許漢兵 韓建濤 張成鵬

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是常見的消化道惡性腫瘤之一,位居我國惡性腫瘤病死率第三位,且發(fā)病率、病死率仍呈逐年上升趨勢,嚴重危及國民的生命安全[1]。CRC早期診斷率低、術后復發(fā)轉移率高、化療耐藥導致其預后很差[2],因此了解其癌細胞的增殖、遷移和侵襲對CRC患者至關重要。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一種長度>200個核苷酸的非編碼RNA,在多種疾病中異常表達[3],TMPO反義RNA1(TMPO antisense RNA1,TMPO-AS1)是一種lncRNA,有報道表明其在多種癌癥中高表達,促進癌細胞發(fā)展[4],如在肺癌細胞中,沉默TMPO-AS1上調miR-143-3p表達從而抑制肺癌細胞增殖、遷移及侵襲能力,并誘導癌細胞凋亡[5],但TMPO-AS1在CRC發(fā)展中的作用尚未闡明。miRNAs是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內源性的非蛋白質編碼的RNA分子,能夠與特定的mRNA結合,并在轉錄后負調控基因的表達,其大小為18～25個核苷酸[6]。有研究表明,miR-340-5p在多種癌癥中低表達,上調后可抑制癌細胞的侵襲,轉移等[7],利用軟件分析發(fā)現(xiàn)TMPO-AS1與miR-340-5p有互補結合位點。miRNAs能夠與特定的mRNA結合,并在轉錄后負調控基因的表達,RUNT相關轉錄因子1(Runt-associated transcription factor 1,RUNX1)是RUNX轉錄因子家族的成員,該家族進化高度保守[8],有研究表明RUNX1在CRC組織中高表達,促進CRC轉移[9],利用軟件分析發(fā)現(xiàn)miR-340-5p與RUNX1存在互補結合位點。綜上所述,對其機制做出以下推測:LncRNA TMPO-AS1調節(jié)miR-340-5p/RUNX1軸影響CRC細胞增殖、遷移和侵襲。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人正常結腸上皮細胞HCoEpiC、人CRC細胞SW480、HCT116、LOVO、HT-29均購自普諾賽生物科技有限公司。

1.2 主要試劑 Firefly &Renilla Dual Luciferase Assay Kit購自蘇州宇恒生物;Lipo3000轉染試劑購自默克;CCK-8試劑盒購自上海經(jīng)科化學公司;EDU細胞增殖檢測試劑盒購自銳博生物;RUNX1、PCNA、MMP-2抗體購自CST公司。

1.3 細胞培養(yǎng) 將HCoEpiC、SW480、HCT116、LOVO、HT-29細胞置于含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中,在37℃、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。

1.4 qRT-PCR檢測HCoEpiC、多種CRC細胞中TMPO-AS1、miR-340-5p、RUNX1表達 Trizol試劑提取不同細胞中的總RNA,將獲得RAN逆轉錄為cDNA后,以cDNA為模板進行熒光定量PCR擴增。TMPO-AS1、RUNX1以GAPDH為內參,miR-340-5p以U6為內參,使用2-△△Ct方法計算TMPO-AS1、miR-340-5p、RUNX1的相對表達量。引物序列如下:TMPO-AS1:正向5-TTAGGATTCTTGCGGGTGGT-3;反向5-AGCCAGACCTCTACAATCGG-3’;RUNX1:正向5-GTTTGTCGGTCGAAGTG-GAAGA-3;反向5-AGGGTTAAAGGCAGTG-GAGTGG-3’;GAPDH:正向5’-CTGGGCTACACTGAGCACC-3’;反向5’-AATGGTCGTTGAGGGCAATG-3’;miR-340-5p:正向5-GCGGTTAAAGCAATGAGA-3;反向5-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3’;U6:正向5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’;反向5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.5 細胞分組與轉染 將HCT116細胞分為si-ctrl組(細胞轉染si-ctrl)、si-TMPO-AS1組(細胞轉染si-TMPO-AS1)、mimics NC組(細胞轉染mimics NC)、miR-340-5p組(細胞轉染miR-340-5p mimics)、si-TMPO-AS1+anti-miR-ctrl組(細胞轉染si-TMPO-AS1和anti-miR-ctrl)、si-TMPO-AS1+anti-miR-340-5p組(細胞轉染si-TMPO-AS1和anti-miR-340-5p)。將細胞轉染48 h,進行后續(xù)實驗。

1.6 qRT-PCR檢測6組HCT116細胞中TMPO-AS1、miR-340-5p、RUNX1表達 方法同1.4。

1.7 CCK-8法檢測6組HCT116細胞活力 HCT116細胞轉染48 h后,換取新鮮的培養(yǎng)基并向每個孔中加入CCK-8溶液。孵育2 h后,使用酶標儀監(jiān)測450 nm處吸光度。

1.8 EDU法檢測6組HCT116細胞增殖 HCT116細胞轉染48 h后,每孔加入EDU培養(yǎng)基,孵育2 h,PBS清洗細胞,根據(jù)EDU細胞增殖檢測試劑盒說明依次進行固定、通透、洗滌、染色,最后進行熒光檢測。

1.9 Transwell檢測6組HCT116細胞遷移和侵襲 轉染48 h后,制成細胞懸液,加入Transwell上室,下室加入完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后,擦去未遷移的細胞,固定,結晶紫染色,倒置顯微鏡下觀察細胞計數(shù)。細胞侵襲實驗需提前包被基質膠,其他步驟同遷移實驗。

1.10 Western blot檢測6組HCT116細胞RUNX1、PCNA、MMP-2表達 轉染48 h后,細胞棄去上清,加入RIPA裂解液獲得蛋白,將蛋白用BCA法進行定量后,進行Western blot檢測,具體操作為電泳,轉膜,封閉,孵育一抗(RUNX1、PCNA、MMP-2、GAPDH),孵育二抗,ECL顯色,凝膠成像系統(tǒng)采集圖像,Image J軟件將蛋白條帶進行灰度值分析。

1.11 雙熒光素酶報告基因實驗 構建TMPO-AS1野生型質粒(TMPO-AS1-WT)和突變型質粒(TMPO-AS1-MUT),將TMPO-AS1-WT和TMPO-AS1-MUT分別與mimics NC或miR-340-5p mimics共轉染于HCT116細胞,48 h后,檢測熒光素酶活性。構建RUNX1野生型質粒(RUNX1-WT)和突變型質粒(RUNX1-MUT),將RUNX1-WT和RUNX1-MUT分別與mimics NC或miR-340-5p mimics共轉染于HCT116細胞,48 h后,檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 HCoEpiC細胞與多種CRC細胞中TMPO-AS1、miR-340-5p、RUNX1表達比較 與HCoEpiC細胞比較,不同CRC細胞中TMPO-AS1、RUNX1 mRNA表達顯著性升高,miR-424-5p表達顯著性降低(P<0.05),且HCT116細胞變化結果更顯著,故后續(xù)實驗選擇HCT116細胞。見表1。

表1 HCoEpiC與CRC細胞中TMPO-AS1、miR-340-5p、RUNX1表達比較 n=6,

2.2 6組HCT116細胞TMPO-AS1、miR-340-5p、RUNX1 mRNA水平比較 與si-ctrl組比較,si-TMPO-AS1組HCT116細胞TMPO-AS1、RUNX1 mRNA水平顯著性降低(P<0.05),miR-340-5p mRNA水平顯著性升高(P<0.05);與mimics NC組比較,miR-340-5p組HCT116細胞RUNX1 mRNA水平顯著性降低(P<0.05),miR-340-5p mRNA水平顯著性升高(P<0.05);與si-TMPO-AS1+anti-miR-ctrl組比較,si-TMPO-AS1+anti-miR-340-5p組HCT116細胞RUNX1 mRNA水平顯著性升高(P<0.05),miR-340-5p mRNA水平顯著性降低(P<0.05)。見表2。

表2 6組HCT116細胞TMPO-AS1、miR-340-5p、RUNX1 mRNA水平比較 n=6,

2.3 6組HCT116細胞活力比較 與si-ctrl組比較,si-TMPO-AS1組HCT116細胞活力A值顯著性降低(P<0.05);與mimics NC組比較,miR-340-5p組HCT116細胞活力A值顯著性降低(P<0.05);與si-TMPO-AS1組比較,si-TMPO-AS1+anti-miR-ctrl組HCT116細胞活力A值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與si-TMPO-AS1+anti-miR-ctrl組比較,si-TMPO-AS1+anti-miR-340-5p組HCT116細胞活力A值顯著性升高(P<0.05)。見表3。

表3 6組HCT116細胞活力A值比較 n=6,A值,

2.4 6組HCT116細胞增殖能力比較 與si-ctrl組比較,si-TMPO-AS1組HCT116細胞EDU陽性細胞率顯著性降低(P<0.05);與mimics NC組比較,miR-340-5p組HCT116細胞EDU陽性細胞率顯著性降低(P<0.05);與si-TMPO-AS1組比較,si-TMPO-AS1+anti-miR-ctrl組HCT116細胞EDU陽性細胞率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與si-TMPO-AS1+anti-miR-ctrl組比較,si-TMPO-AS1+anti-miR-340-5p組HCT116細胞EDU陽性細胞率顯著性升高(P<0.05)。見表4,圖1。

圖1 EDU染色檢測6組HCT116細胞增殖(×200)

表4 6組HCT116細胞增殖能力比較 n=6,

2.5 6組HCT116細胞遷移和侵襲能力比較 與si-ctrl組比較,si-TMPO-AS1組HCT116細胞遷移和侵襲數(shù)量顯著性降低(P<0.05);與mimics NC組比較,miR-340-5p組HCT116細胞遷移和侵襲數(shù)量顯著性降低(P<0.05);與si-TMPO-AS1組比較,si-TMPO-AS1+anti-miR-ctrl組HCT116細胞遷移和侵襲數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與si-TMPO-AS1+anti-miR-ctrl組比較,si-TMPO-AS1+anti-miR-340-5p組HCT116細胞遷移和侵襲數(shù)量顯著性升高(P<0.05)。見圖2、3,表5。

圖2 Transwell檢測6組HCT116細胞遷移(×200)

圖3 Transwell檢測6組HCT116細胞侵襲(×200)

表5 6組HCT116細胞遷移和侵襲能力比較 n=6,個,

2.6 6組HCT116細胞RUNX1、PCNA、MMP-2表達比較 與si-ctrl組比較,si-TMPO-AS1組HCT116細胞RUNX1、PCNA、MMP-2蛋白水平顯著降低(P<0.05);與mimics NC組比較,miR-340-5p組HCT116細胞RUNX1、PCNA、MMP-2蛋白水平顯著降低(P<0.05);與si-TMPO-AS1組比較,si-TMPO-AS1+anti-miR-ctrl組HCT116細胞RUNX1、PCNA、MMP-2蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與si-TMPO-AS1+anti-miR-ctrl組比較,si-TMPO-AS1+anti-miR-340-5p組HCT116細胞RUNX1、PCNA、MMP-2蛋白水平顯著性升高(P<0.05)。見表6,圖4。

圖4 6組HCT116細胞中RUNX1、PCNA、MMP-2蛋白表達比較;A si-ctrl組;B si-TMPO-AS1組;C mimics NC組;D miR-340-5p組;E si-TMPO-AS1+anti-miR-ctrl組;F si-TMPO-AS1+anti-miR-340-5p組

表6 6組HCT116細胞中RUNX1、PCNA、MMP-2蛋白表達比較 n=6,

2.7 雙熒光素酶報告基因檢測結果 軟件分析發(fā)現(xiàn)LncRNA TMPO-AS1與miR-340-5p、miR-340-5p與RUNX1均有互補結合位點。雙熒光素酶實驗結果顯示,與TMPO-AS1-WT+mimics NC組比較,TMPO-AS1-WT+miR-340-5p mimics組HCT116細胞熒光素酶活性降低(P<0.05);與RUNX1-WT+mimics NC組比較,RUNX1-WT+miR-340-5p mimics組HCT116細胞熒光素酶活性降低(P<0.05)。見圖5、6,表7、8。

圖5 TMPO-AS1與miR-340-5p的結合位點

圖6 miR-340-5p與RUNX1的結合位點

表7 驗證TMPO-AS1與miR-340-5p的靶向關系 n=6,

表8 驗證miR-340-5p與RUNX1的靶向關系 n=6,

3 討論

CRC是臨床上常見的惡性腫瘤,常出現(xiàn)復發(fā)和轉移[10],因此需要為CRC的診斷和治療確定新的高效分子靶點。最近研究表明,LncRNA TMPO-AS1是一種癌基因,參與多種癌癥的發(fā)展,比如在胃癌組織中TMPO-AS1高度表達,調節(jié)miR-140-5p/SOX4軸促進胃癌細胞遷移,侵襲[11];在宮頸癌細胞中TMPO-AS1過度表達,調節(jié)miR-143-3p和ZEB1軸促進宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲[12]。而筆者發(fā)現(xiàn)關于LncRNA TMPO-AS1在CRC中發(fā)揮作用尚無報道,因此本文首先檢測LncRNA TMPO-AS1在CRC細胞中的表達水平,結果發(fā)現(xiàn)與正常結腸上皮細胞比較,多種CRC細胞中TMPO-AS1高度表達,且HCT116細胞TMPO-AS1水平更高,因此選擇HCT116細胞進行后續(xù)實驗。沉默TMPO-AS1后發(fā)現(xiàn)HCT116細胞增殖、遷移和侵襲均被抑制,表明TMPO-AS1促進HCT116細胞細胞增殖、遷移和侵襲。

miRNA是內源性轉錄后調節(jié)因子,通過與其靶mRNA的3’非翻譯區(qū)結合來介導mRNA降解或翻譯抑制[13]。近年來研究表明miR-340-5p與癌癥進展密切相關,如過表達miR-340-5p后可逆轉FGF23對骨髓瘤細胞的促進作用,表明miR-340-5p抑制骨髓瘤細胞增殖、遷移和侵襲[14];過表達miR-340-5p可抑制喉癌細胞的增殖和侵襲[15];在CRC一篇研究中表明,miR-340-5p在CRC中低表達,circN4BP2L2通過下調miR-340-5p水平,促進結直腸癌的生長和轉移[16];miR-340-5p通過直接靶向ANXA3在結直腸癌中發(fā)揮抑瘤作用,推測可作為結直腸癌預后的標志物[7]。因此猜測miR-340-5p抑制CRC發(fā)展。

本文發(fā)現(xiàn)與正常結腸上皮細胞比較,CRC細胞中miR-340-5p表達下調,將HCT116細胞過表達miR-340-5p后發(fā)現(xiàn),HCT116細胞增殖、遷移和侵襲均被抑制,表明miR-340-5p抑制HCT116細胞增殖、遷移和侵襲。接著軟件分析發(fā)現(xiàn)LncRNA TMPO-AS1與miR-340-5p存在互補結合位點,雙熒光素酶報告基因檢測發(fā)現(xiàn)TMPO-AS1靶向負調控miR-340-5p表達,為了進一步驗證此想法,將細胞沉默TMPO-AS1并且抑制miR-340-5p表達,結果表明抑制miR-340-5p后,可逆轉沉默TMPO-AS1對HCT116細胞的增殖、遷移和侵襲抑制作用,上述研究表明沉默TMPO-AS1靶向上調miR-340-5p表達,從而抑制HCT116細胞增殖、遷移和侵襲。

有趣的是,本文觀察到與正常結腸上皮細胞比較,RUNX1在CRC細胞中高表達,且與miR-340-5p表達呈負相關。RUNX1被證明在多種癌癥中過表達,促進癌細胞的發(fā)展,與癌癥患者預后密切相關,比如在食管癌中,RUNX1a促進腫瘤生長[17];在乳腺癌中,SNORA71C和RUNX1相互作用促進乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[18];在CRC中也有相應的研究,如異常升高RUNX1有助于CRC癌變,有學者使用PrognoScan數(shù)據(jù)庫觀察到RUNX1的表達在CRC中起有害作用[19];RUNX1通過激活Hedgehog信號通路和ABCG2表達來促進CRC增殖和化學抗性[20],上述研究表明RUNX1促進CRC發(fā)展。

本文發(fā)現(xiàn)與正常結腸上皮細胞比較,多種CRC細胞中RUNX1表達上調,沉默TMPO-AS1或過表達miR-340-5p時,RUNX1 mRNA和蛋白水平均被抑制,從而抑制HCT116細胞增殖、遷移和侵襲,表明RUNX1促進HCT116細胞增殖、遷移和侵襲。接著本文軟件分析發(fā)現(xiàn)miR-340-5p與RUNX1存在互補結合位點,根據(jù)上述結果綜合分析猜測miR-340-5p靶向調控RUNX1表達,為進一步驗證此猜想,通過雙熒光素酶報告基因檢測發(fā)現(xiàn)miR-340-5p靶向負調控RUNX1表達,即表明miR-340-5p通過靶向負調控RUNX1從而抑制HCT116細胞增殖、遷移和侵襲。

綜合分析,沉默TMPO-AS1靶向上調miR-340-5p表達,從而下調RUNX1表達,抑制HCT116細胞增殖、遷移和侵襲。本研究尚存在不足之處,僅在細胞水平驗證LncRNA TMPO-AS1調控miR-340-5p/RUNX1軸對HCT116細胞增殖、遷移和侵襲的影響,仍需動物實驗進一步探索。