上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科

益敏輝 王永峰 郝小白 唐 虹 李林霞(上海 200137)

提要 目的：研究二至丸對自然衰老大鼠卵母細(xì)胞線粒體改善的效應(yīng)與機制。方法：選用SPF級SD雌性大鼠，隨機分為8周齡青年對照組、20周齡老年對照組、20周齡二至丸用藥低劑量組和高劑量組。用藥30 d后，進(jìn)行腹腔注射孕馬血清促性腺激素(20 IU/只)，2 d后給予人絨毛膜促性腺激素(10 IU/只)，干預(yù)12 h后觀察卵母細(xì)胞腺苷三磷酸(ATP)、活性氧(ROS)含量及線粒體的數(shù)目、形態(tài)，檢測線粒體動態(tài)調(diào)控蛋白過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子1α(PGC-1α)、視神經(jīng)萎縮蛋白1(OPA1)、PTEN誘導(dǎo)蛋白激酶1(PINK1)的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：和青年對照組相比，老年對照組卵巢卵母細(xì)胞ATP的含量減少(P<0.05)，細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量下降，結(jié)構(gòu)紊亂，部分呈空泡化，PGC-1α、OPA1及PINK1蛋白水平下降(P<0.05)；二至丸低、高劑量組可提高老年大鼠卵母細(xì)胞ATP的濃度(P<0.05)，增加細(xì)胞內(nèi)線粒體含量、改善結(jié)構(gòu)及減少ROS的生成(P<0.05)，促進(jìn)PGC-1α、OPA1和PINK1的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論：二至丸可以改善衰老卵巢內(nèi)的卵母細(xì)胞線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，提高線粒體自我更新以達(dá)到修復(fù)自然衰老卵母細(xì)胞的作用。

衰老是機體的一種自然生理現(xiàn)象，任何生物都無法避免，是機體隨著時間的推移導(dǎo)致器官的形態(tài)和功能出現(xiàn)不可逆的衰退。女生生殖系統(tǒng)的衰老會引起卵泡的數(shù)量降低、質(zhì)量下降以及雌激素分泌不足等一系列癥狀，影響著女性的身心健康。衰老的速度是否影響卵巢的儲備功能，是目前研究的重點。

中醫(yī)常用補腎類方藥來治療或延緩衰老相關(guān)疾病。由女貞子和旱墨蓮構(gòu)成的經(jīng)典名方二至丸，功效是補益肝腎、滋陰止血，臨床上用于治療腰膝酸痛、月經(jīng)量偏多及早年發(fā)白等肝腎陰虛癥狀[1]。研究證實對卵巢早衰性疾病的治療有良好的效果[2]；自然衰老的女性或雌性動物中卵母細(xì)胞的線粒體含量降低或功能出現(xiàn)障礙[3]；有學(xué)者提出改善線粒體的功能結(jié)構(gòu)或增加線粒體數(shù)量能延緩卵巢的衰老和改善女性生育能力的理論[4]，由此推演線粒體是卵巢衰老的決定因素[5]。已有研究報道二至丸能提高雌激素分泌、卵泡增加及閉鎖卵泡減少等[6]。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)二至丸可能與衰老相關(guān)的因子有關(guān)聯(lián)，對腫瘤壞死因子(TNF)、缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF1)、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)通路上多個位點進(jìn)行干預(yù)，可以發(fā)揮延緩衰老的作用，調(diào)控老年大鼠炎癥反應(yīng)、緩解血液的黏度和改善免疫功能，共同發(fā)揮延緩衰老的作用[7]。

目前研究報道揭示二至丸通過刺激雌激素分泌改善卵巢的功能[8]，本研究將通過修復(fù)卵母細(xì)胞線粒體的功能驗證卵母細(xì)胞的改善和衰老的延緩，為保護女性的生殖健康提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物：選用雌性SD大鼠(3周齡)并具有正常動情周期，訂購于上海維通利華實驗動物有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2017-0011。隨機分組后飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗室，設(shè)置室內(nèi)溫度20～25 ℃、自然光照、噪音80分貝以下，自由進(jìn)食飲水。該實驗動物經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會通過，倫理編號：2023-AR-004。

1.1.2 主要藥物：二至丸組方：墨旱蓮、女貞子各10 g，均訂購于上海青山中藥飲片公司。常規(guī)水煎液煎制并濃縮成浸膏，最后計算藥液含總生藥量為1 g/mL。

1.1.3 主要試劑：透明質(zhì)酸酶(H3506)：美國 Sigma-Aldrich公司；ROS檢測試劑盒(210812)：美國Thermo Fisher公司；ATP檢測試劑盒(0180125)：美國 Life Technologies公司；hCG(20191226)：北京博士德生物；PMSG(20201316)：美國Sigma-Aldrich公司；過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子1α(PGC-1α)抗體、視神經(jīng)萎縮蛋白1(OPA1)抗體、PTEN誘導(dǎo)蛋白激酶1(PINK1)抗體、β-肌動蛋白抗體和HPR標(biāo)記的山羊抗兔單抗(批號分別為GR142564、GR131331、GR121882、GR68023514、A20160112)：美國Santa Cruz公司；RIPA試劑(15687)：北京普利萊基因；BCA蛋白檢測試劑盒(R0016)：北京聯(lián)科生物；硝化纖維素膜(170-4156)：美國Bio-Rad公司；ECL顯影液(RPN418)：美國Amersham公司。

1.1.4 主要儀器：分析天平(美國賽多利斯)；Smartplus-N30VF純水儀；上海力康HF90型CO2培養(yǎng)箱；超凈工作臺(蘇凈安泰)；Mini Protean 3 Cell 型電泳槽；低溫超速離心機(美國EPPENDORF公司)；蛋白電泳儀(美國賽默飛)；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國伯樂公司)；EM-30AX電鏡(美國庫塞姆公司)；熒光顯微鏡(德國LEICA公司SP5-DMI6000-DIC)。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥：根據(jù)周齡隨機分組為青年組對照組(8周齡)、老年組對照組(20周齡)、二至丸高劑量組(3 g·kg-1·d-1)和低劑量組(1 g·kg-1·d-1)[9]，每組20只。青年對照組自然生長，不進(jìn)行干預(yù)；二至丸高劑量組和低劑量組每日7-8點間采用灌胃的方式給藥；老年對照組以同樣的方式給予生理鹽水，劑量30 mL·kg-1·d-1。每日1次，連續(xù)30 d。

1.2.2 收集大鼠卵母細(xì)胞：每組在灌胃干預(yù)結(jié)束后進(jìn)行腹腔注射孕馬血清促性腺激素(PMSG)10 IU，2 d后腹腔注射人絨毛膜促性腺激素(hCG)15 IU促進(jìn)排卵[10]，14～16 h后將SD大鼠以吸入乙醚的方式進(jìn)行麻醉，70%酒精腹部消毒后，在無菌條件下切開腹部取SD大鼠卵巢組織，放置PBS液中，反復(fù)清洗3次，解剖顯微鏡下找到卵泡并用無菌注射針刺破，將卵母細(xì)胞游離出來，放置含有3 mg/mL透明質(zhì)酸酶的DMEM液中，將透明質(zhì)酸酶除去后獲取卵細(xì)胞，放至DMEM培養(yǎng)基中。

1.2.3 測定ATP含量：采用生物發(fā)光檢測試劑盒測定卵母細(xì)胞ATP含量，根據(jù)說明書進(jìn)行操作。每組10個，單個置于96孔板不同孔中，用裂解液進(jìn)行裂解，用微量測光儀迅速測定其產(chǎn)生的光量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計算出卵母細(xì)胞的ATP含量。

1.3 電鏡觀察線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)及數(shù)目 卵母細(xì)胞用3%戊二醛固定后置于4 ℃固定24 h，用預(yù)冷的PBS浸洗3 min×3次，再次加入3%戊二醛固定2 h，乙醇脫水，EMBed 812包埋固定。置電鏡下觀測并拍照，根據(jù)文獻(xiàn)[10]計算得出細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量。

1.4 活性氧(ROS)的測定 測定卵母細(xì)胞的ROS，把2’，7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCHFDA)溶解于二甲基亞砜中制備的儲備液中，置于-20 ℃的暗盒中保存。使用前1 h稀釋至0.01 mmol·L-1，染色卵母細(xì)胞15 min。PBS充分浸洗5 min×3次，離心重懸后充分覆蓋載玻片上，徠卡激光共聚焦顯微鏡下488 nm激發(fā)獲得熒光，進(jìn)行觀察并拍照。

1.5 Western Blot測定PGC-1α、OPA1及PINK1蛋白的表達(dá) 將100個卵母細(xì)胞與300 μLRIPA裂解液混合，離心12 000×15 min，取上清，在95 ℃下變性10 min。然后蛋白進(jìn)行電泳分離，將分離的多肽進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，用2%BSA封閉1 h。TBS-T浸洗3 min×3次，分別加入一抗PGC-1α(1∶350)、OPA1(1∶350)、PINK1(1∶400)以及內(nèi)參β-actin(1∶3 000)，4 ℃孵育過夜。過夜后TBS-T洗滌5 min×3次，加抗兔二抗(1∶5 000)室溫下孵育1 h，TBS-T洗滌3 min×3次，用顯影液對信號進(jìn)行檢測，灰度掃描，利用軟件ImageJ計算OD值，分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 二至丸對各組細(xì)胞內(nèi)ATP含量的影響 結(jié)果顯示老年對照組ATP含量降低，與青年對照組對比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。證實隨著年齡增加，卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞的能量合成是減少的。老年對照組經(jīng)過二至丸的治療，不論高劑量還是低劑量均提高了衰老細(xì)胞內(nèi)的ATP含量(P<0.05)，證實二至丸可以提高卵母細(xì)胞合成ATP的能力。詳見表1。

表1 二至丸對各組卵母細(xì)胞ATP含量的影響

2.2 二至丸對各組卵母細(xì)胞線粒體形態(tài)、數(shù)量的影響 從結(jié)果得知，老年對照組的線粒體：形態(tài)模糊辨認(rèn)不清，特別是線粒體嵴，數(shù)目也減少(詳見圖1)，與青年對照組對比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，說明衰老的過程中線粒體的數(shù)目和質(zhì)量都在隨著下降。和老年對照組比較，二至丸高、低劑量治療組線粒體數(shù)目均增高，形態(tài)結(jié)構(gòu)改善。表明二至丸可以改善衰老卵母細(xì)胞線粒體的形態(tài)，使線粒體的數(shù)量增加。詳見表2、圖1。

注：A.青年對照組；B.老年對照組；C.二至丸低劑量組；D.二至丸高劑量組

表2 二至丸對各組細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量的影響

2.3 二至丸對各組細(xì)胞內(nèi)ROS的影響 由實驗結(jié)果得知，老年對照組與青年對照組比較起來，細(xì)胞ROS增高(P<0.05)，這表明隨著衰老線粒體產(chǎn)生ROS增多。二至丸用藥組和老年對照組比較，高、低劑量組均可降低衰老卵母細(xì)胞的ROS產(chǎn)生(P<0.05)。這表明，二至丸可以減低老年大鼠線粒體內(nèi)ROS的產(chǎn)生，改善線粒體的有氧氧化。詳見圖2、表3。

注：A.青年對照組；B.老年對照組；C.二至丸低劑量組；D.二至丸高劑量組

表3 二至丸對各組大鼠卵母細(xì)胞ROS的影響

2.4 二至丸對各組PGC-1α、OPA1和PINK1蛋白表達(dá)的影響 由實驗結(jié)果可知，老年對照組和青年對照組相比，線粒體蛋白PGC-1α、OPA1及PINK1的表達(dá)量下降(P<0.05)，而這些蛋白都和線粒體的動力過程有關(guān)，說明線粒體的動力過程隨著年齡的衰老而下降。與老年對照組比，二至丸低、高劑量組都提高了衰老細(xì)胞內(nèi)的PGC-1α、OPA1和PINK1的蛋白表達(dá)(P<0.05)，說明二至丸可以改善衰老卵母細(xì)胞線粒體的動力過程。詳見表4、圖3。

注：A.青年對照組；B.老年對照組；C.二至丸低劑量組；D.二至丸高劑量組

表4 二至丸對各組細(xì)胞內(nèi)PGC-1α、OPA1及PINK1蛋白表達(dá)的影響

3 討論

從生理發(fā)育的角度證實卵泡的生長發(fā)育需要大量的能量，卵母細(xì)胞的發(fā)育需要經(jīng)過形態(tài)和功能的改變，不斷合成細(xì)胞內(nèi)的各種物質(zhì)，分泌激素等，都需要能量的供給，但能量的來源幾乎全部來自于線粒體的有氧氧化。相比其他細(xì)胞，卵母細(xì)胞需要更多的能量以維持生理功能，導(dǎo)致能量代謝強度增大，線粒體易受損。一旦線粒體的功能出現(xiàn)障礙，細(xì)胞內(nèi)能量就會減少，導(dǎo)致生理功能障礙，同時闡釋了為什么女性生殖系統(tǒng)是最早表現(xiàn)出衰老的系統(tǒng)[11]。若改善線粒體的功能，如使用藥物或通過微注射更換線粒體，可以逆轉(zhuǎn)衰老的卵母細(xì)胞，延緩整個機體的衰老[12]，說明線粒體在衰老過程中是不可缺少的。

線粒體是一個細(xì)胞器，是動態(tài)的，是通過自我分裂不斷生成新的線粒體，經(jīng)過融合形成大的線粒體，再重新分裂成兩個新的，將嚴(yán)重受損的線粒體進(jìn)行自我吞噬、清除，整個過程可使線粒體的結(jié)構(gòu)和功能得以保持完整，控制線粒體的質(zhì)和量。但受PGC-1α調(diào)控，調(diào)控線粒體增生；OPA1位于線粒體內(nèi)膜上，調(diào)控線粒體的融合；PINK1調(diào)控線粒體的自我吞噬，當(dāng)線粒體受到損害時被激活，與E3泛素連接酶結(jié)合，激活自我吞噬，清除喪失功能的線粒體。上述三個蛋白的變化代表著線粒體動力功能的狀態(tài)[13-14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，老年大鼠卵母細(xì)胞線粒體數(shù)目少，形態(tài)發(fā)生改變，ATP含量減少，而ROS生成增多，線粒體動力過程相關(guān)蛋白下降，隨著年齡的增長，機體能量代謝呈下降趨勢，線粒體功能也隨之下降。本研究結(jié)果與國內(nèi)外的實驗研究結(jié)果一致[15-16]，進(jìn)一步印證線粒體功能下降是導(dǎo)致機體衰老的主要機制之一。通過PGC-1α、OPA1和PINK1的蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)[16-17]，分析在老年對照組中的卵母細(xì)胞有不同程度的下降，推測線粒體的動力過程出現(xiàn)某種程度的損害，導(dǎo)致新線粒體生成、融合、老化及受損的線粒體的清除都出現(xiàn)了障礙，一旦衰老的卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體的含量減少，形態(tài)也隨之發(fā)生變化[17]。

二至丸來源于明代吳旻輯的《扶壽精方》，在《醫(yī)便》中的二至丸即是女貞丹。根據(jù)冬至之時采取女貞子和夏至之日收割墨旱蓮由來，制成丸藥，故稱為二至丸。女貞子性平，味甘苦，偏涼，入肝腎之經(jīng)，有補益肝腎、滋陰補血和清肝明目作用；墨旱蓮性涼且甘酸，具備涼血止血、養(yǎng)陰烏發(fā)和祛濕止癢的功效。女貞子與墨旱蓮性平和，兩者配伍，相須為用，補肝腎之經(jīng)，治肝腎陰虛所致耳鳴、頭暈、目昏和崩漏等[18]。二至丸經(jīng)過藥理分析得知其藥理成分，研究得知其成份槲皮素、木犀草素、刺槐素和山奈酚有抗氧化、抗炎、抗血小板聚集及保護神經(jīng)等多種作用[19]；證實槲皮素又是一種黃酮類化衍生物，在卵巢早衰小鼠的卵泡生長至成熟的過程中有增加免疫的功效，抵抗由免疫低下引起的卵巢炎癥，同時促進(jìn)卵泡的生長發(fā)育至成熟并排卵[20-21]，研究證實減少卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡是因木犀草素抑制TNF-α和IL-6的作用[22-23]。促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞分泌雌二醇是由于女貞子中的β-谷甾醇在發(fā)揮作用，屬于植物性甾醇[24]。通過本次實驗發(fā)現(xiàn)，二至丸高低劑量均能夠改善衰老卵母細(xì)胞的線粒體數(shù)量和質(zhì)量，增強ATP合成能力，減少ROS的產(chǎn)生，從而提高線粒體的功能。二至丸改善卵母細(xì)胞線粒體功能是通過上調(diào)PGC-1α、OPA1和PINK1蛋白的表達(dá)，證實二至丸調(diào)控線粒體的動力過程，加速其新陳代謝。

綜上所述，二至丸可以促進(jìn)衰老卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體的有氧氧化，促進(jìn)ATP的產(chǎn)生，促進(jìn)線粒體調(diào)控蛋白的表達(dá)，改善線粒體的新陳代謝，為二至丸治療和改善女性卵巢早衰和卵巢老化提供新的治療思路及分子生物的機制。