陳錢正 黃宇捷 顧春淼

瑞芬太尼是一種強效的阿片受體激動劑,主要適用于手術期間的麻醉維持。但其誘導的痛覺過敏(remifentanil-induced hyperalgesia, RIH)已成為公眾關注的臨床問題[1]。越來越多的證據(jù)強調(diào),RIH是一種矛盾現(xiàn)象,即在手術期間接受瑞芬太尼治療疼痛的患者在術后可能會對某些疼痛刺激更敏感[2]。簡而言之,術中給予瑞芬太尼干預能夠引起術后痛覺敏感化,從而加劇術后疼痛并促進疼痛慢性化,而并沒有起到預想中的阿片類藥物的鎮(zhèn)痛作用[3-4]?？傊?瑞芬太尼能夠劑量依賴地增加術后急性疼痛的發(fā)生率,極大地限制了阿片類藥物的臨床應用[5]。地佐辛(Dezocine)是一種具有強效鎮(zhèn)痛作用的阿片受體部分激動劑/拮抗劑,目前已廣泛用于慢性疼痛管理和術后疼痛。與嗎啡相比,地佐辛鎮(zhèn)痛效果更強且副作用較小[6]。既有的研究證明,地佐辛能夠減輕術后疼痛,尤其是在RIH管理中發(fā)揮著重要的鎮(zhèn)痛作用[7-9];然而,筆者發(fā)現(xiàn)地佐辛對術后疼痛的調(diào)節(jié)機制和治療作用尚未完全闡明。因此,本研究旨在利用RIH大鼠模型確定地佐辛對術后痛覺過敏的鎮(zhèn)痛效果及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 5～6周齡SPF級雄性SD大鼠,體重240～250 g,由中國科學院動物研究所提供,許可證號:SYXK(京)2017-0002。所有大鼠飲食飲水自由,均飼養(yǎng)于恒溫(21±2)℃和濕度(55±15)%的條件下,光/暗循環(huán)12 h。所有動物在實驗前至少3 d適應實驗室環(huán)境。另外,這項研究獲得了南通市海門區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會批準。實驗動物的護理和動物福利相關工作均遵守《實驗動物護理和使用指南》(1996版)。

1.2 試劑與儀器 瑞芬太尼購自山東羅欣藥業(yè)集團股份有限公司公司;地佐辛購自揚子江藥業(yè)集團有限公司;異氟醚購自北京百靈威科技有限公司;ELASA試劑盒[腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、IL-10]購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;TRIzol裂解液購自美國Invitrogen公司。用cDNA Reverse Transcription kit購自北京寶日醫(yī)生物技術有限公司;SYBR Green和cocktail均購自美國Roche公司;anti-TLR4抗體、anti-NF-κB抗體、anti-TRPA1抗體、anti-GAPDH和辣根酶標記鼠抗山羊IgG(H+L)均購自Cell Signaling Technology公司;BCA蛋白定量試劑盒購自北京全式金科技有限公司;電子觸覺測量儀和足底測試鎮(zhèn)痛儀均購自上海欣軟科技有限公司;多功能酶標儀購自美國Thermo公司,Bio-Rad凝膠成像分析儀購自美國伯樂公司。

1.3 構建切口痛大鼠模型 根據(jù)Gu等[10]研究,通過足底切口手術建立切口痛大鼠模型。首先,用7%異氟醚麻醉大鼠后,用75%乙醇擦洗大鼠的左后爪。然后,做一個1 cm長的切口,從腳跟處開始,延伸到腳趾,穿過左后爪的皮膚和腳底筋膜,分離足底肌肉,縱向切割。隨后,將暴露的足底肌肉切口用無菌紗布止血,縫合切口,并用紅霉素軟膏覆蓋傷口以防止感染。每天對大鼠的切口進行檢查,將有傷口開裂或感染的大鼠排除在研究之外。

1.4 動物分組 40只SPF級雄性大鼠按照隨機數(shù)字表法分為對照組(C組)、切口痛組(I組)、瑞芬太尼輸注+切口痛組 (R+I組)、瑞芬太尼聯(lián)合地佐辛輸注+切口痛組(R+D+I組),每組10只。其中,C組不做任何處理。R+I組和R+D+I組于造模前靜脈輸注瑞芬太尼0.01 mg·kg-1·min-1,持續(xù)60 min,I組造模前僅輸注等量0.9%氯化鈉溶液,速度為0.01 mL/min,持續(xù)60 min。隨后,基于左后足底切口術對I組、R+I組和R+D+I組大鼠建立切口痛模型。R+D+I組大鼠在瑞芬太尼輸注前通過尾靜脈注射給予0.5 mg/kg地佐辛預處理。給藥處理后第7天,麻醉處死所有大鼠,進行大鼠行為學評價(n=10),檢測大鼠脊髓背角組織中炎性因子表達(n=4),檢測大鼠脊髓背角組織中TLR4、NF-κB和TRPA1 mRNA和蛋白表達(n=6)。

1.5 大鼠行為學評價 測量均在安靜的溫控室中進行,并于術前和首次給藥后2、6、12、24 h進行行為學測試。

1.5.1 機械縮足反應閾(paw withdrawal threshold, PWT):評估大鼠的機械性痛覺超敏。采用電子觸覺測量儀確定檢測PWT。將大鼠單獨放置在懸空倒置的透明箱中,箱內(nèi)鋪有鋼網(wǎng),測試前將大鼠暴露于測試箱中30 min以適應環(huán)境。Von Frey纖維絲由安裝在手持式測力計上的塑料尖端組成,垂直地施加在右后爪的足底中部表面,力量逐漸增加。陽性反應是指刺激后抬起、搖晃或舔爪子。測試進行3次,間隔5 min,并計算平均閾值。

1.5.2 熱縮足反應潛伏期(paw withdrawal latency, PWL):評估大鼠的熱痛覺過敏。在足底測試鎮(zhèn)痛儀的幫助下,評估確定3組大鼠在不同時間點的PWL。首先,將大鼠放置在一個可移動的透明塑料籠子里,置于懸空的透明玻璃板上,讓其適應大約15 min。輻射熱源(50 W的投影燈)安裝在透明光滑的玻璃地板下的活動支架上,直接放在右后爪的足底表面下。PWL被定義為從紅外熱刺激開始到爪子從熱源中撤出的時間。測試進行3次,間隔5 min,并計算平均潛伏期。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測大鼠脊髓背角炎性因子表達 在24 h的最后一次行為學測試后,麻醉處死大鼠,沿大鼠后腰中線切開,暴露脊髓組織,快速取出大鼠脊髓背角組織的L4～ L6段,并將其冷凍在-80℃保存。隨后,根據(jù)ELISA試劑盒說明書,檢測各組大鼠脊髓背角組織中相關炎性因子(TNF-α、IL-1β和IL-10)的蛋白表達。

1.7 實時熒光定量PCR檢測大鼠脊髓背角TLR4、NF-κB和TRPA1 mRNA表達 以GAPDH mRNA為內(nèi)參,利用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)檢測各組大鼠脊髓背角組織中TLR4、NF-κB和TRPA1 mRNA的表達。用TRIzol提取總RNA。用cDNA Reverse Transcription kit將RNA反轉錄成cDNA。使用SYBR Green染料按照說明書進行qRT-PCR。PCR反應條件為:50℃ 2 min,94℃ 15 min,94℃ 15 s,56℃ 30 s,72℃ 1min,40個循環(huán)。引物序列如下:GAPDH正向: 5’-CAAGGCTGAGAATGGGAAGC-3’;反向: 5’-GAAGACGCCAGTAGACTCCA-3’。TLR4正向: 5’-TAGCCATTGCTGCCAACATC-3’;反向: 5’-ACACCA ACGGCTCTGGAT AA-3’。p-NF-κB:正向: 5’-AATGCTGATGTGCCTACTCG-3’;反向: 5’-GTAGTCGTGATGCTGATGCT-3’。TRPA1:正向: 5’-CCACCCTGTGTGTAGGGA AT-3’;反向: 5’-AAGGCCATTCCAGGCTGT AT-3’。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對mRNA表達量。

1.8 Westernblot檢測大鼠脊髓背角TLR4、NF-κB和TRPA1蛋白表達 將4組大鼠脊髓背角L4～ L6段,在含有蛋白酶抑制劑cocktail的混合裂解緩沖液中制成勻漿。組織勻漿在4℃下以13 000 r/min離心20 min,收集上清液作為總蛋白。并經(jīng)BCA處理后,確定蛋白濃度。將20 μg蛋白與1× loading bufer混合,100℃變性10 min后,通過8%～12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)凝膠分離,并進一步轉移到經(jīng)過無水甲醇活化的PVDF膜上。然后,封閉液室溫封閉2 h,再與相應的一抗4℃過夜孵育。研究中采用的一抗主要包括針對TLR4(1∶1 000)、p-NF-κB (1∶500)、TRPA1 (1∶1 000)和GAPDH(1∶5 000)。之后,用辣根酶標記鼠抗山羊IgG(H+L)(1∶2 000)室溫孵育2 h。加入超敏ECL化學發(fā)光試劑,檢測膜上的蛋白信號。其中,蛋白的相對表達用Image J軟件進行分析,以GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

2 結果

2.1 造模后4組大鼠不同時間點PWT值比較 造模前4組大鼠PWT在觀察的時間點上變化不明顯(P>0.05)。造模后,I組和I+R組大鼠的PWT隨著造模時間的延長顯著降低(P< 0.05),而R+D+I組大鼠的PWT隨著造模時間的延長顯著增加(P< 0.05)。與C組比較,I組和R+I組大鼠的PWT在術后不同時間點均顯著降低(P< 0.05),而R+D+I組大鼠的PWT均顯著增加(P< 0.05)。與I組比較,R+I組大鼠的PWT在術后不同時間點均顯著降低 (P<0.05),而R+D+I組大鼠的PWT在術后不同時間點均顯著增加(P<0.05)。此外,與R+I組比較,R+D+I組大鼠的PWT在術后不同時間點均顯著增加(P< 0.05)。見表1。

表1 4組大鼠術前和造模后不同時間點PWT值比較 n=10,s,

2.2 造模后4組大鼠不同時間點的PWL值的比較 造模前4組大鼠PWL在觀察的時間點差異無統(tǒng)計學意義 (P>0.05)。造模后,I組和R+I組大鼠的PWL隨著造模時間的延長顯著降低(P<0.05),而R+D+I組大鼠的PWL隨著造模時間的延長降低不明顯(P>0.05)。與C組比較,I組和R+I組大鼠的PWL在術后不同時間點均顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而R+D+I組大鼠的PWL均降低不明顯(P>0.05)。與I組比較,R+I組大鼠的PWL在術后不同時間點均顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05),而R+D+I組大鼠的PWL在術后不同時間點均降低不明顯((P>0.05)。此外,與R+I組比較,R+D+I組大鼠的PWL在術后不同時間點均顯著增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠術前和造模后不同時間點PWL值比較 n=10,s,

2.3 4組大鼠脊髓背角組織中炎性因子比較 I組大鼠脊髓背角促炎因子TNF-α、IL-1β水平均顯著高于C組(P<0.05),而抗炎因子IL-10水平顯著低于C組(P<0.05)。與I組比較,R+I組大鼠脊髓背角促炎因子TNF-α、IL-1β 水平均顯著增加(P<0.05),而抗炎因子IL-10水平顯著降低(P<0.05)。另外,和R+I組相比,R+D+I組大鼠脊髓背角促炎因子TNF-α、IL-1β 水平均顯著降低(P<0.05),而抗炎因子IL-10水平顯著增加(P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠脊髓背角炎性因子表達水平比較 n=4,pg/g,

2.4 4組大鼠脊髓背角中TLR4、p-NF-κB和TRPA1蛋白表達比較 與C組比較,在I組和R+I組中TLR4、p-NF-κB和TRPA1蛋白表達水平顯著增加(P<0.05),而R+D+I組中三種蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)。與I組比較, 在R+I組中TLR4、p-NF-κB和TRPA1蛋白表達水平顯著增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),而R+D+I組中三種蛋白的表達水平顯著降低(P<0.01)。另外,與R+I組比較,R+D+I組, TLR4、p-NF-κB和TRPA1蛋白表達水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表4,圖1。

圖1 4組大鼠脊髓背角蛋白相對表達量比較

表4 4組大鼠脊髓背角TLR4、p-NF-κB和TRPA1蛋白相對表達量比較 n=6,

2.5 4組大鼠脊髓背角TLR4、p-NF-κB和TRPA1 mRNA比較 隨后,我們利用qRT-PCR檢測各組大鼠脊髓背角TLR4、p-NF-κB和TRPA1 mRNA表達水平。結果顯示,與C組相比,I組和R+I組中TLR4、p-NF-κB和TRPA1mRNA表達水平顯著增加(P<0.01),而R+D+I組中三種mRNA的表達水平顯著降低 (P<0.01)。與I組相比, R+I組中TLR4、p-NF-κB和TRPA1mRNA的表達水平增多,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);R+D+I組中TLR4、p-NF-κB和TRPA1mRNA表達水平減少(P<0.01)。另外,與R+I組相比,經(jīng)地佐辛處理后,TLR4、p-NF-κB和TRPA1mRNA表達水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表5。

表5 4組大鼠脊髓背角TLR4、p-NF-κB和TRPA1 mRNA相對表達量比較 n=4,

3 討論

本研究數(shù)據(jù)顯示,TLR4/NF-κB通路和TRPA1分子在RIH大鼠的脊髓背角中異常激活。另外,在RIH大鼠模型中脊髓背角炎癥加劇。然而,經(jīng)地佐辛處理后,RIH大鼠的PWT和PWL顯著增加,痛覺敏感降低,脊髓背角TLR4/NF-κB通路及TRPA1的表達下調(diào),炎性水平降低?？傊?本研究發(fā)現(xiàn)表明,地佐辛能夠通過抑制TLR4/NF-κB通路的過度激活,降下調(diào)TRPA1蛋白和mRNA活性,以及減少脊髓背角炎癥發(fā)揮著減輕大鼠術后痛覺過敏的鎮(zhèn)痛抗炎作用。

本研究通過檢測PWT和PWL分別評價大鼠的機械痛覺超敏和熱痛覺過敏,發(fā)現(xiàn)大鼠術后PWT和PWL均明顯下降,這標志著RIH大鼠模型的成功建立。在基礎研究方面,此前有研究報告稱,地佐辛能夠提高炎癥性疼痛大鼠的PWT和PWL,從而對完全弗氏佐劑誘導的大鼠炎性疼痛產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用[11]。與該研究類似,本研究通過評估RHI大鼠的PWT和PWL證實了地佐辛對RIH大鼠機械痛覺超敏和熱痛覺過敏的促進作用,進一步佐證了地佐辛對大鼠術后痛覺過敏具有緩解作用,并且該結論與Zhou等[12]研究結果一致。然而,導致上述變化的分子機制需要進一步研究。脊髓背角是傷害性信息整合和傳遞的中樞,同時也是病理性疼痛過程中的主要組織損傷部位[13]。因此,本研究進一步探索了瑞芬太尼輸注后脊髓疼痛傳導的具體分子機制。Zhu等[14]研究證實,地佐辛可以保護人髓核細胞免受IL-1β誘導的炎癥、氧化應激和細胞凋亡,能夠有效降低神經(jīng)性疼痛大鼠的炎性細胞因子IL-6和TNF-α的表達。因此,在當前的研究中,本研究收集大鼠脊髓背角L4～ L6段,以檢測TNF-α、IL-1β和IL-10等炎性細胞因子的表達水平。研究發(fā)現(xiàn),與C組比較,瑞芬太尼輸注能夠顯著增加I組大鼠促炎細胞因子TNF-α、IL-1β蛋白表達,同時抑制抗炎細胞因子IL-10的蛋白表達。而地佐辛預處理逆轉了這些因子的變化趨勢。

研究證實,TLR4信號在組織損傷后的痛覺超敏中被激活,而抑制TLR4/NF-κB信號通路能夠減輕術后疼痛[15-17]。TLR4及其下游信號在感覺神經(jīng)元中的激活觸發(fā)了神經(jīng)炎性介質(zhì)的產(chǎn)生如TNF-α和IL-6,這將進一步促進神經(jīng)病理性疼痛[18]。因此,在上述研究的基礎上,本研究通過qRT-PCR和Western blot實驗分別檢測了RIH大鼠脊髓背角TLR4/NF-κB信號通路的活性。結果顯示,瑞芬太尼輸注能夠顯著增加TLR4和p-NF-κB蛋白表達;然而,經(jīng)地佐辛預處理后,RIH大鼠脊髓背角TLR4和p-NF-κB蛋白表達下調(diào)。這提示地佐辛能夠下調(diào)脊髓背角TLR4及其下游信號從而減輕RIH大鼠的痛覺過敏。瞬時受體電位通道蛋白A1 (transient receptor potential ankyrin 1, TRPA1)在外周痛覺神經(jīng)元中功能性表達,作為疼痛信號的轉換器和放大器,介導神經(jīng)病理性痛和炎性痛中的機械痛覺超敏和熱痛覺過敏[19]。研究證實,感覺神經(jīng)元中TRPA1的表達在各種疼痛條件下上調(diào),包括炎癥性和神經(jīng)性疼痛[20-21]。TLR4信號通路的激活能夠上調(diào)TRPA1的表達[22-23],而低表達TRPA1能夠顯著減輕RIH大鼠的機械性痛覺超敏[18]。這提示TRPA1表達在術后痛覺過敏中發(fā)揮著調(diào)控作用。因此,本研究進一步評估了地佐辛對TRPA1在RIH大鼠骨髓背角中的表達變化。結果顯示,地佐辛能夠下調(diào)RIH大鼠脊髓背角TRPA1的mRNA和蛋白表達。表明地佐辛誘導的TRPA1下調(diào)可能介導了RIH大鼠的痛覺過敏。

綜上所述,本研究首次證了地佐辛能夠通過抑制TLR4/NF-κB通路的過度激活,下調(diào)骨髓背角TRPA1 mRNA和蛋白表達,減少骨髓背角炎癥從而發(fā)揮緩解大鼠術后RIH的抗炎鎮(zhèn)痛作用,為RIH的疼痛癥狀提供一種新的潛在治療策略,在一定程度上促進相關阿片類藥物的適當臨床應用。