鄭巧 林華 徐浩 安微 薛昌華 張婧 韓國全

（1.成都海關技術中心，成都 610000；2.四川農(nóng)業(yè)大學食品學院，雅安 625014；3.深圳海關動植物檢驗檢疫技術中心，深圳 518045）

嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 號（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引發(fā)的新冠疫情對全球公共衛(wèi)生構成巨大威脅，截至2023 年5 月6 日，全球共計報告了7.6 億例確診病例，超過600 萬人因此喪失生命。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）基于當前疫情流行趨勢和人群免疫情況下調(diào)新冠疫情全球風險級別，宣告新冠疫情不再構成“國際關注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”，但根據(jù)病毒的發(fā)展趨勢來看，短時間內(nèi)不能徹底消失，仍然存在毒株變異和感染傳播的風險。SARS-CoV-2 是冠狀病毒科的一種單鏈 RNA 包膜病毒，直徑約60-140 nm，基因組全長約30 kb［1-2］。其中，非結構蛋白編碼區(qū)主要包括開放讀碼框架（open reading frame，ORF）1a 和 ORF1b 基因，結構蛋白主要通過核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N）、包膜蛋白（envelope protein，E）、膜蛋白（membrane protein，M）和刺突蛋白（spike protein，S）維持病毒的轉錄和復制，促進病毒遺傳物質侵入宿主細胞干擾正常生命等活動［3］。SARS-CoV-2 可以跨越物種屏障感染人類和動物（果子貍、單峰駱駝、穿山甲、蝙蝠）等，Chan 等［4-5］對 SARS-CoV-2 的鑒定和特征進行分析，研究表明，SARS-CoV-2 在全基因組水平上與蝙蝠冠狀病毒有96%的相同性，被認為是攜帶新冠病毒的天然宿主。SARS-CoV-2 具有靈活的基因重組和快速適應突變能力，已不斷進化演變出新的關注變異株（包括 Alpha、Beta、Gamma、Delta和 Omicron）［6-10］，因此在 SARS-CoV-2 的核酸檢測中，對病原毒株類型的鑒定具有更高要求。

Omicron 變異株成為全球流行優(yōu)勢毒株［11］，據(jù)中國疾病預防控制中心發(fā)布《全國新型冠狀病毒感染疫情情況》顯示，2022 年9 月26 日-2023年4 月13 日全國報送的40 122 例本土病例 SARSCoV-2 基因組有效序列均為 Omicron 變異株。該變異株攜帶大量突變，僅在 S 蛋白末端的受體結合域（receptor binding domain，RBD）上就存在15 個突變位點，RBD 與人體細胞表面的血管緊張素轉換酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）受體發(fā)生特異性相互作用，病毒能夠逃避免疫保護屏障，使Omicron 變異株更具傳播性和感染能力［12-13］，Omicron 變異株感染人數(shù)多但較早期致病力明顯下降，感染癥狀已逐漸演化為一種常見的呼吸道傳染病。目前，市面上 SARS-CoV-2 核酸檢測試劑引物和探針靶標大多針對于 ORF1ab 基因、N 基因、E 基因設計，不能滿足 Omicron 變異株檢測需求。根據(jù)SARS-CoV-2 各變異株之間 S 基因的序列差異，開發(fā)可以快速高效鑒定 Omicron 突變株的檢測方法，在全球范圍內(nèi)對這一新變異株的監(jiān)測至關重要。

微滴式數(shù)字 PCR 技術在熒光定量 PCR 技術（quantitative real-time PCR，qPCR）的基礎上將核酸的定量檢測由相對定量提高到絕對定量［14］，是分子生物學檢測領域最為重大創(chuàng)新之一。在 ddPCR中，通過微滴化處理將待檢模板和反應混合物稀釋分散成2 萬多個油包水的細小微滴，每個微滴只含有1 個或0 個待檢核酸分子，微反應體系擴增完成后，系統(tǒng)采集并分析單個微滴的熒光信號，結合泊松分布定律計算稀釋至單分子水平的核酸分子量［15］，無需繪制標準曲線就可推算出目標分子的原始拷貝數(shù)，實現(xiàn)復雜背景下對微量核酸樣本的絕對定量檢測［16］。楊朔鵬［17］建立的三重 ddPCR 方法用于檢測生物與環(huán)境樣本中 SARS-CoV-2，與RT-qPCR相比，該方法用于檢測低病毒載量的樣本有更高的靈敏度和準確性，有效降低了假陰性檢出率。Zhou等［18］開發(fā)的一種 RT-ddPCR 檢測方法，用于同時檢測 SARS-CoV-2 和豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS-CoV），測試結果顯示靈敏度分別比 RT-PCR 高4 倍和10 倍，該測試還表現(xiàn)出良好的特異性、可重復性和再現(xiàn)性等優(yōu)點。

本研究通過對新冠病毒原型株及其他變異株的基因序列比對分析，設計專門針對于 Omicron 變異株 S 基因的特異性引物探針，采用定量分析檢測方法——ddPCR 技術，建立SARS-CoV-2 Omicron 變異株四重微滴式數(shù)字 PCR 檢測方法，實現(xiàn)多靶標定量檢測 SARS-CoV-2 ORF1ab 基因、N 基因、E 基因的同時，還能對 Omicron 變異株進行鑒別的雙重功能，以期為微量 RNA 病毒檢測以及病毒傳播風險監(jiān)測提供重要技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 RNA 核酸提取純化試劑盒（磁珠法）（Vazyme，中國）；蛋白酶 K（Vazyme，中國）；2× dPCR Probe Master Mix Pius（Sniper，中國）；5×One Step RT-PCR Probe Super Mix（Sniper，中國）；Enzyme Mix（Sniper，中國）；新型冠狀病毒 2019-nCoV 核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）（上海之江，中國）；EcoR I 酶（New England Biolabs，美國）；TB Green?Premix Ex TaqTMII（TaKaRa Dalian，日本）。

1.1.2 儀器與設備 DQ24 數(shù)字 PCR 一體機（Sniper，中國）；實時熒光定量 PCR 儀（Thermo Fisher Scientific，美國）；諾唯贊全自動核酸提取儀（Vazyme，中國）；NanoDrop ONEC 超微量核酸蛋白儀（Thermo Scientific，美國）；移液器（Eppendor，德國）；漩渦振蕩混勻儀（Thermo Fisher Scientific，美國）；高速冷凍離心機 XR3（Thermo Fisher Scientific，美國）；生物安全柜（Thermo Scientific，美國）；超低溫冰箱（海爾，中國）；高壓滅菌鍋（致微，中國）；全自動凝膠圖像分析系統(tǒng)（Ultra-Violet Products，美國）。

1.1.3 樣本來源 臨床鼻咽拭子核酸樣本由口岸疫病疫情監(jiān)測四川省重點實驗室提供，新型冠狀病毒變異株標準物質（Beta 株 GBW09318、Gamma 株GBW09317、Delta 株 GBW09316、Omicron 株 NIMRM5235）購買于中國計量科學研究院，豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、甲型流感病毒、諾如病毒、輪狀病毒、腺病毒陽性質?；蛞呙缬沙啥己ｊP技術中心動檢實驗室提供。

1.1.4 引物設計 在 NCBI 和 GISAID 數(shù)據(jù)庫（https://www.gisaid.org/）中下載新型冠狀病毒原型株及變異株基因組參考序列，通過 DNAMAN 軟件進行基因序列比對，篩選高度保守的目的片段，利用 primer 6.0和 oligo 7 軟件對選取的病毒片段進行引物探針設計，引物探針放入 NCBI 中 Primer-Blast 驗證特異性，選擇最佳引物探針交予生工生物工程（上海）有限公司合成，序列詳細信息見表1。

表1 引物與探針序列Table 1 Primer and probe sequences

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA 提取 非滅活型臨床鼻咽拭子樣品先置于56℃水浴鍋內(nèi)滅活30 min，含胍鹽類滅活型樣品可直接進行核酸提取，在生物安全柜內(nèi)將樣品管渦旋振蕩20 s，靜置≥30 s 后，吸取200 μL 樣品于裂解板中進行病毒裂解分離，提取詳細步驟按照核酸提取純化試劑盒說明書進行，最終，將100 μL TE 緩沖液洗脫的核酸產(chǎn)物置于-20℃保存。

1.2.2 陽性質粒制備與稀釋 委托生工生物工程（上海）有限公司合成1.1.4 所述的4 對引物目的片段序列，目的基因擴增后將片段回收純化，插入 PUC57載體與目的片段連接構建重組質粒標準品，隨后PCR 擴增并驗證測序結果。將制備成功的陽性質粒標準品用超微量核酸蛋白儀測定質粒濃度，根據(jù)公式質?？截悢?shù)=（M×6.02×1023×10-9）/（n×660），其中M 為質粒DNA 濃度，n 為重組質粒長度=T 載體長度+目的片段長度，計算得到陽性質?？截悢?shù)，并將陽性質粒10 倍稀釋為101-1011，稀釋后的陽性質粒標準品置于-80℃冰箱凍存。

1.2.3 單重ddPCR 的擴增 為驗證 SARS-CoV-2 ORF1ab 基因、N 基因、E 基因以及 Omicron 變異株 S基因的引物探針是否能對目的基因進行有效擴增，分別以 ORF1ab 基因、N 基因、E 基因以及 S 基因陽性質粒標準品為檢測模板進行單重 ddPCR 擴增，RNase Free ddH2O 為陰性對照，按照試劑盒說明書配置反應體系和設定擴增程序。反應體系為: 5×One Step RT-PCR Probe Super Mix（cy5.5）3.5 μL，Enzyme Mix 1 μL，EcoR I 酶1 μL，引物探針濃度均為10 μmol/L 的上下游引物各1 μL，探針0.5 μL，模板 3 μL，ddH2O 補足22 μL。反應程序為: 25℃ 5 min；50℃ 25 min；95℃酶激活5 min；95℃ 15 s，58℃ 30 s，共計40 個循環(huán)。

1.2.4 多重ddPCR 的建立與優(yōu)化 在單重 ddPCR 的基礎上建立多重 ddPCR 方法，對4 種目標基因引物探針的配比濃度和使用量進行選擇，引物探針濃度均為20 μmol/L 的上下游引物選取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 μL，探針選取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 μL，選用稀釋為同一濃度的陽性質粒標準品分別作為多重 ddPCR 反應擴增模板，同時設置陰性對照和無模板對照，每次實驗控制單一變量，每組實驗重復2 次，結合陰陽性微滴間熒光差值和檢測拷貝數(shù)篩選最佳引物探針組合，確保擴增后的一維散點圖陰陽性能明顯區(qū)分且中間彌散微滴數(shù)較少，最終確定多重 ddPCR 反應體系。

1.2.5 多重ddPCR 特異性 為確定 SARS-CoV-2 ORF1ab 基因、N 基因、E 基因以及 Omicron 變異株S 基因引物探針特異性是否良好，將豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、甲型流感病毒、諾如病毒、腺病毒、輪狀病毒、新型冠狀病毒變異株（Beta株、Gamma 株、Delta 株）作為擴增模板，同一濃度的新冠質粒標準品作為陽性對照，RNase Free ddH2O為陰性對照，采用1.2.4 節(jié)中確定好的反應體系和擴增程序，對建立的四重 ddPCR 方法進行特異性實驗驗證。

1.2.6 多重ddPCR 靈敏度及穩(wěn)定性 將制備的4 種陽性質粒標準品混合后，進行連續(xù)10 倍梯度稀釋，以10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11不同梯度稀釋樣本進行多重 ddPCR 擴增，直至檢測到陽性微滴數(shù)的最低拷貝數(shù)即為該方法的檢測下限，并對每個濃度重復3 次實驗以確定該方法的穩(wěn)定性。

1.2.7 臨床鼻咽拭子樣本的檢測 口岸疫病疫情監(jiān)測四川省重點實驗室提供鼻咽拭子樣本 20 份，按照核酸提取純化試劑盒（磁珠法）提取病毒RNA，隨后用本研究建立的多重 ddPCR 方法和新型冠狀病毒2019-nCoV 核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）對臨床鼻咽拭子樣本的進行檢測，分別得到數(shù)字 PCR 定量拷貝數(shù)結果和熒光定量 PCR 結果，比較分析陽性檢出率。

2 結果

2.1 目的基因擴增與鑒定結果

以陽性質粒為擴增模板，4 對引物進行 PCR 擴增，用2%瓊脂糖凝膠對 PCR 產(chǎn)物進行電泳檢測，凝膠圖像分析系統(tǒng)顯示見圖1。結果表明，擴增條帶清晰明亮，無拖帶彌散等情況，所得擴增產(chǎn)物與目的片段大小相符。測序結果在 NCBI 上比對，與SARS-CoV-2 同源性達到98%以上，證實設計引物對目的片段有效擴增。

圖1 SARS-CoV-2 ORF1ab 基因、N 基因、E 基因、S 基因擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis map of SARS-CoV-2 ORF1ab,N,E,and S gene amplification products

2.2 單重ddPCR擴增結果

在單重 ddPCR 擴增中，SARS-CoV-2 ORF1ab 基因、N 基因、E 基因以及 Omicron 變異株 S 基因顯現(xiàn)良好的擴增效果，各目的基因陰陽性微滴區(qū)分明顯，陰性對照未出現(xiàn)陽性微滴信號，在58℃退火溫度下，4 對引物均能與模板有效結合，適合構建多重 ddPCR 檢測體系，擴增信息見圖2。

圖2 SARS-CoV-2 ORF1ab 基因、N 基因、E 基因、S 基因單重ddPCR 檢測一維圖Fig.2 One-dimensional map of SARS-CoV-2 ORF1ab gene,N gene,E gene and S gene by single ddPCR

2.3 多重ddPCR的建立與優(yōu)化

通過優(yōu)化反應體系和擴增程序，4 組引物探針之間干擾程度較低，擴增的陰陽性微滴能有效分開且中間彌散微滴數(shù)較少，可構建四重 ddPCR 方法對新冠病毒進行定量分析。最終確定的多重 ddPCR反應體系為：5×One Step RT-PCR Probe Super Mix（cy5.5）3.5 μL，Enzyme Mix 1 μL，EcoR I 酶 1 μL，20 μmol/L 的ORF1ab 基因上下游引物各0.4 μL，探針0.6 μL，N 基因上下游引物各0.5 μL，探針0.6 μL，E 基因上下游引物各0.5 μL，探針0.7 μL，S 基因上下游引物各0.6 μL，探針0.5 μL，ddH2O 補足22 μL。反應程序為: 25℃ 5 min；50℃ 25 min；95℃酶激活5 min；95℃ 15 s，58℃ 30 s，共計40 個循環(huán)。已成功建立的 SARS-CoV-2 ORF1ab 基因、N 基因、E 基因以及 Omicron 變異株 S 基因四重微滴式定量ddPCR 檢測方法可用于后續(xù)臨床樣品的檢測。

2.4 多重ddPCR特異性驗證

通過多重 ddPCR 反應擴增，4 種目標基因的質粒標準品均有效檢出陽性微滴數(shù)。同時，選擇豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、甲型流感病毒、諾如病毒、腺病毒、輪狀病毒、新型冠狀病毒變異株（Beta 株、Gamma 株、Delta 株）作為特異性實驗驗證均未發(fā)生非特異性擴增，表明4 組引物探針特異性良好，未與其他感染癥狀與新冠病毒類似的病原體發(fā)生交叉反應，四重 ddPCR 特異性擴增圖見圖3。

圖3 四重ddPCR 特異性檢測一維圖Fig.3 One-dimensional map of specificity detected by quadruple ddPCR

2.5 多重ddPCR靈敏度與穩(wěn)定性

將4 種陽性質粒標準品混合后，進行連續(xù)10 倍梯度稀釋，選取6 個梯度樣本并重復3 次實驗，以確定反應體系的靈敏度和穩(wěn)定性。四重 ddPCR 靈敏度與重復性檢測結果如表2。由表2 可知，四重微滴式數(shù)字 PCR 檢測SARS-CoV-2 的絕對定量檢測下限分別為ORF1ab 基因0.59 copies/μL，RSD 為20.89%；N 基因0.68 copies/μL，RSD 為25.07%；E基 因1.44 copies/μL，RSD 為12.08%；S 基 因1.03 copies/μL，RSD 為20.20%。四重微滴數(shù)字 PCR 靈敏度檢測一維圖見圖4。

圖4 四重 ddPCR 靈敏度檢測一維圖Fig.4 One-dimensional map of sensitivity detected by quadruple ddPCR

以體系中10-6-10-105 個連續(xù)稀釋的陽性質粒DNA 模板稀釋倍數(shù)為橫坐標，與之對應 ddPCR 檢測拷貝數(shù)結果的對數(shù)值為縱坐標繪制線性關系擬合曲線。如圖5 所示，SARS-CoV-2 ORF1ab 基因 R2為0.999，N 基因 R2為0.999，S 基因 R2為0.988，ORF1ab 基因 R2為0.997，結果呈現(xiàn)良好的線性關系，本實驗建立的多重 ddPCR 方法適用于對微量新冠病毒的拷貝數(shù)準確定量檢測。

2.6 臨床鼻咽拭子樣本的檢測結果

使用核酸提取純化試劑盒（磁珠法）提取20 份樣本的病毒核酸（每份樣本200 μL），四重微滴式數(shù)字 PCR 方法檢測結果見表3，新型冠狀病毒 2019-nCoV 核酸檢測試劑盒（熒光定量 PCR 法）檢測結果見表4，試劑盒結果判定標準只需滿足在同一份標本中 SARS-CoV-2 的 ORF1ab 基因為陽性，N 基因及E 基因任一靶標為陽性即為該樣本 SARS-CoV-2陽性。檢測結果顯示，在20 份臨床樣本中，ddPCR方法檢出陽性樣本16 個，陽性率達80%（16/20），經(jīng)熒光定量 PCR 方法進行復檢驗證結果一致，表明該多重 ddPCR 方法能夠在臨床中應用。

表3 20 份樣本多重微滴數(shù)字 PCR 拷貝數(shù)檢測結果Table 3 Copy number detection results for 20 samples by quadruple ddPCR

表4 20 份樣本熒光定量 PCR 檢測結果Table 4 Results of 20 samples via fluorescence quantitative PCR

3 討論

自2021 年11 月9 日 Omicron 變異株于南非首次檢出后［19］，短時間內(nèi)成為主要優(yōu)勢毒株并在全世界范圍內(nèi)高度傳播。Omicron 變異株 S 基因存在大量突變位點，這些突變位點增加了受體結合域和 ACE2的結合親和力，從而增強了病毒適應性和感染性［20］。此外，某些突變和重組對病毒生物學特性造成影響，有研究表明，Omicron 攜帶的突變位點有助于逃避多種單克隆抗體的中和作用，對自然和疫苗誘導的免疫效果產(chǎn)生影響，免疫保護作用下降導致突破性感染和再次感染［21］，在當前 SARS-CoV-2 還未完全消失的情況下，需密切重點監(jiān)測和防范 Omicron 變異株。

國內(nèi)外開展了大量關于 SARS-CoV-2 檢測方法的研究，其中實時熒光定量 PCR 被認為是診斷新冠病毒感染的“金標準”。Chu 等［22］針對 SARS-CoV-2 ORF1ab 基因和 N 基因建立了一種一步法逆轉錄PCR 對感染患者呼吸道樣本進行檢測。Corman 等［23］建立了 SARS-CoV-2 三重 qPCR 檢測方法，其中 E基因顯現(xiàn)較高靈敏度測試結果（5.2 copies/reaction），但該方法在臨床樣本中的陽性檢出率僅為28.2%。此外，膠體金免疫層析基于抗原抗體特異性結合和顯色原理使檢測結果可視化，15 min 內(nèi)可通過診斷試紙條顯色判斷陰陽性，但已有研究表明該方法敏感性低于 qPCR 檢測結果［24］。SARS-CoV-2 存在潛伏期，患者感染初期常因病毒載量過低出現(xiàn)“假陰性”問題，而本研究建立的多重 ddPCR 方法特異性強、靈敏度高，無需依賴標準曲線便可實現(xiàn)對患者樣本病毒拷貝數(shù)的精確定量，反應體系在精密注射泵的作用下勻速從微型注射器流出，單個液滴體積穩(wěn)定控制在0.8 nL，不受反應液成分、溫度、氣壓等因素影響，通過多通道熒光成像檢測分析，一次性完成液滴掃描拍照，無信號降解，更具高效、便捷、穩(wěn)定等特點，第一時間準確診斷，對患者得到及時救治至關重要。

ddPCR 作為新興的檢測技術，仍存在一些固有局限與不足。待測反應體系配置好之后需開蓋放入ddPCR 儀器中，微液滴在開放式空間內(nèi)吸取和轉移，非專業(yè)實驗人員操作不當可能會導致樣本揮發(fā)和溢出，造成氣溶膠污染，為保證數(shù)據(jù)準確度，實驗檢測環(huán)境應確保較好的負壓條件，儀器運行結束后及時處理廢棄耗材，保持區(qū)域清潔減少污染。ddPCR檢測結果區(qū)間有效動態(tài)范圍小，表現(xiàn)出低于 qPCR的飽和極限，過低的上樣量將降低 ddPCR 的靈敏度，過高的上樣量將導致單液滴內(nèi)樣本拷貝數(shù)過多，超過檢測上限。Cremonesi 等［25］研究指出 DNA 樣本必須在反應混合物中稀釋到 ＜20 000 拷貝值，才可量化參考樣本中密集分布的陽性微滴。因此，可先使用標準樣品在 qPCR 系統(tǒng)中摸索出合適模板 DNA 濃度，確保 ddPCR 定量結果的準確性。對于本實驗建立的多重 ddPCR 方法還可從 SARS-CoV-2 Omicron 變異株新的進化分支細化研究，及時監(jiān)測并精確定量Omicron 亞變體，以應對未來 SARS-CoV-2 未知變種。

4 結論

本研究根據(jù)新冠病毒原型株及變異株基因組參考序列，設計特異性引物探針，通過優(yōu)化多重ddPCR 反應體系和擴增條件，最終建立了SARSCoV-2 ORF1ab 基因、N 基因、E 基因以及 Omicron變異株 S 基因四重微滴數(shù)式數(shù)字 PCR 定量檢測方法，其中 ORF1ab 基因的絕對定量檢測下限為0.59 copies/μL，N 基因的絕對定量檢測下限為0.68 copies/μL，E 基因的絕對定量檢測下限為1.44 copies/μL，S 基因的絕對定量檢測下限為1.03 copies/μL。該檢測方法特異性強、靈敏度高，用于臨床樣本中能夠對微量新冠病毒準確快速檢出，有利于維護公共衛(wèi)生安全。

致謝

特別感謝四川國際旅行衛(wèi)生保健中心（口岸疫病疫情監(jiān)測四川省重點實驗室）對本實驗的支持和幫助。