6050型真空箱(上海精宏試驗設備有限公司);JY-82B接觸角測試儀(承德鼎盛儀器有限公司)。

1.2 試樣的制備

1.2.1 Ag-Cu NPs的制備

采用化學還原法制備Ag-Cu NPs。首先用去離子水制備以下溶液:硝酸銀(0.01 mol/L)、硝酸銅(0.01 mol/L)和抗壞血酸(0.01 mol/L)。實驗在60 ℃水浴鍋中進行,將200 mL抗壞血酸溶液用NaOH溶液調節(jié)pH值到堿性,然后將100 mL硝酸銀溶液和100 mL硝酸銅溶液均勻混合,在連續(xù)的機械攪拌下逐滴滴入至抗壞血酸溶液中。當反應完成后,將得到的懸浮液在10 000 r/min下離心15 min得到黑色粉末。用丙酮溶液洗滌粉末并進行離心分離(10 000 r/min,30 min),重復5次以除去多余的雜質,得到Ag-Cu NPs,最后將其在真空烘箱中干燥,并避光儲存。整個制備過程速度快、成本低、無有機溶劑且不產生有毒廢料,制備方法綠色環(huán)保。

1.2.2 Ag-Cu NPs/PLA復合納米纖維膜的制備

采用相分離法通過靜電紡絲技術制備了不同組成的Ag-Cu NPs/PLA復合納米纖維膜,具體制備流程圖如圖 1 所示。

首先,將一定質量的PLA溶解在二氯甲烷與丙酮(二者質量比為4∶1)的混合溶劑中,制備質量分數為15%的PLA紡絲液。然后分別將相對于PLA質量1%、3%、5% 和7% 的Ag-Cu NPs加入到PLA紡絲液中(具體質量配比如表 1 所示),在室溫下超聲波攪拌2 h,最后將所得靜電紡絲溶液裝入10 mL一次性注射器中進行靜電紡絲,得到不同組成的Ag-Cu NPs/PLA復合納米纖維膜。紡絲速度為3 mL/h,電壓為15 kV,針尖到收集器距離為15 cm,溫度為25 ℃,收集器轉速為100 r/min。將所制備的納米纖維膜通風干燥24 h,以去除殘留的溶劑。

表1 復合納米纖維膜組成配比表Tab.1 Compositions of electrostatic spinning membranes

圖1 Ag-Cu NPs/PLA復合納米纖維膜的制備路線圖Fig.1 Preparation route scheme of Ag-Cu NPs /PLA composite nanofiber membranes

1.3 測試與表征

1.3.1 表面形貌觀察及纖維直徑測試

采用掃描電子顯微鏡觀察Ag-Cu NPs和復合納米纖維膜的表面形貌。工作電壓為 3 kV,工作距離為8.5 mm。用 Image J 軟件分別對電鏡照片中的100 個顆粒和100 根纖維進行平均值和標準方差計算。

1.3.2 表面元素分布測試

采用高分辨X射線能譜分析儀對復合納米纖維膜的表面元素進行分析,采用元素面能譜儀觀察單根纖維中Ag-Cu NPs的分布情況。

1.3.3 結晶結構測試

采用X 射線衍射儀測試樣品的結晶結構,掃描范圍為 30° ～ 80°,掃描速度為 5 (°) /min。用 MDI Jade 6 軟件對XRD圖譜進行分峰擬合后,分析復合納米纖維膜的結晶特性。

1.3.4 化學結構測試

采用傅里葉紅外光譜儀測試復合納米纖維膜的化學結構,掃描范圍為4 000～500 cm-1,分辨率為2 cm-1。

1.3.5 水接觸角測試

將復合納米纖維膜裁成 1 ×1 cm后,貼在載玻片上,用視頻接觸角測定儀測量樣品的水接觸角,將單滴2 μL水滴至樣品表面,等待3 s直至平衡,測量多次取平均值。

1.3.6 抗菌性能測試

參照GB/T 20944.3—2008《紡織品 抗菌性能的評價 第3部分:振蕩法》,測試不同樣品對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌性能,測試時間為18 h。以純PLA 納米纖維膜為對照樣,1%Ag-Cu NPs/PLA、3%Ag-Cu NPs/PLA、5%Ag-Cu NPs/PLA和7%Ag-Cu NPs/PLA為測試樣,每份樣品稱取(0.75±0.05)g,根據下式計算活菌濃度和測試樣的抑菌率,每個樣品分別測試3次取平均值。

式中:Y為抑菌率,%;Wt為對照樣的菌落平均數;Qt為測試樣品的菌落平均數。

2 結果與討論

2.1 表面形貌分析

圖 2 為Ag-Cu NPs和Ag-Cu NPs/PLA的掃描電鏡照片。從圖 2(a)可以看出,Ag-Cu NPs呈現不規(guī)則球形形態(tài)。通過高分辨率圖像分析得到Ag-Cu NPs的平均直徑為(32.22±5.75)nm。從圖2(b)可看出,PLA納米纖維的直徑均勻,表面粗糙,具有多孔結構,多孔納米纖維的形成取決于2個重要因素:靜電紡的揮發(fā)性溶劑和環(huán)境濕度[17],當溶劑揮發(fā)且環(huán)境濕度較高時,水蒸氣在納米纖維表面凝結并形成水滴,隨著蒸發(fā)冷卻和纖維表面水的滲透,從而制備出多孔PLA納米纖維[18]。從圖2(c)～(f)可以看出,加入Ag-Cu NPs后,復合納米纖維表面粗糙,未觀察到顆粒存在,這可能是因為在靜電紡絲過程中,Ag-Cu NPs被包裹分散在PLA基體內。此外,纖維表面仍有大量的小孔,但小孔的數量相對于純PLA納米纖維較少,小孔直徑相對于純PLA納米纖維略大,這是因為Ag-Cu NPs的加入導致紡絲液導電率增大,在靜電紡絲時射流攜帶的電荷量增加,從而增強了射流的不穩(wěn)定性,溶劑難以完全揮發(fā),影響了孔結構和纖維的形成,可紡性變差[19]。

圖2 Ag-Cu NPs、PLA與不同組成的Ag-Cu NPs/PLA的掃描電鏡照片Fig.2 SEM images of Ag-Cu NPs,PLA and different compositions of Ag-Cu NPs/PLA composite nanofiber membranes

圖3 PLA及不同組成的Ag-Cu NPs/PLA復合納米纖維膜纖維的平均直徑Fig.3 Average diameters of PLA and different compositions of Ag-Cu NPs /PLA composite nanofiber membranes

圖4 Ag-Cu NPs/PLA復合納米纖維膜單根纖維的元素分布圖Fig.4 Element mapping of Ag-Cu NPs/PLA composite nanofiber membranes for single fiber

2.2 纖維直徑分析

圖 3 為納米纖維膜的纖維直徑分布圖?？梢钥闯?Ag-Cu NPs/PLA復合納米纖維膜中纖維平均直徑均小于純PLA納米纖維的平均直徑,這是因為Ag-Cu NPs的加入導致噴出的射流表面積累了更高的電荷密度,靜電紡絲射流攜帶的整體電荷明顯增加[20],在電場作用下射流可以克服自反力獲得更高的伸長力,因此,隨著電荷密度的增加,纖維的直徑大大減小,且分布變得更窄[21]。但隨著Ag-Cu NPs質量分數的增加,Ag-Cu NPs/PLA復合納米纖維膜纖維平均直徑又不斷增加,這是因為隨著Ag-Cu NPs占比的增加,紡絲液濃度、黏度增大,從而導致了纖維直徑的明顯增加。

2.3 元素分析

復合納米纖維膜中各元素的含量如表 2 所示。結果表明,純PLA納米纖維膜表面僅含有碳和氧元素,加入Ag-Cu NPs后,復合納米纖維膜表面出現銀和銅元素,說明Ag-Cu NPs被包裹在PLA基體中。單根纖維中銀、銅元素區(qū)域分布如圖 4所示?？梢钥闯?銀、銅元素沿著纖維徑向排列,說明Ag-Cu NPs與PLA共混噴絲時,Ag-Cu NPs沿著纖維拉伸方向均勻分布。

表2 靜電紡絲纖維膜表面元素含量Tab.2 Surface element contents of electrospun fiber membranes

2.4 結晶結構分析

圖5為PLA及不同組成的Ag-Cu NPs /PLA復合納米纖維膜的X射線衍射圖。純PLA納米纖維膜在2θ為10° ～ 20°之間出現1個廣泛的衍射峰,表明其無定形的性質。對于不同組成的Ag-Cu NPs/PLA復合納米纖維膜,其XRD曲線在2θ為 42.7°、50.2°和73.9° 處出現了與金屬Cu相關的不同衍射峰,分別對應Cu的(111)、(200)、(220)晶面;而在2θ為 38.4°、44.4°、64.8°和77.1° 處出現了歸因于Ag的(111)、(200)、(220)和(311)晶面的衍射峰[22]。除此之外,在2θ為 36.7°和61.6° 處還出現了歸屬于Cu2O的衍射峰,這是因為在紡絲過程中,聚合物溶液噴射成絲時溶劑揮發(fā)使空氣中的氧氣與Ag-Cu NPs接觸,導致銅發(fā)生部分氧化所致。上述結果也表明,Ag-Cu NPs已混入復合納米靜電紡絲纖維膜中,這與2.3節(jié)中分析的結果一致。

圖5 PLA及不同組成的Ag-Cu NPs/PLA復合納米纖維膜的XRD圖譜Fig.5 XRD patterns of PLA and different compositions of Ag-Cu NPs /PLA composite nanofiber membranes

2.5 化學結構分析

圖6為PLA與不同組成的Ag-Cu NPs /PLA復合納米纖維膜的紅外光譜圖。Ag-Cu NPs與PLA的相互作用和相行為可以通過紅外光譜分析確定[23]。

圖6 PLA及不同組成的Ag-Cu NPs/PLA復合納米纖維膜的紅外光譜圖Fig.6 FT-IR spectra of PLA and different compositions of Ag-Cu NPs/PLAcomposite nanofiber membranes

圖7 PLA與不同組成的Ag-Cu NPs/PLA復合納米纖維膜的水接觸角Fig.7 Water contact angles of PLA and different compositions of Ag-Cu NPs/PLA composite nanofiber membranes

2.6 水接觸角分析

圖 7示出PLA及不同組成的Ag-Cu NPs/PLA復合納米纖維膜的水接觸角?？梢钥闯?純PLA膜的水接觸角約為135°,顯示出固有的較差的親水性;加入Ag-Cu NPs后,Ag-Cu NPs/PLA的水接觸角略有下降,這是因為加入的Ag-Cu NPs具有一定的親水性。

2.7 抗菌性能分析

表 3 示出對照組、PLA及Ag-Cu NPs/PLA復合納米纖維膜對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率?？梢钥闯?純PLA納米纖維膜對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌能力弱。對于Ag-Cu NPs/PLA來說,其抑菌率均大于96%,這主要是因為銀銅雙金屬納米粒子的引入,使銀、銅離子的釋放達到殺菌性能。研究表明:在復合材料中存在銅和銀納米粒子的協(xié)同作用,從而使材料對革蘭氏陽性菌和陰性菌均表現出良好的抑菌活性[28-29],無論銀銅比例如何,對革蘭氏陰性菌、陽性菌和白色念珠菌均表現出較強的抑菌效果[30],這種增強的抗菌效果可能與銀銅合金形成過程中銀離子的釋放直接相關[31]。隨著Ag-Cu NPs含量的增加,復合納米纖維膜的抑菌率不斷增加,這是因為NPs的抑菌活性與其濃度呈顯著正相關[32]。當添加Ag-Cu NPs為 7% 時,Ag-Cu NPs/PLA顯示出很高的抗菌活性,對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率均分別高達 99.29% 和 99.35%,且Ag-Cu NPs/PLA對大腸桿菌的抗菌效果都優(yōu)于金黃色葡萄球菌,這是因為金黃色葡萄球菌的細胞壁比大腸桿菌厚,所以細胞壁較薄且蛋白質含量較高的大腸桿菌更易受到離子攻擊。

表3 PLA與不同組成的Ag-Cu NPs/PLA復合納米纖維膜的抑菌率Tab.3 Antibacterial efficiencies of PLA and different compositions of Ag-Cu NPs /PLA composite nanofiber membranes

3 結 論

1)以銀和銅的硝酸鹽溶液為原料,抗壞血酸為還原劑,采用化學還原法合成了銀-銅雙金屬納米粒子(Ag-Cu NPs),然后利用靜電紡絲技術制備了Ag-Cu NPs/聚乳酸(PLA)復合納米纖維膜。通過觀察發(fā)現,復合納米纖維膜表面多孔、粗糙,Ag-Cu NPs包覆在PLA納米纖維內且均勻地沿著纖維拉伸方向排列。相較于純PLA纖維膜,Ag-Cu NPs/PLA復合納米纖維膜的纖維直徑下降。

2) Ag-Cu NPs與PLA之間僅發(fā)生物理作用,未產生明顯的化學作用;相較于純PLA納米纖維膜,Ag-Cu NPs/PLA復合納米纖維膜水接觸角略有下降。

3)Ag-Cu NPs/PLA復合納米纖維膜對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有良好的抑菌性,當Ag-Cu NPs為7%時,Ag-Cu NPs/PLA對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率超過99%,實現了對其的高效抗菌作用。