劉曉娟, 鄧培淵, 范春麗, 田云芳

(鄭州師范學(xué)院 鄭州市植物景觀多樣性與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450044)

環(huán)氧蟲啶(cycloxaprid)是華東理工大學(xué)開發(fā)的一個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新煙堿類殺蟲劑[1]。在商品化新煙堿類殺蟲劑的結(jié)構(gòu)中，吡蟲啉等常見殺蟲劑的硝基均為反式構(gòu)型，而環(huán)氧蟲啶是獨(dú)特的順式硝基構(gòu)型并含有七元氧橋雜環(huán)結(jié)構(gòu) (結(jié)構(gòu)式見圖式1)，因此環(huán)氧蟲啶的作用機(jī)制與其他新煙堿類不同，其對(duì)抗性害蟲的殺蟲活性優(yōu)于吡蟲啉，具有廣闊的應(yīng)用前景[2]。

圖式 1 環(huán)氧蟲啶結(jié)構(gòu)式Scheme 1 The structural formula of cycloxaprid

由于新煙堿類殺蟲劑對(duì)昆蟲煙堿乙酰膽堿受體具有較高選擇性，所以被認(rèn)為其對(duì)非靶標(biāo)生物低毒[3]。但有研究表明，新煙堿類殺蟲劑對(duì)非靶標(biāo)生物也具有危害性，主要表現(xiàn)為氧化應(yīng)激、抑制活動(dòng)能力、損傷DNA 和生育功能受損等[3-4]。此外，由于該類殺蟲劑的大量使用，導(dǎo)致土壤、水體、空氣等被污染，而人體通過飲食、飲水、呼吸等多種途徑會(huì)暴露于該類農(nóng)藥中[5]，因此其對(duì)人類的生育、生殖、神經(jīng)以及臟器功能也帶來風(fēng)險(xiǎn)[6-7]。

目前，有關(guān)環(huán)氧蟲啶的研究，在毒理學(xué)、作用方式、代謝與殘留等方面取得了一定的進(jìn)展[8]，但其對(duì)人體的影響、毒性機(jī)理以及在人體內(nèi)的運(yùn)輸機(jī)制尚缺乏進(jìn)一步研究。人血清白蛋白 (human serum albumin, HSA) 是人血漿中含量最豐富的非特異性載體蛋白質(zhì)，具有多種生理功能[9]。藥物進(jìn)入人體血液系統(tǒng)后，大部分先與HSA 進(jìn)行可逆結(jié)合，然后進(jìn)行存儲(chǔ)、轉(zhuǎn)運(yùn)、發(fā)揮藥效或毒副作用。藥物與HSA 可逆結(jié)合的親和性，直接影響了藥物分子在血液中的生物利用率、分布、自由態(tài)濃度和代謝[10]。此外，HSA 還是研究藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合機(jī)制的經(jīng)典模型蛋白，常被用于藥物與蛋白質(zhì)相互作用的研究中[11-12]。因此，在分子水平研究環(huán)氧蟲啶與HSA 的相互作用，對(duì)環(huán)氧蟲啶的毒理學(xué)及其安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有較大的借鑒意義。

當(dāng)藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，蛋白質(zhì)的二維和三維結(jié)構(gòu)均會(huì)發(fā)生改變，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的生理功能[13]。熒光光譜法是研究蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的一種有效方法，可以推斷蛋白質(zhì)分子在各種環(huán)境下的構(gòu)象變化，進(jìn)而闡釋蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能間的關(guān)系[14]。分子對(duì)接是通過計(jì)算機(jī)建立小分子配體與蛋白質(zhì)的受體結(jié)構(gòu)，模擬二者結(jié)合中發(fā)生的分子行為與結(jié)構(gòu)變化[15]，是研究分子間相互作用的重要方法之一。分子動(dòng)力學(xué)可以從分子水平來研究藥物靶點(diǎn)蛋白的結(jié)構(gòu)[16]，為研究蛋白質(zhì)的力學(xué)行為、蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)的相互作用和生物網(wǎng)絡(luò)分析提供了新視角和新途徑[17]。熒光光譜法、分子對(duì)接技術(shù)及分子動(dòng)力學(xué)模擬三者常常結(jié)合使用，用于對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的進(jìn)一步驗(yàn)證[18-21]。鑒于此，本研究運(yùn)用熒光光譜法、分子對(duì)接技術(shù)及分子動(dòng)力學(xué)模擬相結(jié)合來研究環(huán)氧蟲啶與HSA 結(jié)合的特性和機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

F-380 型熒光分光光度計(jì) (天津港東科技發(fā)展有限公司)，YASARA 分子模擬工作站 (奧地利格拉茲大學(xué))。環(huán)氧蟲啶(cycloxaprid，99.5%標(biāo)準(zhǔn)品，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司)，人血清白蛋白(HSA)、華法林 (warfarin) 和布洛芬 (ibuprofen)(北京索萊寶科技有限公司)。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 熒光猝滅實(shí)驗(yàn) 添加1.0 × 10-4mol/L 的環(huán)氧蟲啶甲醇溶液于1.0 × 10-6mol/L 的HSA 溶液中(HSA 溶于PBS 緩沖液，pH = 7.4，含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl)，使環(huán)氧蟲啶的終濃度分別為HSA濃度的0、1、2、4、6、8、10 倍；激發(fā)波長(zhǎng)λex=280 nm，狹縫寬度為10/5 nm，發(fā)射波長(zhǎng)在290～450 nm，分別設(shè)置溫度為293、302 和310 K，掃描HSA 與環(huán)氧蟲啶作用的熒光光譜。

1.2.2 位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn) 位點(diǎn)標(biāo)記物華法林和布洛芬分別代表HSA 結(jié)構(gòu)的siteI 和siteⅡ位點(diǎn)，環(huán)氧蟲啶和HSA 濃度比為4 : 1，向其中加入位點(diǎn)標(biāo)記物進(jìn)行滴定實(shí)驗(yàn)。其他實(shí)驗(yàn)方法與1.2.1 節(jié)相同，計(jì)算在310 K 時(shí)HSA 和環(huán)氧蟲啶的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

1.2.3 分子對(duì)接 通過分子對(duì)接可以將配體與受體迅速結(jié)合，從而獲取配體和受體之間相互作用信息，實(shí)現(xiàn)對(duì)分子間結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合作用力的預(yù)測(cè)[22]。從Protein Data Bank 中下載HSA 晶體結(jié)構(gòu)(2BX8)，運(yùn)用YASARA 程序完成原始結(jié)構(gòu)的加H、除H2O 和添加缺失原子[23]；參考1.2.2 節(jié)中確定的環(huán)氧蟲啶結(jié)合位點(diǎn)，運(yùn)用AutoDock4.0 進(jìn)行剛性對(duì)接，設(shè)置環(huán)氧蟲啶為全柔性結(jié)構(gòu)，其他參數(shù)均為默認(rèn)值。

1.2.4 分子動(dòng)力學(xué)模擬 分子動(dòng)力學(xué)模擬在YASARA 平臺(tái)完成。體系置于TIP3P 顯性立方體H2O 分子模型中，原子與邊界之間的距離為0.9 nm，采用Amber14 力場(chǎng)，添加鈉離子保持體系電中性。模擬設(shè)置pH = 7.4 和溫度310 K，采用NVT正則系宗和郎格萬方法控制體系溫度，積分步長(zhǎng)為2.5 fs，采樣間隔為50 ps。程序在Centos 系統(tǒng)下運(yùn)行。

1.2.5 結(jié)合自由能計(jì)算 運(yùn)用Amber12 程序包MMPBSA.py 模塊中的MM-PBSA[24]方法計(jì)算環(huán)氧蟲啶和HSA 的結(jié)合自由能，對(duì)模擬平衡后5 ns動(dòng)力學(xué)軌跡的100 個(gè)構(gòu)象進(jìn)行采樣分析，結(jié)合自由能 (ΔG) 和范德華力 (ΔEvdw)、靜電作用力 (ΔEele)、非極性溶劑化能 (ΔGnopolar) 和極性溶劑化能 (ΔGpb)間的關(guān)系如公式 (1) 所示：

1.2.6 能量分解和丙氨酸突變掃描 運(yùn)用Amber14軟件包，分解對(duì)接復(fù)合物中HSA 單個(gè)氨基酸能量貢獻(xiàn)。為評(píng)估單個(gè)氨基酸能量貢獻(xiàn)值的分布特征，對(duì)貢獻(xiàn)值較高 (大于2.09 kJ/mol) 的氨基酸進(jìn)行丙氨酸突變掃描計(jì)算[25]，比較突變前結(jié)合自由能(ΔGwild)和突變后結(jié)合自由能(ΔGmutant)的差值(ΔΔG)。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光猝滅機(jī)制

在模擬人體生理的條件下，測(cè)試了不同濃度的環(huán)氧蟲啶加入HSA 混合液的熒光光譜。結(jié)果(圖1) 表明，HSA 的內(nèi)源熒光發(fā)射峰位于334 nm處，隨著環(huán)氧蟲啶的加入，HSA 的熒光強(qiáng)度逐漸降低，峰值有微弱藍(lán)移，表明環(huán)氧蟲啶使HSA 的色氨酸殘基的微環(huán)境發(fā)生了變化[25]，環(huán)氧蟲啶能有效地猝滅HSA。

圖1 不同濃度環(huán)氧蟲啶時(shí)HSA 的熒光發(fā)射光譜Fig.1 Emission spectra of human serum albumin in the presence of various concentrations of cycloxaprid

判斷體系的熒光猝滅機(jī)制時(shí)，可按照Stern-Volmer 方程 (2)[26]進(jìn)行分析。

式中：F0和F分別表示沒有和有環(huán)氧蟲啶時(shí)HSA 的熒光強(qiáng)度；Ksv為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)；[Q]為環(huán)氧蟲啶濃度；Kq為猝滅速率常數(shù)；τ0為HSA 的分子平均壽命10-8s。計(jì)算的猝滅常數(shù) (表1) 顯示，HSA 和環(huán)氧蟲啶的Ksv的值隨著溫度的升高而減小，說明HSA 和環(huán)氧蟲啶的作用為靜態(tài)猝滅，Kq值遠(yuǎn)大于生物大分子的最大碰撞碎滅常數(shù)(2.0 ×1010L/(mol·s))[26]，說明HSA 與環(huán)氧蟲啶有較強(qiáng)的親和力，環(huán)氧蟲啶與HSA 結(jié)合利于其到達(dá)特定組織和持續(xù)發(fā)揮作用。

表1 不同溫度下環(huán)氧蟲啶和HSA 相互作用的猝滅常數(shù)(Ksv)、猝滅速率常數(shù)(Kq)Table 1 The quenching constants (Ksv), quenching rate constants (Kq) of the interaction of cycloxapyrid with HSA at different temperatures

2.2 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

HSA 和環(huán)氧蟲啶的結(jié)合為靜態(tài)猝滅過程，KA為結(jié)合常數(shù)，n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，按照公式(3)計(jì)算得到不同溫度下HSA 和環(huán)氧蟲啶結(jié)合常數(shù)在0.76 × 105～1.57 × 105L/mol 之間，表明兩者有較強(qiáng)的結(jié)合能力；結(jié)合位點(diǎn)數(shù)位于0.89～0.98 之間，說明兩者有1 個(gè)結(jié)合位點(diǎn) (表2) 。

表2 不同溫度下環(huán)氧蟲啶與HSA 作用的結(jié)合常數(shù) (KA) 和結(jié)合位點(diǎn)數(shù) (n)Table 2 The binding constants (KA) and binding sites (n)of the cycloxapyrid with HSA at different temperatures

2.3 環(huán)氧蟲啶結(jié)合位點(diǎn)的確定

藥物與蛋白之間的相互作用通常是多種作用力的協(xié)同作用，這種相互作用的量化參數(shù)就是藥物與蛋白的結(jié)合常數(shù)KA。結(jié)合常數(shù)越小，表明外源物對(duì)位點(diǎn)探針的替代性越強(qiáng)，即競(jìng)爭(zhēng)性越強(qiáng)。

HSA 的兩個(gè)主要結(jié)合位點(diǎn)siteI 和siteII，分別位于HSAIIA 和IIIA 的疏水腔內(nèi)。研究表明，華法林與HSA 結(jié)合在siteI 位點(diǎn)，布洛芬結(jié)合在siteII 位點(diǎn)[27]。本研究結(jié)果 (表3) 顯示，與空白對(duì)照比對(duì)，添加華法林后環(huán)氧蟲啶與HSA 的結(jié)合常數(shù)發(fā)生了明顯的變化，說明環(huán)氧蟲啶法與華法林競(jìng)爭(zhēng)同一結(jié)合位點(diǎn)，即環(huán)氧蟲啶結(jié)合在了HSA IIA 疏水腔內(nèi)的siteI 位點(diǎn)。

表3 位點(diǎn)標(biāo)記物對(duì)結(jié)合體系結(jié)合常數(shù)的影響Table 3 Effect of site maker probes on binding constants of binding system

2.4 熱力學(xué)參數(shù)和作用力類型

蛋白質(zhì)與小分子借助氫鍵、靜電作用力、范德華力和疏水作用力等非共價(jià)結(jié)合形成復(fù)合物，其作用力類型可以根據(jù)熱力學(xué)常數(shù)大小判斷，通過Van't Hoff 方程[28](公式4 和5) 計(jì)算自由能變(ΔG)、焓變 (ΔH) 和熵變 (ΔS)。

不同溫度條件下環(huán)氧蟲啶與HSA 相互作用的熱力學(xué)參數(shù)測(cè)定結(jié)果 (表4) 表明：不同溫度下，ΔG均小于0，表明兩者的結(jié)合是自發(fā)反應(yīng)；ΔH和ΔS均小于0，根據(jù)Ross 等[29]提出的理論分析，環(huán)氧蟲啶和HSA 結(jié)合過程的主要作用力是范德華力和氫鍵作用。

表4 不同溫度下環(huán)氧蟲啶和HSA 相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 4 Thermodynamic parameters for the interaction of the cycloxapyrid with HSA at different temperatures

2.5 分子對(duì)接結(jié)果

參考2.3 節(jié)中預(yù)測(cè)的環(huán)氧蟲啶與HSA 的結(jié)合位點(diǎn)，將其固定于HSA 的siteI 位點(diǎn)，設(shè)置Grid Box 涵蓋整個(gè)模型，對(duì)接體系格點(diǎn)為110 × 98 × 105，間距為0.375 ? (1 ? = 0.1 nm)，最優(yōu)結(jié)合模式如圖2 所示，環(huán)氧蟲啶與His416 和Gln459 形成了兩個(gè)鍵長(zhǎng)分別為4.13 ?和5.89 ?的氫鍵，說明氫鍵是兩者結(jié)合的分子基礎(chǔ)，這與熱力學(xué)參數(shù)顯示的結(jié)果是一致的。

圖2 環(huán)氧蟲啶與HSA 的結(jié)合方式Fig.2 Binding mode of cycloxapyrid and HSA

2.6 分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果

本研究采用分子動(dòng)力學(xué)對(duì)分子對(duì)接的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。均方根偏差 (root mean square deviation，RMSD) 是判斷體系是否達(dá)到平衡狀態(tài)的重要指標(biāo)之一。由圖3、圖4 可知，HSA 和環(huán)氧蟲啶復(fù)合物體系中，在約25 ns 達(dá)到收斂平衡狀態(tài)，主鏈原子的RMSD 在2.0 ?左右波動(dòng)，說明兩者可以形成穩(wěn)定復(fù)合物；與HSA 單體的分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果相比，復(fù)合物體系更容易達(dá)到平衡態(tài)，且RMSD值更低，說明HSA 中加入環(huán)氧蟲啶后，體系更加穩(wěn)定，進(jìn)一步證明了兩者的結(jié)合可以自發(fā)進(jìn)行。

圖3 分子動(dòng)力學(xué)模擬中主鏈原子均方根偏差的變化Fig.3 The change of RMSD of backbone atoms in molecular dynamics simulation

圖4 分子動(dòng)力學(xué)模擬體系能量變化Fig.4 The change of system energy in molecular dynamics simulation

2.7 結(jié)合自由能的計(jì)算結(jié)果

運(yùn)用Amber12 程序包MMPBSA.py 模塊中的MM-PBSA 方法，計(jì)算得到環(huán)氧蟲啶與HSA 自由能為 -25.90 kJ/mol (表5)，兩者形成了相對(duì)穩(wěn)定的復(fù)合物。對(duì)結(jié)合自由能進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，范德華力、靜電作用力和非極性溶劑化能可促進(jìn)兩者的結(jié)合，能量貢獻(xiàn)值分別為 -77.95、-23.81 和 -12.30 kJ/mol，其中范德華力是主要驅(qū)動(dòng)力；極性溶劑化能是主要的抑制力，能量貢獻(xiàn)值為85.81 kJ/mol。

表5 環(huán)氧蟲啶和HSA 復(fù)合物結(jié)合自由能和組分Table 5 The binding free energy and components of cycloxapyrid and HSA complex (kJ/mol)

2.8 氨基酸殘基能量分解結(jié)果

為研究HSA 單個(gè)氨基酸殘基在結(jié)合過程中的能量貢獻(xiàn)及分布，運(yùn)用Amber12 程序分析了單個(gè)氨基酸的總能量和側(cè)鏈能量，結(jié)果見表6。共有6 個(gè)氨基酸的能量貢獻(xiàn)值超過6 kJ/mol，包括Ala194、Leu198、Val455、Asn458、Gln459 和Val462，氨基酸Gln459 貢獻(xiàn)值差最大，為11.22 kJ/mol。這些氨基酸殘基集中在Gln459 附近，表明該區(qū)域是環(huán)氧蟲啶和HSA 結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。

表6 環(huán)氧蟲啶和HSA 復(fù)合物殘基能量分解能量分項(xiàng)值Table 6 The energy decomposition on a per-residue of cycloxapyrid and HSA complex (kJ/mol)

2.9 丙氨酸突變掃描結(jié)果

單個(gè)氨基酸殘基的能量貢獻(xiàn)值，包括殘基之間的相互作用和殘基與外源分子的作用[30]。為了探究氨基酸殘基對(duì)外源分子結(jié)合的影響，假設(shè)受體和配體的結(jié)合模式不受局部構(gòu)象變化的影響，選取Ala194、Leu198、Val455、Asn458、Gln459 和Val462 氨基酸突變體進(jìn)行掃描。

丙氨酸突變掃描是為了進(jìn)一步分辨出氨基酸殘基能量分解后自由能較高的氨基酸。掃描結(jié)果顯示，只有Asn458 和Gln459兩個(gè)氨基酸突變體具有較明顯的結(jié)合自由能 (表7)，結(jié)合自由能差分別為 -7.40 和 -10.42 kJ/mol，表明Gln459 是與外源分子環(huán)氧蟲啶結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸，這也是對(duì)氨基酸殘基能量分解結(jié)果的進(jìn)一步驗(yàn)證。

表7 環(huán)氧蟲啶和HSA 結(jié)合突變體的結(jié)合自由能Table 7 The binding free energies of mutant complex of cycloxapyrid and HSA (kJ/mol)

3 結(jié)論與討論

本研究探討了環(huán)氧蟲啶與人血清蛋白的相互作用。分別采用熒光猝滅法、分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)等方法進(jìn)行了多方面的實(shí)驗(yàn)與驗(yàn)證。熒光猝滅是指熒光分子與溶劑分子之間發(fā)生猝滅，多用于生物大分子和小分子藥物或者金屬離子之間的相互作用[31]。借助于熒光猝滅法，獲得環(huán)氧蟲啶與HSA 的結(jié)合常數(shù)在0.76 × 105～1.57 × 105L/mol之間，二者結(jié)合在HSA IIA 疏水腔內(nèi)的siteI 位點(diǎn)。分子對(duì)接時(shí)，以結(jié)構(gòu)生物學(xué)為基礎(chǔ)進(jìn)行環(huán)氧蟲啶與HSA 相互作用的動(dòng)力學(xué)模擬研究，確定環(huán)氧蟲啶與HSA 的作用靶點(diǎn)，得到HSA 與環(huán)氧蟲啶的結(jié)合自由能為 -25.90 kJ/mol，表明二者可以形成穩(wěn)定的復(fù)合物。農(nóng)藥與蛋白質(zhì)的有效結(jié)合，可以直接影響藥物在人體內(nèi)的擴(kuò)散[32]。本研究表明，環(huán)氧蟲啶在人體內(nèi)可能具有較強(qiáng)的擴(kuò)散能力。

HSA 含有3 個(gè)晶體結(jié)構(gòu)域[33]，每個(gè)結(jié)構(gòu)域都有A、B 兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)。大多數(shù)化學(xué)合成物與HSA結(jié)合在IIA 和IIIA 部位，其中IIIA 的活性最強(qiáng)[34]。本研究結(jié)果表明，HSA 與環(huán)氧蟲啶結(jié)合的主要能量貢獻(xiàn)殘基集中位于IIA 區(qū)域，不在活性最高的IIIA 區(qū)，這與華法林與HSA 的結(jié)合模式一致[35]。這可能是由于IIA 位于α-螺旋形成的通道底部，更有利于環(huán)氧蟲啶的結(jié)合與釋放，也表明HSA 與外源小分子的結(jié)合模式可能是多因素共同作用的結(jié)果。

Moreira 等[36]將突變體掃描中氨基酸ΔΔG能量的不同分為：“hot spots (熱點(diǎn))”“warm spots (暖點(diǎn))”和“null spots (非點(diǎn))”。本研究中，Gln459為近似暖點(diǎn)，是環(huán)氧蟲啶與HSA 結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸，對(duì)環(huán)氧蟲啶在人體內(nèi)的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解過程中起重要作用。本研究為環(huán)氧蟲啶在人體內(nèi)的運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)理提供了一定的依據(jù)，也可為開發(fā)新型更加環(huán)保、低毒的殺蟲劑提供借鑒。