張振興,李占鴻,王 斌,宋建領(lǐng)*

(1. 云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室,云南 昆明 650224; 2. 威信縣動物疫病預(yù)防控制中心, 云南 威信 657900)

雞呼吸道疫病作為禽類主要傳染病之一[1],已經(jīng)嚴(yán)重威脅了云南省禽類養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展,其表現(xiàn)癥狀主要為咳嗽、打噴嚏、眼睛紅腫流淚、產(chǎn)蛋雞產(chǎn)出畸形蛋等,剖檢特征主要包括鼻竇內(nèi)充滿大量黏液、眼瞼腫脹、喉氣管有炎癥并伴有出血癥狀,脾、腎、肝、肺臟等器官出現(xiàn)淤血且有壞死特征等,尤其是由于部分養(yǎng)殖場環(huán)境衛(wèi)生不達標(biāo)、養(yǎng)殖不合理,更易造成呼吸系統(tǒng)疫病的暴發(fā)和蔓延[2-4]。為進一步探究云南省本土雞呼吸道疫病的主要傳染病因,試驗以2020年昆明、紅河、曲靖、大理、楚雄、昭通等地疑似感染呼吸道疫病的雞養(yǎng)殖場采集的111份樣品為研究對象,進行副雞禽桿菌、雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum, MG)、滑液囊支原體(Mycoplasma synoviae, MS)、新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)、傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus, IBV)、傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus, ILTV)、禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)、鼻氣管鳥桿菌(Omithobacterium rhinotracheale, ORT)等常見雞呼吸系統(tǒng)傳染病病原核酸檢測,為云南省雞養(yǎng)殖場有效防疫并減少生產(chǎn)損失提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料和陽性樣品

病料:在云南省昆明、紅河、曲靖、大理、楚雄、昭通等地出現(xiàn)咳嗽、打噴嚏、呼吸困難等呼吸道癥狀的養(yǎng)雞場采集臨床癥狀明顯的病雞肺臟、脾臟、喉氣管等混合組織樣品111份,冷藏送實驗室檢測,不同地區(qū)采集雞場數(shù)量、規(guī)模、品種和日齡情況見表1。

表1 不同地區(qū)采集雞場信息表Table 1 Information of chicken farms collected in different regions

陽性樣品:副雞禽桿菌、ORT由本實驗室分離鑒定保存,NDV、AIV血凝抑制抗原購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司,IBV、ILTV和MG和MS弱毒疫苗購自云南雄云生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

RNA/DNA核酸提取試劑盒、RT-PCR 試劑盒、PCR試劑盒、DL-2 000 Marker等,均購自寶生物工程(大連)有限公司。超凈工作臺(型號為LA2-4A1),購自ESCO公司;PCR儀(型號為 9700),購自美國ABI公司;凝膠成像系統(tǒng)(型號為 2000),購自美國Bio-Rad公司。

1.3 病料處理及核酸提取

將采集的不同養(yǎng)殖場疑似患病雞的肺臟、脾臟、喉氣管等組織樣品混合剪碎,按照體積比1:10的比例加入生理鹽水充分研磨,研磨的混合物反復(fù)凍融3次,3 000 r/min離心10 min,按照RNA/DNA 核酸提取試劑盒說明書,分別提取組織上清液核酸。

1.4 引物的合成

根據(jù)國內(nèi)外已發(fā)表的副雞禽桿菌基因序列、MG基因序列、MS基因序列、NDV基因序列、IBV基因序列、ILTV基因序列、AIV基因序列、ORT基因序列及參考文獻[5-9],分別由本實驗室設(shè)計引物IC-F/IC-R、MG-F/MG-R、MS-F/MS-R、NDV-F/NDV-R、IBV-F/IBV-R、ILTV-F/ILTV-R、AIV-F/AIV-R、ORT-F/ORT-R,引物信息見表2,引物由北京擎科生物科技有限公司昆明分公司合成。

表2 引物序列信息表Table 2 Information list of primer sequence

1.5 病原核酸的檢測及測序分析

通過RT-PCR或PCR方法分別檢測NDV、AIV、IBV、ILTV、ORT、副雞禽桿菌、MG和MS核酸。RT-PCR 擴增體系 (總體積為 25 μL)) : RNase Free dH2O 8.5 μL,2×1 Step Buffer 12.5 μL,Prime Script 1step Enzyme Mix 1 μL,20 μmol/L 上、下游引物各0.5 μL,模板RNA 2 μL。RT-PCR擴增程序: 50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min; 94 ℃預(yù)變性2 min; 94 ℃變性30 s,45 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min,共35個循環(huán); 72 ℃再延伸7 min。PCR擴增體系(總體積為25 μL) : RNase Free dH2O 8.5 μL, rTaq Buffer 12.5 μL,20 μmol/L上游引物、下游引物各1 μL,模板DNA 2 μL。PCR擴增程序: 95 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性1 min, 50 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1 min,共35個循環(huán);72 ℃再延伸7 min。根據(jù)病原核酸檢測結(jié)果對111份樣品進行呼吸系統(tǒng)病因分析,各病原選擇1至3個陽性樣品的PCR產(chǎn)物委托北京擎科生物科技有限公司昆明分公司進行測序,通過Blast分析對病原進行確診。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原核酸檢測

對111份疑似雞呼吸系統(tǒng)疫病樣品進行8種病原的核酸檢測,副雞禽桿菌核酸陽性樣品21份(圖1A),陽性率為18.92%;MG核酸陽性樣品12份(圖1B),陽性率為10.81%;MS核酸陽性樣品6份(圖1C),陽性率為5.41%;NDV核酸陽性樣品5份(圖1D),陽性率為4.50%;IBV核酸陽性樣品3份(圖1E),2.70%;ILTV核酸陽性樣品44份(圖1F),陽性率為39.64%;AIV核酸陽性樣品10份(圖1G),陽性率為9.00%;ORT核酸陽性樣品21份(圖1H),陽性率為18.92%。

圖1 陽性樣品PCR擴增結(jié)果A. 副雞禽桿菌;B. MG;C. MS;D. NDV;E. IBV;F. ILTV;G. AIV;H. ORT M. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000);1.陽性對照; 2.陰性對照; 3～8.樣品(采集的所有樣品都進行了PCR檢測,圖中只列出了部分樣品的結(jié)果)Fig.1 PCR results of positive samplesA. Avibacterium paragallinarum;B. MG;C. MS;D. NDV;E. IBV;F. ILTV;G. AIV;H. ORT M. DL 2000 DNA Marker; 1. Positive control; 2. Negative control; 3～8. The samples(All samples collected were tested by PCR, and only a subset of the results are shown in the figure)

2.2 病原混合感染分析

在確定樣品單一病原檢測結(jié)果的基礎(chǔ)上,本試驗對樣品混合感染不同病原的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計(表3),結(jié)果表明,有36份檢測樣品為混合感染,占檢測總數(shù)的32.43%,其中有21份檢測樣品混合感染2種疫病,占檢測總數(shù)的18.92%;13份檢測樣品混合感染3種疫病,占檢測總數(shù)的11.71%;2份檢測樣品混合感染4種疫病,占檢測總數(shù)的1.80%。

表3 云南省不同雞場混合感染病原核酸檢測結(jié)果Table 3 Detection results of pathogeny nucleic acid of mixed infection samples in different chicken farms in Yunnan Province

2.3 部分陽性樣品測序分析

試驗選擇部分陽性樣品的PCR產(chǎn)物進行測序,對獲取的序列進行Blast比對分析,結(jié)果表明,陽性樣品序列與Genbank數(shù)據(jù)庫中公布的相同病原序列高度相似。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示,陽性樣品序列分布于同種病原的不同毒株序列之間(圖2到圖10)。以上結(jié)果表明,根據(jù)樣品核酸PCR檢測結(jié)果作出的病原診斷結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

圖2 1份副雞禽桿菌核酸陽性樣品16S rRNA 基因序列進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequence of 1 avibacterium paragallinarum positive sample

圖3 1份MG核酸陽性樣品LP基因序列進化樹Fig.3 Evolutionary tree of LP gene sequence of 1 MG positive sample

圖4 1份MS核酸陽性樣品heat shock ATP-dependent protease基因序列進化樹Fig.4 Evolutionary tree of heat shock ATP-dependent protease gene sequence of 1 MS positive sample

圖5 1份NDV核酸陽性樣品F基因序列進化樹Fig.5 Evolutionary tree of F gene sequence of 1 NDV positive sample

圖6 1份NDV核酸陽性樣品F基因序列進化樹Fig.6 Evolutionary tree of F gene sequence of 1 NDV positive sample

圖7 2份IBV核酸陽性樣品 N基因序列進化樹Fig.7 Evolutionary tree of N gene sequence of 2 IBV positive samples

圖8 1份ILTV核酸陽性樣品TK基因序列進化樹Fig.8 Evolutionary tree of TK gene sequence of 1 ILTV positive sample

圖9 2份AIV核酸陽性樣品HA基因序列進化樹Fig.9 Evolutionary tree of HA gene sequence of 2 AIV positive samples

圖10 3份ORT核酸陽性樣品16S rRNA基因序列進化樹Fig.10 Evolutionary tree of 16S rRNA gene sequence of 3 ORT positive samples

3 討 論

在云南省雞的養(yǎng)殖飼養(yǎng)過程中,呼吸道疫病普遍存在,各日齡雞均可發(fā)生呼吸道疫病感染,治療、防護不合理、不及時等可能會引起多種疾病的交叉感染或繼發(fā)感染,除引起呼吸道明顯癥狀外,還會導(dǎo)致雞生長緩慢甚至死亡的發(fā)生,給云南省養(yǎng)雞業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[9]。引起雞呼吸道疫病的原因和種類有很多,具體包括病毒性病原、細菌性病原與非微生物性病因[1]。病毒性病原如AIV、NDV、IBV、ILTV等是影響雞健康養(yǎng)殖的最重要因素[1,3,6];細菌性病原如副雞禽桿菌、大腸桿菌、支原體、鼻氣管鳥桿菌等單一感染導(dǎo)致病情較輕,但常常與病毒性疫病混合感染,導(dǎo)致雞群發(fā)病率和死亡率升高,仍不可忽視。在養(yǎng)殖條件較差的雞場,其它非微生物性病因仍是雞群發(fā)生呼吸系統(tǒng)的主要因素之一,如飼養(yǎng)密度過大、消毒衛(wèi)生不規(guī)范、季節(jié)更換造成的應(yīng)激反應(yīng)、室內(nèi)溫度不穩(wěn)定、環(huán)境中灰塵或有害氣體過多等,這些都需要引起養(yǎng)殖業(yè)主的注意[2,9]。

2020年在111份疑似發(fā)生呼吸系統(tǒng)疫病病雞中,檢測到副雞禽桿菌和鼻氣管鳥桿菌陽性率均為18.92%,而2017年的陽性率分別為49.12%和33.33%[9],說明2020年云南家禽呼吸道疫病病原中的細菌性病原的比例明顯下降。由病毒(AIV、NDV、IBV、ILTV)引起的病例共計57例,占比為51.35%,值得注意的是,ILTV核酸的陽性率高達39.64%;由支原體(MG和MS)引起的病例共計15例,占比為13.51%,與2017年的檢測陽性率(84.21%)[9]相比下降最為顯著。說明近幾年來云南省家禽養(yǎng)殖規(guī)模化程度越來越高,設(shè)施設(shè)備越來越好,管理比較規(guī)范,減少了條件致病菌性疫病的發(fā)生。但ILT的防控形勢十分嚴(yán)峻,應(yīng)引起家禽養(yǎng)殖場的高度重視,可能存在免疫后帶毒情況,應(yīng)在加強疫苗免疫的同時,做好生物安全措施的執(zhí)行,減少ILT隱性感染造成的經(jīng)濟損失。另外37.84%的病例出現(xiàn)明顯癥狀但未測得病原核酸陽性,說明某些養(yǎng)雞場仍存在管理方面的漏洞,尤其是冬季在做好保溫的同時,合理通風(fēng)換氣、減少雞舍灰塵或有害氣體濃度,注意飼料營養(yǎng)成分均衡、減少應(yīng)激等[10]。

本次檢測發(fā)現(xiàn)單一病原引起雞呼吸道疫病的比例為29.73%,多種病原共同引起雞呼吸道疫病的比例為32.43%,其中2種病原核酸陽性率為18.92%,3種病原核酸陽性率為11.71%,4種病原核酸陽性率為1.80%,說明云南省雞群中多重感染仍然比較嚴(yán)重。在雞群呼吸道疫病防控中,根據(jù)發(fā)病原因,針對性的進行治療和預(yù)防,才能獲得比較理想的防控效果。根據(jù)調(diào)查,多重病原感染的雞群比單一病原感染雞群的呼吸道病情更加嚴(yán)重[11],共感染比例大且嚴(yán)重的原因主要與呼吸道病原體之間協(xié)同致病有一定關(guān)聯(lián)[8]。Feng等[12]研究表明,雞感染H9N2后,可導(dǎo)致機體免疫力下降,進一步導(dǎo)致NDV和IBV免疫失敗,從而增加雞群感染NDV或IBV的幾率。Kleven等也證實[13],當(dāng)發(fā)生共感染時,雞體內(nèi)的MG可阻礙ORT等在體內(nèi)的清除,甚至MG可作為第一病原體,因其抗原的多樣性抑制免疫應(yīng)答,為細菌或病毒性病原體的入侵創(chuàng)造條件。因此,在制定免疫程序中,必須充分考慮疫苗免疫之間的合理間隔時間,2種疫苗或多種疫苗同時免疫的科學(xué)性等因素,提高雞群免疫效果的同時,降低疫苗免疫頻次,降低疫苗免疫對雞群造成的應(yīng)激反應(yīng)。

4 結(jié) 論

云南省2020年度雞呼吸系統(tǒng)疾病由多種病原引起,其中以副雞禽桿菌、ILTV、ORT為主;對感染呼吸道疫病的雞群應(yīng)采取綜合防控措施,制定科學(xué)的免疫程序,以降低呼吸道疫病的發(fā)生率,減少損失。