張 蓉, 陳光吉, 尚以順* ,梁寶山, 冉偉男,趙明坤,班宋智

(1. 貴州省農(nóng)業(yè)科學院 草業(yè)研究所,貴州 貴陽 550006;2. 思南縣寬坪鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)服務中心,貴州 思南 565100; 3. 長順縣送智養(yǎng)殖場,貴州 長順 550707)

在實際生產(chǎn)中,蛋雞養(yǎng)殖常面臨夏季高溫帶來的產(chǎn)蛋率下降和雞只腸道健康問題。研究表明,高溫環(huán)境下,家禽腸絨毛結(jié)構(gòu)和腸粘膜的完整性易遭受損傷和破壞,進而引起宿主與菌群的微生態(tài)平衡被打破,形成腸道受損-菌群失衡-機體炎癥的惡性循環(huán),嚴重影響家禽生產(chǎn)性能,甚至導致死亡[1-3]。因此,改善高溫環(huán)境條件下家禽的腸道屏障功能和微生物區(qū)系是緩解家禽高溫暴露負面效應的重要途徑。研究發(fā)現(xiàn),植物提取物中的某些活性物質(zhì)如黃酮類、多酚類、皂苷類等可通過抗氧化緩解高溫引發(fā)的生產(chǎn)性能下降、畜禽疾病增加等問題[4-5]。如松針中的黃酮可顯著提高氧化應激狀態(tài)的肥胖大鼠肝臟中的抗氧化酶活性[6],槲皮素可以提高高溫條件下奶牛乳腺上皮細胞的活性和抗氧化能力[7],白茶中提取的多酚類物質(zhì)能夠使機體紋狀體細胞免受過氧化氫誘導的氧化應激損傷等[8]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),金蕎麥(Fagopyrumdibotrys(D. Don) Hara)根莖中含有大量黃酮類、多酚類和有機酸類等抗氧化活性物質(zhì),同時金蕎麥在夏季高溫頻發(fā)的南方地區(qū)的生物產(chǎn)量較高,充分挖掘其飼用價值和經(jīng)濟價值具有重要意義[9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),在夏季高溫條件下新鮮金蕎麥替代10%的基礎飼糧飼喂蛋雞可維持原有產(chǎn)蛋率,且降低了血清中炎癥因子和內(nèi)毒素水平,但具體作用機理未知[10]。

閉合蛋白(Occluding)和Claudin是緊密連接主要的整合膜蛋白,在維持和調(diào)節(jié)緊密連接屏障功能中有重要作用。同時,腸道黏膜中上皮生長因子(Epidermal growth factor,EGF)是參與腸道上皮細胞的修復重要因子之一[11-12],因此Occluding、Claudin和EGF可作為腸道損傷程度和修復功能的表征指標。

基于此,本試驗擬通過探究鮮飼金蕎麥對夏季高溫條件下蛋雞腸道微生物區(qū)系及Occluding、Claudin和EGF的mRNA表達量的影響,進一步解析其作用機理,為挖掘金蕎麥的飼用價值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與飼糧

試驗選取300只32周齡體重相近、健康的長順綠殼蛋雞,隨機分為5組,每組5個重復,每個重復12只雞。其中,C組飼喂基礎飼糧,T1、T2、T3和T4組分別飼喂添加有5%、10%、15%和20%新鮮金蕎麥的基礎飼糧,5%、10%、15%和20%指的是新鮮金蕎麥占飼喂飼糧的比例。為防止飼料霉變,每天現(xiàn)配現(xiàn)用。基礎飼糧組成和營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成和營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diets(air-dry basis)

1.2 飼養(yǎng)管理

采用三層式階梯式籠養(yǎng),每籠3只雞。每天光照16 h,自由飲水,每天采摘新鮮的初花期金蕎麥,用粉碎機粉碎后,與基礎飼糧充分混合,每天喂食2次(9:00和16:00),現(xiàn)配現(xiàn)用。為避免因試驗期延長導致金蕎麥前后生育期不一致,借助金蕎麥多年生的特點,試驗前期便采用時間交錯種植的方法,保障有足夠數(shù)量的處于初花期的金蕎麥供試驗使用,最大程度保證新鮮金蕎麥的成熟度穩(wěn)定。試驗時間為6月份～8月份,試驗前關閉雞舍濕簾降溫裝置,將試驗雞只暴露在當?shù)刈匀桓邷貤l件下,并在雞舍過道入口處、中間和雞舍尾部分別懸掛1個掛壁式室內(nèi)溫濕度計(天津市美達時儀器儀表有限公司),分別在8:00、14:00和23:00記錄雞舍3個區(qū)域溫度,表2中顯示了6月份、7月份和8月份各時間點的平均溫度和平均相對濕度值。預飼15 d,正試90 d。

表2 試驗期各月每天各時間點的平均溫度和平均相對濕度Table 2 Average temperature and average relative humidity at each time point of each day in each month of the trial period

1.3 樣品采集及指標測定

1.3.1 腸段樣品采集 于90 d試驗結(jié)束后,每組選3只雞,禁食12 h,采用無菌操作分別取十二指腸和回腸腸段的同一部位放入2 ml無RNA酶凍存管中,液氮保存,待測。

1.3.1.1 小腸總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 采用trizol法提取十二指腸和回腸組織總RNA,用核酸蛋白儀測其完整性、濃度和純度。按照試劑盒Takara的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)說明合成cDNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 引物設計 根據(jù)GenBank測序數(shù)據(jù)庫中雞的GADPH(NM_204305.1)、occluding(NM_205128.1)、Claudin-1(AY750897.1)、EGF(NM_001001292.1)基因的mRNA序列,以GADPH作為內(nèi)參基因,利用Primer Premier5.0引物軟件分別設計擴增引物(西安淳風信息科技有限公司),引物序列見表3。

表3 引物序列Table 3 Primer sequences

1.3.1.3 實時熒光定量PCR 以合成的cDNA為模板,按照SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒說明,在實時熒光定量PCR儀上進行,反應條件為:95 ℃預變性3 min,95 ℃變性10 s,55 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,延伸完成采集熒光信號,共40個循環(huán)。采用相對定量分析法,以GADPH為內(nèi)參基因,采用2-△△Ct計算目的基因mRNA相對表達量。

1.3.2 腸道內(nèi)容樣品采集 于90 d試驗結(jié)束后,每組選3只雞,禁食12 h,將回腸和盲腸內(nèi)容物置于滅菌凍存管中,液氮速凍,待測。

1.3.2.2 測序 使用e.Z.N.A.TM Cycle-Pure Kit(omega)柱子將混好的樣品進行膠前純化,用Monarch DNA膠回收試劑盒進行回收,1.8%瓊脂糖電泳檢測,Qsep-400 方法質(zhì)檢合格后上機檢測,根據(jù)illumina novaseq6000平臺進行測序(北京百邁克生物科技有限公司)。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)用Excel進行整理,試驗結(jié)果按單因子完全隨機設計,調(diào)用SPSS 18.0軟件的“一般線性模型(GLM)”程序進行方差分析,主效應為金蕎麥在飼糧中的添加水平。然后用Duncan法進行多重比較,P<0.05表示差異顯著。再調(diào)用“回歸分析”中的線性(Linear)和二次(Quadratic)函數(shù)程序?qū)虮磉_量趨勢進行分析,結(jié)果用平均值表示,各處理變異程度用標準誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋雞腸道目的基因mRNA表達量

由表4可見,試驗因子顯著影響了蛋雞十二指腸和回腸中的Occluding和EGF的表達量(P<0.05),各處理Claudin-1的表達量無顯著差異(P>0.05)。其中,十二指腸中的Occluding和EGF的表達量隨金蕎麥添加量的提高呈顯著的二次上調(diào)趨勢(P<0.05),以T2組表達量較高(P<0.05),而回腸中的表達量成顯著的線性和二次上調(diào)的趨勢(P<0.05)。

表4 蛋雞腸道claudin-1、occluding以及EGF基因mRNA表達量Table 4 Expression of claudin-1, occluding and EGF gene mRNA in intestinal tract of laying hens

2.2 蛋雞腸道微生物α多樣性指數(shù)

α多樣性指數(shù)反映組間物種豐度及物種多樣性的差異。其中Shannon和Simpson指數(shù)反映物種多樣性,Ace和Chao指數(shù)評估物種豐度,Shannon值越大或Simpson值越小,說明群落多樣性越高。由表5可知,飼糧中添加金蕎麥主要對回腸的物種豐度差異顯著(P<0.05),其中T2組的Ace和Chao指數(shù)顯著低于對照組(P<0.05)。

表5 鮮飼金蕎麥對蛋雞腸道微生物α多樣性指數(shù)的影響Table 5 Effect of fresh-fed Fagopyrum dibotrys on gut microbial α diversity index in laying hens

2.3 蛋雞腸道菌群的物種多樣性分析

高通量測序表明,蛋雞回腸和盲腸內(nèi)容物樣品測序共獲得2 288 250 對Reads,平均產(chǎn)生 74 112 條Clean tags,得到2 251和2 884個OTU。為更好展現(xiàn)不同金蕎麥添加組之間的差異,分別對回腸中2 251個OTU和盲腸中2 884個OTU進行維恩圖分析(圖1和圖2),結(jié)果顯示,回腸中不同處理組之間共有200個OTU,不同處理組之間獨有OTU個數(shù)分別為6、65、1、4和14;盲腸中共有499個OTU,獨有OTU個數(shù)分別為11、10、5、8和8。

圖1 回腸微生物多樣性維恩分析圖Fig.1 Venn diagram analysis of Ileum

圖2 盲腸微生物多樣性維恩分析圖Fig.2 Venn diagram analysis of Cecum

由圖3可知,門水平上,回腸微生物中相對豐度前5的細菌門分別為厚壁菌(Firmicutes),各組豐度分別為79.24%、56.26%、75.69%、58.72%、36.02%;藍細菌(Cyanobacteria),各組豐度分別為1.22%、29.74%、18.65%、26.36%、41.13%;放線菌(Actinobacteria),各組豐度分別為84.40%、4.51%、4.06%、9.94%、6.16%;變形桿菌(Proteobacteria),各組豐度分別為6.23%、1.56%、1.17%、3.80%、9.93%;擬桿菌(Bacteroidetes),各組豐度分別為2.38%、7.54%、0.30%、0.64%、0.48%。

圖3 蛋雞回腸微生物在門水平的組成圖Fig.3 Composition of Ileal microorganism in layer at phyla level

由圖4可知,盲腸微生物中相對豐度前5的細菌門分別為厚壁菌(Firmicutes),各組豐度分別為52.54%、48.03%、50.35%、46.38%、37.49%; 擬桿菌(Bacteroidetes),各組豐度分別為38.90%、40.39%、40.55%、45.29%、41.44%;放線菌(Actinobacteria),各組豐度分別為5.98%、7.18%、4.67%、2.96%、4.78%;疣微菌(Verrucomicrobia),各組豐度分別為0.21%、0.25%、0.31%、0.24%、12.7%;變形桿菌(Proteobacteria),各組豐度分別為1.18%、1.94%、2.34%、2.42%、1.90%。

圖4 蛋雞盲腸微生物在門水平的組成Fig.4 Composition of Cecal microorganism in layer at phyla level

由圖5可知,屬水平上,回腸微生物中相對豐度前5的細菌屬分別為乳桿菌(Lactobacillus)、未分類細菌(uncultured_bacterium)、未分類真核生物(uncultured_eukaryote)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)和腸球菌(Enterococcus)。各處理組豐度前5的細菌屬分別為C組:72.36%、0.92%、0.31%、1.06%、0.36%;T1組:49.77%、6.97%、23.87%、34.81%、0.17%;T2組:75.29%、19.51%、0.07%、3.28%、0.03%;T3組:48.93%、28.22%、0.02%、6.10%、3.98%;T4組:30.10%、44.22%、0.02%、3.06%、0.83%。

由圖6可知,盲腸微生物中相對豐度前5的細菌屬分別為擬桿菌(Bacteroides)、理研菌(Rikenellaceae_RC9_gut_group) 、乳桿菌(Lactobacillus)、瘤胃球菌(uncultured_bacterium_f_Ruminococcaceae)、扭鏈胃球菌([Ruminococcus]_torques_group)。各處理組豐度前5的細菌屬分別C組:13.51%、15.98%、12.02%、4.91%、3.15%;T1組:20.95%、11.69%、72.69%、43.48%、43.19%;T2組:17.07%、11.58%、4.50%、3.62%、3.94%;T3組:19.74%、10.99%、1.30%、4.98%、5.93%;T4組:16.66%、13.08%、2.25%、3.93%、4.09%。

圖6 蛋雞盲腸微生物在屬水平的組成Fig.6 Composition of Cecal microorganism in layer at genus level

3 討 論

3.1 鮮飼金蕎麥對腸道目的基因表達的影響

正常的腸道粘膜屏障功能是畜禽健康與否的重要保障,當高溫不斷刺激畜禽時,機體會通過下調(diào)Occluding和Claudin基因的mRNA表達增加腸粘膜的通透性,損害畜禽腸道粘膜結(jié)構(gòu),進而導致腸道代謝功能障礙。同時,機體內(nèi)毒素、病原菌等有害物質(zhì)通過受損的腸道粘膜釋放進入血液,誘發(fā)腸炎、敗血癥及多臟器功能衰竭綜合征[13-14]。

目前,某些中草藥及其提取物作為抗生素替代品是飼料行業(yè)研究熱點之一,沈萍等[15]將由藿香、薄荷、知母、紅景天等7種中草藥組成的方劑添加在高溫條件下的蛋雞飼糧中,發(fā)現(xiàn)蛋雞小腸局部黏膜免疫功能得到改善,腸道上皮淋巴細胞數(shù)量和濃度均提高。何邵平[16]報道指出,中草藥虎杖提取物白藜蘆醇(200～500 mg/kg)能夠有效改善高溫條件下肉雞機體代謝,提高腸道緊密連接,抑制炎癥反應,提高生產(chǎn)性能。Mei等[17]研究發(fā)現(xiàn),中草藥厚樸提取的厚樸酚(20 μmol/L)可緩解熱應激造成的小鼠小腸上皮細胞G1期細胞周期阻滯。本試驗研究發(fā)現(xiàn),在夏季自然高溫條件下蛋雞飼糧中添加10%～15%的新鮮金蕎麥上調(diào)了十二指腸和回腸中的Occluding和EGF的基因表達量,表明金蕎麥具有提高蛋雞腸道緊密連接的作用,且改善了腸道受損的修復機能,這與韓芳芳等[18]報道指出的金蕎麥提取物上調(diào)了豬上皮細胞閉合小環(huán)蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)、Occluding的表達,抑制機體炎癥反應,保護腸道粘膜的結(jié)果類似,可能是由于金蕎麥含有黃酮類、多酚類、有機酸類等多重抗氧化活性成分,能顯著清除O2-和-OH,增加代謝自由基的酶的活性,緩解蛋雞因高溫造成的氧化應激反應,間接影響了腸道緊密連接蛋白和修復因子的表達[19-20],但具體分子信號通路的作用機制尚需進一步研究。

3.2 鮮飼金蕎麥對熱應激蛋雞微生物區(qū)系的影響

研究發(fā)現(xiàn),家禽的腸道屏障有四個,主要包括機械屏障、化學屏障、免疫屏障和微生物屏障,四個屏障之間相互關聯(lián)、共同維護家禽腸道健康[21]。其中腸道微生物不僅參與腸道中大部分的新陳代謝活動,同時可以在腸道粘膜表面形成保護層,阻止致病菌侵入機體,因此,腸道微生物對于維持腸道穩(wěn)態(tài)至關重要[22]。當畜禽暴露在高溫條件下,腸道微生態(tài)平衡遭到破壞,有害微生物開始在腸道上皮細胞黏附、定植,損害家禽腸道屏障[23]。

本試驗利用高通量測序技術(shù)對不同金蕎麥添加劑量中蛋雞回腸和盲腸微生物多樣性進行分析,結(jié)果顯示,回腸中相對豐度前5的優(yōu)勢細菌門分別為:厚壁菌、藍細菌、放線菌、變形桿菌和擬桿菌。這與王雪潔[24]報道的回腸主要細菌門類型的結(jié)果有所差異,主要表現(xiàn)在藍細菌門在家禽腸道中鮮見,而哺乳類或其它脊椎動物腸道中卻常見[25],可能是由于家禽回腸中菌群定植的種類受動物品種、生存環(huán)境影響所致[26]。盲腸中豐度前5的優(yōu)勢細菌門分別為:厚壁菌、擬桿菌、放線菌、疣微菌和變形桿菌?；啬c中豐度前5的優(yōu)勢細菌屬分別為:乳桿菌、未分類細菌、其他細菌、雙歧桿菌和腸球菌;盲腸中分別為:擬桿菌、理研菌、乳桿菌、瘤胃球菌和扭鏈胃球菌。這與前人報道雞腸道主要細菌門與細菌屬類型的結(jié)果基本吻合[27-28]。然而,各處理蛋雞回腸和盲腸微生物結(jié)構(gòu)和組成存在較大差異,主要表現(xiàn)在試驗組蛋雞腸道中厚壁菌門(36.02%～75.69%)和放線菌門(4.06%～9.94%)的豐度顯著低于對照組(79.24%和84.40%),而藍菌門呈相反趨勢;此外,試驗因子降低了盲腸中的厚壁菌門豐度,但提高了擬桿菌門豐度,該結(jié)果提示新鮮金蕎麥作為蛋雞飼糧組成部分對其腸道優(yōu)勢菌群有較大影響,但這種變化對腸道功能或其它機能的正面或負面作用還需進一步驗證。值得注意的是,雙歧桿菌屬和乳桿菌屬作為家禽腸道中的有益菌群[29]也出現(xiàn)了較大差異,蛋雞回腸中的雙歧桿菌屬豐度隨金蕎麥添加水平的提高呈整體上升趨勢,但盲腸中的乳桿菌屬整體呈先上升后降低的趨勢(豐度最高為T2組72.69%),表明金蕎麥有利于蛋雞回腸中雙歧桿菌的增殖,而對盲腸中乳桿菌屬的增殖有劑量效應,即適宜添加量的新鮮金蕎麥有利于蛋雞盲腸中乳桿菌的增殖,超過10%則會對乳桿菌的增殖有負面作用,不利于病原菌抑制和其它營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[30],該效應與本課題前期研究的產(chǎn)蛋率等生產(chǎn)性能結(jié)果相吻合[10]。

本試驗結(jié)果顯示,金蕎麥作為蛋雞飼糧的組成部分具有提高腸道緊密連接蛋白基因表達量的作用,同時改變了回腸中細菌門的多樣性和盲腸中優(yōu)勢細菌屬的豐度,但還不清楚微生物菌群變化與腸道緊密連接蛋白的基因表達的關系,這將成為下一步的研究方向,以進一步揭示金蕎麥對蛋雞抗熱應激的作用機制。

4 結(jié) 論

鮮飼金蕎麥上調(diào)了夏季高溫條件下蛋雞十二指腸和回腸中緊密連接蛋白基因Occluding和修復因子基因EGF的表達量;鮮飼金蕎麥改變了夏季高溫條件下蛋雞回腸和盲腸細菌門的多樣性,促進了雙歧桿菌屬的増殖,添加量不超過10%時對乳桿菌屬的増殖有正向調(diào)控作用。