趙桂新 , 白和平 , 陶 勇 , 張 閆 ,劉 暢 , 張志強 , 吳同壘 , 史秋梅

(河北科技師范學院 河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室,河北 秦皇島 066604)

棒狀桿菌屬細菌(Corynebacterium)可引發(fā)人與多種動物患病,總稱為棒狀桿菌病,主要臨床表現(xiàn)為多種組織和器官發(fā)生化膿性或干酪樣病變[1]。棒狀桿菌屬是高度多樣化的細菌,目前有110多種,其中干燥棒狀桿菌(Corynebacteriumxerosis)是存在于人類皮膚和粘膜中的一種共生生物[2]。干燥棒狀桿菌能夠?qū)е氯说幕撔躁P(guān)節(jié)炎[3],以往有學者認為該菌只有在非正常部位寄居、機體抵抗力下降或外傷感染時才致病,被認為是人畜共患的一般條件性致病菌[4]。如今抗生素頻繁應用大大增加了該菌的耐藥性,越來越多報道證明該菌屬確實在機體抵抗力下降時會引起各類感染,能夠引起嚴重的致命性疾病。現(xiàn)已報道棒狀桿菌屬的優(yōu)勢致病菌種有假結(jié)核棒狀桿菌[5]、紋帶棒狀桿菌[6]和白喉棒狀桿菌[7],其中白喉棒狀桿菌危害最重,對其報道也最多;紋帶棒狀桿菌次之;假結(jié)核棒狀桿菌較少;還有多種棒狀桿菌屬成員被陸續(xù)報道,該菌屬的潛在致病性已經(jīng)得到重視。人類醫(yī)學相關(guān)研究表明,棒狀桿菌是人類皮膚常見菌群之一[8-9],然而在動物方面關(guān)于干燥棒狀桿菌報道的比較少,雖然該菌是一種條件致病菌,并不會引起肉牛的死亡,但是當動物機體抵抗力下降時,會對牛的皮膚、粘膜造成嚴重的危害。因此對該菌的研究具有非常重要的生理衛(wèi)生意義,本研究為干燥棒狀桿菌的防控提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

綿羊血瓊脂平板,購自鄭州安圖生物工程有限公司;抗生素(泰樂菌素、頭孢拉定、青霉素、土霉素、磺胺間甲氧、大觀霉素、磺胺二甲氧、對氧氟沙星、林可霉素、對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、替米考星、氨芐西林、卡那霉素、多西環(huán)素、阿莫西林、頭孢曲松、新霉素)藥敏紙片,均購自北京索萊寶科技有限公司;細菌DNA提取試劑盒,購自Aidlab公司;ID32E生化鑒定試紙條、革蘭氏染色試劑盒,均購自北京博奧闊達生物科技有限公司;pMD-18T載體、2×Taq PCR Master Mix,均購自寶生物工程(大連)有限公司;DH-5ɑ感受態(tài)細胞,購自康為世紀生物科技有限公司;ATB全自動生化鑒定儀,購自法國梅里埃生物公司;PCR擴增儀,購自杭州朗科學儀器公司。

1.2 樣品來源

病樣取自某養(yǎng)殖場4個月左右體型消瘦、呼吸道癥狀較明顯的患病牛只,使用滅菌棉簽,深入鼻腔深處蘸取鼻腔黏液,放置4 ℃送至河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室。

1.3 引物設(shè)計與合成

rpoB基因為RNA聚合酶β亞基編碼基因,適用于棒狀桿菌的鑒定,是16S rRNA基因鑒定的補充方法[10]。因此,參考Khamis等[11]文章中rpoB基因和16S rRNA基因序列,由上海生物工程有限公司合成特異性引物,引物信息見表1。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 分離菌的形態(tài)學鑒定

在超凈臺中取出鼻拭子,將其放入15 mL EP管內(nèi)并在管內(nèi)添加滅菌PBS緩沖液5 mL,隨后充分旋轉(zhuǎn)擠壓使鼻拭子中攜帶的牛鼻腔黏液充分浸入PBS緩沖液內(nèi),5 000 rpm室溫離心2 min,棄掉上清并用移液槍吸凈后用1 mL LB重懸菌體,使用接種環(huán)取一環(huán)菌懸液,在血瓊脂培養(yǎng)基上進行四區(qū)劃線,37 ℃培養(yǎng)過夜,將分離的優(yōu)勢菌落在血瓊脂培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)[10],并命名為CX-21。

1.5 分離菌生化鑒定

挑取血瓊脂培養(yǎng)基上純化的細菌培養(yǎng)物,使用滅菌生理鹽水與比濁儀調(diào)整菌懸液為0.5麥氏比濁度;取出ID 32E生化鑒定卡,每孔添加55 μL菌懸液,0～6孔滴加1滴石蠟油,37 ℃培養(yǎng)24 h,在鑒定卡讀取結(jié)果之前于00孔(IND孔)滴加1滴JAMES用于吲哚反應;然后使用ABI全自動生化檢定儀鑒定菌種,相關(guān)操作按照使用說明執(zhí)行。

1.6 PCR檢測

以提取的細菌基因組DNA為模板,使用1492R、27F引物擴增分離菌的16S rRNA基因,退火溫度為55 ℃;使用rpoB-C2700F/R引物擴增rpoB基因,退火溫度為60 ℃。挑取純化后的單菌落,接種于5 mL無抗生素的 LB液體培養(yǎng)液中,37 ℃、200 rpm培養(yǎng)24 h,按Aidlab公司的細菌DNA快速提取試劑盒中的說明書方案提取細菌的基因組DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆?。擴增體系為20 μL,其中2×Taq PCR Master Mix 10 μL,上游引物、下游引物、細菌基因組DNA各1 μL,超純水補足充至20 μL,反應程序為94 ℃預變性5 min,94 ℃變性45 s,55℃/60 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,30個循環(huán),72 ℃終延伸10 min。取PCR擴增產(chǎn)物5 μL,經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠水平電泳檢測,條帶大小符合預期大小可判斷為陽性。

1.7 分離菌16S rRNA基因序列比對分析

待16S rRNA基因的PCR產(chǎn)物電泳后,進行切膠純化,將純化產(chǎn)物連接至pMD-18T載體上,隨后將加入待用DH5ɑ大腸桿菌感受態(tài)細胞中,冰浴30 min,42 ℃熱激30 s,冰浴2 min后在超凈臺中立即加入1 mL無抗生素LB并在37 ℃、200 rpm復壯1 h,5 000 rpm離心2 min,棄上清,用200 μL ddH2O重懸菌體涂在LB固體培養(yǎng)基中,37 ℃過夜培養(yǎng)。次日,挑取單克隆于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃、200 rpm搖菌后進行PCR驗證。經(jīng)鑒定的陽性菌株送上海某生物工程有限公司測序,將測序后序列在NCBI中進行Blast比對分析,同時下載與干燥棒狀桿菌同種屬菌株的16S rRNA序列,利用MEGAN 7.0軟件進行序列分析比較,并使用MegALign軟件計算一致性。

1.8 抗生素藥敏試驗

按照美國臨床實驗室標準委員會推薦的K-B試紙法檢測分離菌的藥物敏感性,在超凈工作臺中,使用涂布棒將培養(yǎng)至0.5麥氏濁度的菌液均勻的涂在血瓊脂培養(yǎng)基上,取3個不同位置貼上藥敏紙片,在37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后,用量尺來測量抑菌圈的直徑,以此來判定細菌對相應抗菌藥物的敏感程度。并按照相關(guān)標準執(zhí)行試驗操作與結(jié)果判定,取3次重復藥敏試驗抑菌圈的直徑平均值作為最終藥敏試驗結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌的形態(tài)學鑒定

在血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)分離菌(見圖1),24 h后可觀察到該菌生長良好,中等大小且不規(guī)則的淡黃色菌落邊緣粗糙呈凸起狀,接種環(huán)不易挑起;在LB液體培養(yǎng)基中呈沉淀生長,菌液上層輕微渾濁,下層有顆粒狀、片狀沉淀;經(jīng)革蘭氏染色后,在油鏡下觀察該分離菌為排列不規(guī)則的陽性短桿狀球菌。

圖1 分離株菌落形態(tài)及染色結(jié)果A.為分離菌在血瓊脂培養(yǎng)基上生長狀態(tài) B.為分離菌在LB培養(yǎng)基中生長狀態(tài) C.為分離菌經(jīng)革蘭氏染色在鏡下觀察狀態(tài)(1000×)Fig.1 Isolated strain colony morphology and staining resultsA. Growth state of isolated bacteria on blood AGAR medium B. Growth state of isolated bacteria on LB medium C. Isolated bacteria observed under microscope by Gram staining

2.2 分離菌的生化鑒定

使用ID 32E生化鑒定卡鑒定分離菌的32種生化特性,結(jié)果如表2所示。分離菌CX-21能夠發(fā)酵d-海藻糖、α-麥芽糖、d-麥芽糖、蔗糖;具有脂酶、賴氨酸脫羧酶、葡萄糖苷酶活性;不具有L-天冬氨酸芳胺酶、精氨酸雙水解酶、鳥氨酸脫羧酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、尿素酶活性;不能發(fā)酵D-纖維二糖、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、古老糖、鼠李糖;不能利用D-甘露醇、山梨醇、D-阿拉伯醇、側(cè)金盞花醇、肌醇、L-阿拉伯醇;β-N-乙酰葡萄糖胺、5-酮基葡糖酸鹽、D-半乳糖酸鹽同化、丙二酸鹽、酚紅試驗為陰性;吲哚試驗陰性。ATB全自動微生物鑒定儀結(jié)合判讀結(jié)果,判定分離菌株CX-21符合干燥棒狀桿菌生化特性。

表2 CX-21生化鑒定結(jié)果Table 2 Biochemical identification results of CX-21

2.3 PCR檢測

PCR擴增后,取擴增產(chǎn)物5 μL經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,使用凝膠成像儀系統(tǒng)觀察結(jié)果(見圖2),可觀察到1 483 bp的16S rRNA擴增條帶與426 bp的rpoB基因擴增條帶。

圖2 CX-21 16SrRNA和rpoB基因電泳圖 M.DL2000 plus DNA Maker,1.16S rRNA,2.rpoBFig. 2 Electrophoretogram of CX-21 16S rRNA gene and rpoB

2.4 分離菌16S rRNA基因序列比對分析

如圖3所示,經(jīng)過分析比對CX-21與干燥棒桿菌菌株DSM 20743、乳酸棒狀桿菌RW2-5、棒狀桿菌菌株NCFB 2768、CECT 5990、S160、潰瘍棒桿菌菌株IMMIBL-1395的16S rRNA基因序列同源性均高達97%及以上;MEGAN 7.0分析結(jié)果顯示,樣品和干燥棒狀桿菌自然聚為一簇,進一步證明分離菌為干燥棒桿菌。MegALign軟件計算CX-21與干燥棒桿菌菌株DSM 20743、棒狀桿菌菌株NCFB 2768、潰瘍棒桿菌菌株IMMIB L-1395的一致性分別為91.6%、90.1%、88%。

圖3 分離菌16S rRNA基因序列系統(tǒng)進化樹構(gòu)建結(jié)果Fig. 3 Phylogenetic tree construction results of the 16S rRNA gene sequence of the isolated bacteria

2.5 抗生素藥敏試驗

如表3所示,分離菌對泰樂菌素、頭孢拉定、青霉素、土霉素、磺胺間甲氧、大觀霉素、磺胺二甲氧耐藥,對氧氟沙星、林可霉素中敏,對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、替米考星、氨芐西林、卡那霉素、多西環(huán)素、阿莫西林、頭孢曲松、新霉素極度敏感。

表3 CX-21 抗生素敏感性試驗結(jié)果Table 3 CX-21 Antibiotic drug sensitivity test results

3 討 論

本研究從呼吸道癥狀明顯的病牛鼻粘液中分離純化到1株菌,經(jīng)細菌純化培養(yǎng)、革蘭氏染色可得該分離菌符合棒狀桿菌生長特性。由生理生化特性分析得到該分離菌表達酯酶活性與Palacio等[12]有關(guān)多數(shù)棒狀桿菌具有酯酶活性的研究結(jié)果相符;其具有α-葡萄糖苷酶活性的結(jié)果與Renaud等[13]研究結(jié)果相符;該分離菌可發(fā)酵麥芽糖且具有α-葡萄糖苷酶活性,與溫峰琴等[10]分離到的牦牛源干燥棒狀桿菌不能發(fā)酵麥芽糖且無α-葡萄糖苷酶活性等生化特性的研究結(jié)果明顯不符,可能與宿主以及環(huán)境因素有關(guān),造成分離菌株的生化特性有所差異,但是能夠發(fā)酵麥芽糖產(chǎn)酸和有很強的α-葡萄糖苷酶的活性,是少數(shù)能將干燥棒狀桿菌與紋狀體棒狀桿菌和C.amycolatum區(qū)分開來的生化特性;對分離菌CX-21進行分子生物學鑒定,其rpoB基因PCR擴增產(chǎn)物檢測結(jié)果為陽性,與溫峰琴等[10]研究結(jié)果相符,16S rRNA基因鑒定與分析得出該分離菌在進化樹上與干燥棒狀桿菌位于同一進化分支,與棒狀桿菌菌株進化關(guān)系較近為干燥棒狀桿菌,表明分離菌CX-21為干燥棒狀桿菌。通過藥物敏感性試驗進一步研究此菌株,選用18種常用抗生素類藥物對其進行抗生素藥敏試驗,發(fā)現(xiàn)其耐藥性比較嚴重,對氧氟沙星、林可霉素中敏,對泰樂菌素、頭孢拉定等7種藥物耐藥,其多重耐藥性的產(chǎn)生給該病的防治帶來了嚴峻挑戰(zhàn)。Vela等[14]從疑似丹毒豬的肺、有呼吸問題豬的腎和疑似副結(jié)核的山羊肝分離出該菌,本試驗也是從患呼吸道疾病的鼻拭子中分離到該菌,但是否能夠引起牛呼吸道疾病,還需進一步試驗驗證。

4 結(jié) 論

本研究分離純化到一株肉牛源干燥棒狀桿菌,其具有脂酶、賴氨酸脫羧酶、β-葡萄糖苷酶、α-葡萄糖苷酶活性,能夠發(fā)酵海藻糖、麥芽糖、蔗糖,具有多重耐藥性,為了解該菌的生物學特性提供了一定的參考,也為肉牛源干燥棒狀桿菌的防控提供了參考依據(jù)。