徐 樂(lè),劉 興,吳 琦,華召來(lái),楊 菲,張軍峰

徐樂(lè),張軍峰,南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院 江蘇省南京市 210023

劉興,楊菲,南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 江蘇省南京市 210023

吳琦,中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 北京市 100101

華召來(lái),揚(yáng)中市人民醫(yī)院腫瘤防治研究所 江蘇省鎮(zhèn)江市 212299

0 引言

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)的發(fā)現(xiàn)結(jié)束了胃內(nèi)無(wú)菌論,非培養(yǎng)依賴的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)胃內(nèi)存在大量非H.pylori細(xì)菌,如擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)等[1].研究證實(shí),包括H.pylori在內(nèi)的螺桿菌屬是胃內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌屬(相對(duì)豐度可大于50%),不僅參與胃黏膜病變的發(fā)生發(fā)展,而且深刻影響胃菌群的結(jié)構(gòu)與共生關(guān)系[2].最新研究發(fā)現(xiàn),慢性萎縮性胃炎患者感染攜毒力因子H.pylori的比例顯著高于非萎縮性胃炎,且胃內(nèi)菌群多樣性降低[3],在H.pylori陰性患者胃內(nèi)也能檢測(cè)到螺桿菌屬細(xì)菌[4],提示非H.pylori螺桿菌屬細(xì)菌(non-Helicobacter pylori Helicobacters,NHPH)可能是胃黏膜病變的新病原體,其詳細(xì)機(jī)制尚不清楚.

最先發(fā)現(xiàn)的NHPH是從雪貂胃內(nèi)分離出的H.mustelae,后又從貓、狗胃內(nèi)分離得到H.felis,從赤狐胃內(nèi)分離得H.labacensis、H.mehlei、H.vulpis[5].除定植于胃部,在某些動(dòng)物的肝臟、腸道和膽囊也能發(fā)現(xiàn)螺桿菌屬的存在,如H.hepaticus和H.marmot.目前已鑒定出的NHPH有47種,根據(jù)寄居部位分為胃內(nèi)螺桿菌(GastricHelicobacter,GH)和肝腸螺桿菌(enterohepaticHelicobacterspecies,EHS),多呈隱性感染,參與消化系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展[6].作為螺桿菌屬的代表性菌株,H.pylori感染全球約50%的成年人群,可導(dǎo)致慢性胃炎、萎縮性胃炎、腸化生甚至胃癌[7],H.pylori感染者罹患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)可增加約2-8倍[8].動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示,多種NHPH與消化系統(tǒng)疾病相關(guān),H.hepaticus灌胃BALB/c小鼠可誘導(dǎo)肝臟纖維化和癌前病變[9],H.bilis可誘導(dǎo)小鼠炎癥性腸病[10],H.suis與豬胃炎和胃潰瘍有關(guān)[11].這些結(jié)果提示,NHPH感染參與胃、腸、肝等消化器官病變.

H.pylori感染致病過(guò)程大致分為四個(gè)階段: (1)對(duì)胃黏膜酸性環(huán)境的適應(yīng);(2)利用鞭毛向上皮細(xì)胞移動(dòng);(3)上皮細(xì)胞屏障的穿透與特定受體的附著;(4)毒素的釋放及細(xì)胞毒性作用[12].尿素酶是輔助H.pylori定植的關(guān)鍵因子,由尿素酶基因簇編碼.在生理pH水平下,尿素酶陰性的H.pylori突變株喪失胃黏膜定植能力,而尿素酶陽(yáng)性的H.pylori可水解尿素,釋放氨升高胃內(nèi)pH值[13].H.pylori鞭毛作為動(dòng)力提供器官,能保護(hù)細(xì)菌免受胃部酸性環(huán)境的侵襲,使致病菌能夠遷移到黏膜上皮,鞭毛基因(flaA和flaB)突變則會(huì)降低H.pylori的運(yùn)動(dòng)和定植能力[12].組成細(xì)菌鞭毛的幾種鞭毛蛋白,如HpA、FlaA或FlaB,可能在感染后引起體液免疫并刺激特異性抗體反應(yīng)[14].而在成功定植后,H.pylori會(huì)釋放毒素和侵襲因子,主要包括血型抗原結(jié)合黏附素(blood group antigen-binding adhesion,BabA)、唾液酸結(jié)合黏附素(sialic acid-binding adhesin,SabA)、黏附相關(guān)脂蛋白(adherence-associated lipoprotein,AlpA/B)、CagA、空泡細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白(vacuolating cytotoxin,VacA)等,其中CagA和VacA能夠利用IV型分泌系統(tǒng)進(jìn)入上皮細(xì)胞[12],參與誘導(dǎo)胃黏膜上皮損傷和持續(xù)性炎癥,促進(jìn)胃癌發(fā)生[15].因此,H.pylori致病機(jī)制為揭示NHPH致病性提供了參考依據(jù).

螺桿菌屬與人類共存數(shù)萬(wàn)年或更久,為適應(yīng)不同的環(huán)境,基因組呈現(xiàn)高度異質(zhì)性和多樣性,在不同人群和地域間存在顯著差異.為了探索螺桿菌屬細(xì)菌的感染與進(jìn)化機(jī)制,本研究調(diào)取了50株細(xì)菌的基因組,基于16S rRNA基因、鞭毛基因、尿素酶基因、脂多糖合成相關(guān)基因,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,為更好理解螺桿菌屬致病潛能提供依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 螺桿菌屬菌株篩選: Genus(https://lpsn.dsmz.de/genus)網(wǎng)站查找螺桿菌屬成員,根據(jù)目前已發(fā)表的文獻(xiàn),確定各螺桿菌的標(biāo)準(zhǔn)株、宿主、寄居部位和致病性,每種NHPH優(yōu)先選擇標(biāo)準(zhǔn)菌株作為研究對(duì)象,如果無(wú)標(biāo)準(zhǔn)株,則隨機(jī)選擇1個(gè)基因組完整的非標(biāo)準(zhǔn)株.H.pylori菌株數(shù)量很多,本研究以毒力因子CagA/VacA基因攜帶狀態(tài)為標(biāo)準(zhǔn),選擇CagA+/VacA+、CagA+/VacA-、CagA-/VacA+、CagA-/VacA-的H.pylori各3株,作為H.pylori代表菌株.

1.1.2 螺桿菌屬菌株基因序列提取: 美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)Assembly(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)下載螺桿菌屬菌株基因組數(shù)據(jù),包括核酸序列信息文件(fasta nucleic acid file,fna)、基因?qū)?yīng)蛋白質(zhì)序列信息文件(fasta Amino Acid file,faa)和基因組注釋文件(general feature format,gff).在Gene數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索螺桿菌完整16S rRNA序列,以完整序列作為參照序列,在TBtools(version 1.098745)軟件或NCBI的 Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)工具中進(jìn)行相似性檢索,調(diào)取其他菌株16S rRNA基因序列信息,根據(jù)位點(diǎn)信息和匹配度,選擇匹配度較高的序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析.基于H.pylori致病機(jī)制,選擇尿素酶、鞭毛、黏附素和毒力因子等常見致病物質(zhì)基因進(jìn)行分析,觀察這些基因在螺桿菌屬細(xì)菌基因組中的分布,在核酸序列信息fna文件中調(diào)取相應(yīng)基因序列,以調(diào)取到的完整序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析.

1.2 方法

1.2.1 基因序列比對(duì): 將調(diào)取到的16S rRNA和致病物質(zhì)基因序列導(dǎo)入MAGA軟件(https://www.megasoftware.net/)進(jìn)行序列比對(duì),核對(duì)修正,去掉首尾兩端不規(guī)則冗余序列,篩選標(biāo)準(zhǔn): (1)菌株名稱一致;(2)序列連續(xù)性較好,缺口(gap)≤5;(3)序列長(zhǎng)度大于原始序列1/3.選擇符合標(biāo)準(zhǔn)的基因序列,進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析.

1.2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析: 序列比對(duì)完成后采用鄰接法(neighbor-joining method,NJ)或最大似然法(maximum likelihood method,ML)在MAGA軟件中進(jìn)行構(gòu)樹,進(jìn)化樹采用重復(fù)抽樣分析(Bootstrap Analysis)1000次的方法檢驗(yàn)各分支的置信度,利用Figtree(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)軟件對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整.

2 結(jié)果

2.1 螺桿菌屬細(xì)菌基因組信息 首先,在NCBI Assembly數(shù)據(jù)庫(kù)查詢“Helicobacter pylori”,共得3385株H.pylori基因組信息,根據(jù)毒力因子CagA/VacA基因的4種攜帶狀態(tài),每種狀態(tài)選擇3個(gè)菌株,其中,CagA+/VacA+攜帶狀態(tài)H.pylori菌株為FDAARGOS_298、ATCC 43504和NCTC 11637,CagA+/VacA-攜帶狀態(tài)H.pylori菌株為83、J99和MT5135,CagA-/VacA+攜帶狀態(tài)H.pylori菌株為B659-C2、280-A-EK1和HUP-B14,CagA-/VacA-攜帶狀態(tài)H.pylori菌株為HP14039、LIM-008和HPY.其次,查閱文獻(xiàn)獲得38株正式命名的NHPH,其中4株(H.nemestrinae、H.westmeadii、H.suncus、H.apri)缺失基因組信息.最后,本研究納入50個(gè)螺桿菌屬菌株作為研究對(duì)象,表1展示了菌株名稱、宿主、致病性、基因組編號(hào)等信息.

表1 螺桿菌屬菌株基本信息

2.2 螺桿菌屬細(xì)菌16S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化分析 NCBI Gene數(shù)據(jù)庫(kù)中,H.pylori和6株NHPH(H.felis、H.cinaedi、H.pullorum、H.bilis、H.bizzozeronii、H.suis)具有完整的16S rRNA序列,作為參照序列進(jìn)行序列調(diào)取.H.nemestrinae、H.westmeadii、H.suncus、H.apri缺失基因組信息,H.fennelliae和H.salomonis的16S rRNA基因序列長(zhǎng)度少于參照序列的1/3,均不納入分析,最后共獲得44株螺桿菌屬菌株的16S rRNA基因序列信息,利用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1).結(jié)果顯示,進(jìn)化樹分為兩個(gè)大支,第Ⅰ支24株螺桿菌的寄生部位均為胃,宿主集中在貓、鼠、狗、人等哺乳動(dòng)物;除H.mustelae寄生在胃內(nèi),第Ⅱ支19株螺桿菌的寄生部位為肝、腸和膽囊,宿主不僅包括哺乳動(dòng)物,也包括雞、鵝、鳥等禽類.在第Ⅰ支的24個(gè)菌株中,12個(gè)H.pylori菌株緊密聚集形成單系分支,與2個(gè)NHPH菌株(H.acinonychis、H.cetorum)聚成一簇,屬間親緣關(guān)系較近;其他10株胃內(nèi)NHPH構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立的大支系.第Ⅱ支的20個(gè)菌株未發(fā)現(xiàn)顯著的聚群.結(jié)果提示,寄生部位(胃和肝腸)是螺桿菌屬菌株系統(tǒng)進(jìn)化中最重要的影響因素.

圖1 螺桿菌屬基于16S rRNA序列利用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹. 紅色區(qū)域: 胃內(nèi)螺桿菌;藍(lán)色區(qū)域: 肝腸螺桿菌.

2.3 螺桿菌屬細(xì)菌致病物質(zhì)基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.3.1 螺桿菌屬細(xì)菌致病物質(zhì)基因分布情況: 以H.pylori為例,致病物質(zhì)主要包括侵襲因子和毒素,本研究檢索了35個(gè)致病基因在螺桿菌屬菌株中的分布狀態(tài)(表2).其中,尿素酶基因存在于12株H.pylori和20株NHPH,鞭毛基因存在全部的44個(gè)菌株,脂多糖合成相關(guān)基因分布于12株H.pylori和30株NHPH;然而,AlpA/B、BabA、SabA、OipA、HopE等黏附因子以及毒力因子CagA僅存在于H.pylori,VacA還存在于H.bizzozeronii,黏膜接觸誘導(dǎo)因子(induced by contact with epithelium,iceA)存在于H.pylori菌株和H.bilis.結(jié)果提示,NHPH具有一定的致病性,但大多數(shù)缺少完整的毒力因子基因,致病性較弱.

表2 螺桿菌屬致病物質(zhì)基因在螺桿菌屬細(xì)菌基因組中的分布

2.3.2 螺桿菌屬細(xì)菌鞭毛基因系統(tǒng)進(jìn)化分析: 細(xì)菌鞭毛作為動(dòng)力器官,可分為絲狀體、鉤狀體和基體三部分.其中,絲狀體由flaA和flaB基因編碼的鞭毛結(jié)構(gòu)蛋白多聚體FlaA、FlaB組成[13];FlgE是鞭毛鉤狀體的主要蛋白,FlgE突變則菌株失去動(dòng)力[50];基體又稱為細(xì)菌鞭毛馬達(dá),為鞭毛提供動(dòng)力,由外膜環(huán)(L ring)、周質(zhì)環(huán)(P ring)、內(nèi)膜環(huán)(MS ring)、胞質(zhì)環(huán)(C ring)、聯(lián)動(dòng)桿(rod)及分泌裝置(export apparatus)組成[51].選擇完整的基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,NJ法或ML法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2).

圖2 螺桿菌屬細(xì)菌鞭毛相關(guān)基因系統(tǒng)進(jìn)化分析. 紅色區(qū)域: 胃內(nèi)螺桿菌;藍(lán)色區(qū)域: 肝腸螺桿菌.

首先,鞭毛絲狀體基因分析顯示,基于28個(gè)菌株的flaA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分為2個(gè)大支,第Ⅰ支主要由12株H.pylori和8株胃內(nèi)NHPH(H.acinonychis、H.cetorum、H.labacensis、H.vulpis、H.baculiformis、H.cynogastricus、H.felis、H.ailurogastricus)構(gòu)成,而肝腸螺桿菌H.cholecystus位于此支基部;第Ⅱ支包含的7個(gè)菌株(H.hepaticus、H.typhlonius、H.cinaedi、H.jaachi、H.marmotae、H.equorum、H.winghamensis)寄生部位均為肝腸,未發(fā)現(xiàn)顯著聚群.類似的,基于33個(gè)菌株的flaB基因系統(tǒng)進(jìn)化樹也包括2個(gè)大支,第Ⅰ支包括12株H.pylori和10株胃內(nèi)NHPH(H.acinonychis、H.cetorum、H.bizzozeronii、H.mehlei、H.ailurogastricus、H.cynogastricus、H.felis、H.labacensis、H.baculiformis、H.vulpis);第Ⅱ支主要由12株肝腸螺桿菌(H.jaachi、H.cinaedi、H.typhlonius、H.hepaticus、H.marmotae、H.canis、H.winghamensis、H.anseris、H.brantae、H.pametensis、H.bilis、H.trogontum)和胃內(nèi)螺桿菌H.mustelae組成,提示H.mustelae可能在胃和肝腸均可寄生.

其次,鞭毛鉤狀體基因分析顯示,基于38個(gè)菌株的flgE基因系統(tǒng)樹分為2個(gè)大支,5株肝腸螺桿菌(H.winghamensis、H.canadensis、H.pullorum、H.rodentium、H.ganmani)聚為1支,12株H.pylori、12株胃內(nèi)NHPH(H.acinonychis、H.cetorum、H.heilmannii、H.ailurogastricus、H.suis、H.bizzozeronii、H.mehlei、H.cynogastricus、H.felis、H.baculiformis、H.labacensis、H.vulpis)和其他9株肝腸螺桿菌(H.bilis、H.trogontum、H.muridarum、H.equorum、H.marmotae、H.jaachi、H.cinaedi、H.hepaticus、H.typhlonius)聚為另一大支,提示鞭毛鉤狀體基因的系統(tǒng)進(jìn)化與寄生部位關(guān)系不確定.

最后,鞭毛馬達(dá)的組裝受到精確的控制,先合成裝配MS環(huán)和C環(huán),其次合成裝配分泌裝置,再合成裝置聯(lián)動(dòng)桿,最后合成裝配P環(huán)和L環(huán)[51],本研究分析了鞭毛馬達(dá)13個(gè)基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系.MS環(huán)由蛋白FliF組裝,基于34個(gè)菌株的fliF基因系統(tǒng)進(jìn)化樹包括2個(gè)大支,6支肝腸螺桿菌(H.bilis、H.trogontum、H.typhlonius、H.hepaticus、H.jaachi、H.cinaedi)單獨(dú)聚為一個(gè)大支,12株H.pylori、11株胃內(nèi)NHPH和5株肝腸螺桿菌雜聚為另一大支.C環(huán)是鞭毛馬達(dá)的旋轉(zhuǎn)復(fù)合體,控制旋轉(zhuǎn)方向,由蛋白質(zhì)FliG,FliM和FliN組成,基于這3個(gè)基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯著受到寄生部位的影響,譬如,基于35個(gè)菌株的fliG基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分為2個(gè)大支,第Ⅰ支包括12株H.pylori和11株胃內(nèi)NHPH(H.acinonychis、H.cetorum、H.suis、H.bizzozeronii、H.mehlei、H.ailurogastricus、H.cynogastricus、H.felis、H.baculiformis、H.labacensis、H.vulpis);第Ⅱ支中,除胃內(nèi)螺桿菌H.mustelae外,其他11株均為肝腸螺桿菌(H.bilis、H.trogontum、H.winghamensis、H.ganmani、H.pullorum、H.equorum、H.jaachi、H.cinaedi、H.marmotae、H.typhlonius、H.hepaticus).類似的,分泌裝置由蛋白質(zhì)FliP、FliQ和FliR構(gòu)成,基于這3個(gè)基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯著受到寄生部位的影響,H.pylori菌株和胃內(nèi)NHPH聚為一個(gè)大支,肝腸螺桿菌聚為另一大支.聯(lián)動(dòng)桿由蛋白質(zhì)FliE,FlgB,FlgC,FlgF和FlgG組裝,其中flgF基因在NCBI gene數(shù)據(jù)庫(kù)無(wú)完整序列作為參照序列,不進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析.基于flgC基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯著受到寄生部位的影響,而fliE、flgB、flgG基因進(jìn)化關(guān)系較為雜亂.同時(shí),外膜L環(huán)和周質(zhì)P環(huán)相關(guān)基因flgH和flgI的系統(tǒng)進(jìn)化也未發(fā)現(xiàn)明顯規(guī)律.結(jié)果提示,鞭毛動(dòng)力和方向控制相關(guān)基因的系統(tǒng)進(jìn)化受到寄生部位的顯著影響.

2.3.3 螺桿菌屬細(xì)菌脂多糖合成相關(guān)基因系統(tǒng)進(jìn)化分析: 脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性菌的細(xì)胞壁成分,又稱內(nèi)毒素,由類脂A、核心多糖和O-抗原組成[52].LPS合成過(guò)程中,涉及數(shù)十種基因,本研究在NCBI gene數(shù)據(jù)庫(kù)查閱到完整序列的基因有3個(gè),包括脂多糖庚糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(lipopolysaccharide heptosyltransferase Ⅰ,Hep Ⅰ)、脂多糖庚糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅱ(lipopolysaccharide heptosyltransferase Ⅱ,HepⅡ)和脂多糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A(lipopolysaccharide transport periplasmic protein A,LptA).Hep Ⅰ由waaC基因編碼,Hep Ⅱ則由waaF基因編碼,庚糖轉(zhuǎn)移酶參與核心多糖的形成,負(fù)責(zé)將庚糖添加到核心多糖[52].脂多糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A 由lptA基因編碼,負(fù)責(zé)將胞內(nèi)裝配完整的LPS運(yùn)輸?shù)酵饽?從而發(fā)揮抗原特性[53].基于26個(gè)菌株的lptA基因系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,12株H.pylori與6株胃內(nèi)NHPH(H.cetorum、H.suis、H.bizzozeronii、H.mehlei、H.cynogastricus、H.felis)以及4株肝腸螺桿菌(H.marmotae、H.cinaedi、H.jaachi、H.hepaticus)共同構(gòu)成第Ⅰ大支,4株肝腸螺桿菌(H.pullorum、H.winghamensis、H.bilis、H.trogontum)聚為第Ⅱ大支;基于waaC和waaF基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹中,肝腸螺桿菌均單獨(dú)聚為一支(圖3).結(jié)果提示,LPS合成相關(guān)基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系同樣受到寄生部位(胃、肝腸)的影響.

圖3 螺桿菌屬細(xì)菌脂多糖合成相關(guān)基因系統(tǒng)進(jìn)化分析.

2.3.4 螺桿菌屬細(xì)菌尿素酶基因系統(tǒng)進(jìn)化分析:H.pylori尿素酶基因簇由結(jié)構(gòu)基因ureA、ureB和5個(gè)輔助基因(ureE、ureF、ureG、ureH、ureI)構(gòu)成[54].系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,僅1株EHS(H.hepaticus)同時(shí)具有完整的ureA、ureB、ureG基因序列,另外3株EHS(H.muridarum、H.bilis、H.anseris)只具有完整的ureA基因序列.GH具有較為完整的尿素酶基因簇,系統(tǒng)進(jìn)化樹未見明確的規(guī)律(圖4).結(jié)果提示,在螺桿菌屬系統(tǒng)進(jìn)化中,尿素酶基因?qū)H是必需的,對(duì)EHS是非必需的.

3 討論

螺桿菌屬細(xì)菌高度多樣且深度分化,廣泛定植于多種宿主體內(nèi),根據(jù)寄生部位分為GH和EHS.越來(lái)越多的證據(jù)顯示,作為新興的人類病原體和潛在的人畜共患病病原體,螺桿菌屬與人類急性胃腸炎、炎癥性腸病、慢性肝膽疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān),因此,闡明螺桿菌屬細(xì)菌的宿主及傳播途徑是控制此類細(xì)菌感染的關(guān)鍵[6].Mannion等[55]對(duì)100多個(gè)GH和EHS菌株的基因組進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析,發(fā)現(xiàn)GH和EHS基因組之間生理和毒力相關(guān)基因具有顯著異質(zhì)性,EHS表現(xiàn)為非糖酵解依賴特性,更多依賴氨基酸/有機(jī)酸進(jìn)行能量代謝;GH缺乏蛋氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成途徑,依賴于環(huán)境攝取途徑;代謝功能預(yù)測(cè)結(jié)果表明,GH和EHS的進(jìn)化主要是為了適應(yīng)營(yíng)養(yǎng)豐富的胃和營(yíng)養(yǎng)缺乏的肝腸;毒力因子基因圖譜分析發(fā)現(xiàn),GH和EHS可能利用不同的致病機(jī)制感染宿主并誘導(dǎo)炎癥和組織損傷.Haque等[56]分析了13種螺桿菌屬細(xì)菌的脂肪酸譜,結(jié)果發(fā)現(xiàn),GH的脂肪酸以19-碳環(huán)丙烷脂肪酸和十四烷酸為主,EHS的脂肪酸則以十六烷酸和十八烯酸為主.這些結(jié)果提示,胃與肝腸不同營(yíng)養(yǎng)環(huán)境驅(qū)動(dòng)的新陳代謝差異是螺桿菌屬細(xì)菌系統(tǒng)進(jìn)化的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)力.

本研究收集了12株H.pylori和38株NHPH的宿主、寄生部位、致病性和基因組,基于16S rRNA基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,螺桿菌屬細(xì)菌的進(jìn)化樹主要根據(jù)寄生部位分為兩大支,第Ⅰ支是在哺乳動(dòng)物胃內(nèi)寄生的GH,第Ⅱ支是在哺乳動(dòng)物和禽類肝腸寄生的EHS.值得注意的是,從雪貂胃黏膜中分離出的H.mustelae和EHS親緣關(guān)系更密切,H.mustelae主要定植于雪貂胃部,但在糞便中也能檢測(cè)到,提示H.mustelae具有胃、腸、肝跨器官感染的潛力.本研究還發(fā)現(xiàn),鞭毛動(dòng)力和方向控制相關(guān)基因的系統(tǒng)進(jìn)化也受到胃和肝腸寄生部位的顯著影響.Bansil等[57]利用體外實(shí)驗(yàn)觀察螺桿菌屬細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性,發(fā)現(xiàn)細(xì)菌在胃黏液層中的游動(dòng)速度隨著鞭毛數(shù)量的增加而增加,具有雙極鞭毛的H.suis的游動(dòng)機(jī)制比單極的H.pylori更復(fù)雜;在沒(méi)有尿素的情況下,H.pylori在pH＜4的豬胃黏蛋白(porcine gastric mucin,PGM)凝膠中無(wú)法游動(dòng),鞭毛束空轉(zhuǎn);添加尿素后,尿素水解產(chǎn)生NH3,升高黏蛋白凝膠的pH值,促進(jìn)細(xì)菌游動(dòng),提示尿素是H.pylori在酸性胃黏液中游動(dòng)的關(guān)鍵因素.本研究發(fā)現(xiàn),尿素酶基因存在于多數(shù)GH中,僅在4株EHS中表達(dá),提示尿素酶基因?qū)H是必需的,對(duì)EHS是非必需的.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),尿素酶基因敲除的EHS(H.hepaticus3B1)對(duì)盲腸定植水平?jīng)]有影響,但誘導(dǎo)肝炎發(fā)生的能力下降,提示尿素酶基因能夠增強(qiáng)EHS的致病性[58].脂多糖也是革蘭陰性螺桿菌的重要致病物質(zhì),糖基轉(zhuǎn)移酶基因是細(xì)菌脂多糖合成過(guò)程中的關(guān)鍵基因,InterProScan分析顯示,GH和EHS擁有不同的糖基轉(zhuǎn)移酶基因,表明螺桿菌屬脂多糖的結(jié)構(gòu)和合成存在顯著差異[55].本研究發(fā)現(xiàn),基于糖基轉(zhuǎn)移酶基因(waaC和waaF)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹,EHS均單獨(dú)聚為一支.綜合以上結(jié)果,決定螺桿菌屬細(xì)菌系統(tǒng)進(jìn)化的遺傳基礎(chǔ)更偏向于生態(tài)位(即胃和肝腸),而不是宿主物種.

胃和近端小腸比遠(yuǎn)端腸環(huán)境的酸性更強(qiáng),是食物殺菌與消化吸收的主要部位[59].正常狀態(tài)下,約85%的碳水化合物、66%-95%的蛋白質(zhì)和所有脂肪在進(jìn)入大腸前被吸收[60].由于胃和小腸擁有營(yíng)養(yǎng)豐富的環(huán)境,有研究認(rèn)為GH可以直接利用環(huán)境營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),參與生物合成途徑的基因則部分丟失,形成較小的基因組;EHS的生存環(huán)境營(yíng)養(yǎng)較為匱乏,需要更大的基因組和更多樣化的生物合成途徑完成復(fù)雜的新陳代謝[55].結(jié)果提示,H.pylori致病基因在EHS基因組中丟失,可能是適應(yīng)肝腸環(huán)境新陳代謝的結(jié)果.因此,毒力較弱的EHS感染致病可能需要依賴其他腸道微生物的協(xié)同作用.Whary等[61]發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌PTA-6475(L.reuteriPTA-6475)是一種潛在的益生菌,在體外具有抗炎作用,然而,與H.hepaticus共同感染B6.129P2-IL-10tm1Cgn(IL-10-/-)小鼠,能夠顯著促進(jìn)結(jié)腸炎的發(fā)生.Yang等[62]利用IL-10基因敲除的C67BL/6J小鼠作為感染對(duì)象,發(fā)現(xiàn)2種環(huán)境(MHH和MIT)飼養(yǎng)的C57BL/6J IL-10-/-小鼠,對(duì)H.hepaticus誘導(dǎo)的盲腸結(jié)腸炎具有高度可重復(fù)的差異,提示螺旋桿菌屬細(xì)菌的易感性差異與腸道菌群相關(guān).此外,GH僅定植于胃黏膜,而EHS不僅在腸道中定植,也能在肝臟和膽囊中定植,提示EHS可能經(jīng)歷了更為復(fù)雜的環(huán)境進(jìn)化壓力.

隨著越來(lái)越多的螺桿菌屬細(xì)菌被發(fā)現(xiàn),其感染傳播已引起廣泛關(guān)注.中國(guó)是H.pylori高感染和胃癌的高發(fā)區(qū),總體感染率約為55.8%,家庭總體感染率為71.2%,明顯高于個(gè)體感染率,感染者是主要的傳播源[63].NHPH宿主多為哺乳動(dòng)物和禽類,具有潛在的人畜共患性,人類與動(dòng)物的密切接觸是螺桿菌屬致病的風(fēng)險(xiǎn)因素[6].譬如,H.heilmanii最初發(fā)現(xiàn)于人類胃黏膜活檢,也廣泛分布于豬、貓、狗等宿主,臨床曾發(fā)現(xiàn)1例傳染源為寵物狗的慢性胃炎H.heilmanii感染患者.H.pullorum最先發(fā)現(xiàn)于肉雞的盲腸及肝臟,與肉雞肝炎和腸炎相關(guān),也能從腸炎患者糞便和菌血癥患者血液中分離培養(yǎng),提示H.pullorum是一種人畜共患病病原體,肉雞是傳染源,傳播途徑可能與糞便污染、飼養(yǎng)環(huán)境暴露、食用未煮熟的雞肉等相關(guān)[64].這些結(jié)果提示,螺桿菌屬細(xì)菌存在跨宿主傳播感染的潛力,但對(duì)人類致病性依然不完全清楚.

4 結(jié)論

綜上,除某些致病基因(如Ⅳ型分泌系統(tǒng))在NHPH菌株基因組中分布碎片化而無(wú)法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析外,本研究基于H.pylori致病物質(zhì)基因?qū)β輻U菌屬菌株進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析,發(fā)現(xiàn)胃和肝腸生態(tài)位是GH和EHS系統(tǒng)進(jìn)化的主要驅(qū)動(dòng)力,為研究NHPH與H.pylori協(xié)同進(jìn)化與感染機(jī)制提供了系統(tǒng)發(fā)生證據(jù).

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

螺桿菌屬與多種消化道疾病相關(guān),除了幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)外,現(xiàn)已從多種自然動(dòng)物宿主體內(nèi)分離出了38種非H.pylori螺桿菌屬細(xì)菌(non-Helicobacter pylori Helicobacters,NHPH),但對(duì)NHPH的致病性研究尚不充分.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

全面分析NHPH細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,為深入研究NHPH的進(jìn)化與感染機(jī)制提供系統(tǒng)發(fā)生證據(jù).

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

探討螺桿菌屬細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系.

實(shí)驗(yàn)方法

本研究調(diào)取了12株H.pylori和38株NHPH的基因組,基于16S rRNA、鞭毛、尿素酶以及毒力因子基因,利用MAGA 11軟件進(jìn)行序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

基于16S rRNA基因、細(xì)菌鞭毛動(dòng)力相關(guān)基因(flaA、flaB、fliP、fliQ、fliR、fliG、fliM、fliN)、脂多糖合成相關(guān)基因(lptA,waaC和waaF)的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系顯示,胃內(nèi)螺桿菌(GastricHelicobacter,GH)和肝腸螺桿菌(EnterohepaticHelicobacterSpecies,EHS)分別聚集為2個(gè)大支.GH具有較為完整的尿素酶基因簇,EHS中少見尿素酶基因.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

寄生部位(胃和肝腸)是螺桿菌屬菌株系統(tǒng)進(jìn)化的主要驅(qū)動(dòng)力.

展望前景

近年來(lái)非培養(yǎng)依賴的高通量測(cè)序技術(shù)證實(shí)螺旋桿菌屬是胃優(yōu)勢(shì)菌群,本研究發(fā)現(xiàn)尿素酶基因?qū)H是必需的,對(duì)EHS是非必需的,因此,臨床應(yīng)用不依賴尿素酶活性的分子生物學(xué)診斷技術(shù),有助于深入研究螺桿菌屬細(xì)菌(特別是NHPH)參與消化系統(tǒng)疾病的致病機(jī)制.