范敏娜,李明

新生兒缺血缺氧性腦病(HIE)是圍產(chǎn)期因窒息導(dǎo)致的腦缺血缺氧引發(fā)腦組織受損的疾病,嚴(yán)重威脅生命,且存活者遺留后遺癥[1-2]。血-腦屏障是血液與腦組織間的屏障,可阻礙有害物質(zhì)自血液流向大腦損傷腦組織,缺血缺氧的強刺激可改變血-腦屏障通透性致其受損,引起繼發(fā)性神經(jīng)元損傷[3-4]。血-腦屏障受損是HIE發(fā)病及導(dǎo)致不良預(yù)后的重要機制,因此改善血-腦屏障損傷、控制腦水腫對HIE的治療有幫助。LncRNA MEG3是缺血缺氧性腦損傷(HIBD)的靶點[5],可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能與血管生長[6]。miR-17-5p在抑制HIBD新生大鼠炎性激活中發(fā)揮作用[7],且與miR-17-5p存在靶向關(guān)系[8]。本研究通過構(gòu)建HIBD新生小鼠模擬HIE,探究LncRNA MEG3調(diào)控miR-17-5p對HIBD新生小鼠血-腦屏障的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 7日齡C57BL小鼠(SPF級)90只,購自廣東維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(粵)2022-0063],雌雄各半,質(zhì)量4.5～4.8 g,由體格健壯的母鼠喂養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 si-NC、si-LncRNA MEG3、anti-miR-NC、anti-miR-17-5p購自上海生工;EB(R20616)購自上海源葉生物科技有限公司;總RNA抽提試劑盒(12183016)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(4366597)、總蛋白提取試劑盒(89842)購自賽默飛世爾科技公司;ZO-1(ab190085)、Occludin(ab216327)、GAPDH(ab9485)兔抗以及HPR標(biāo)記的羊抗兔(ab6721)購自美國abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模及干預(yù)方法 按照隨機數(shù)字表法將小鼠分為對照組、模型組、si-NC組、si-LncRNA MEG3組、si-LncRNA MEG3+anti-miR-NC組、si-LncRNA MEG3+anti-miR-17-5p組,每組15只。除對照組外,其余各組小鼠均按照文獻(xiàn)[9]方法構(gòu)建HIBD模型。乙醚吸入麻醉后讓小鼠仰臥于手術(shù)板上,碘伏局部消毒后在頸部正中切口,分離皮下組織,結(jié)扎右側(cè)頸總動脈,逐層縫合皮膚,送回母籠恢復(fù)。2 h后將其放入包含8%氧氣+92%氮氣混合氣體的密閉缺氧箱中缺氧處理2 h,完成造模。造模結(jié)束使用Longa評分進(jìn)行神經(jīng)行為缺損評分,評分為2～3分即為造模成功[10]。造模成功后,si-NC組、si-LncRNA MEG3組分別腦內(nèi)注射5 μL si-NC及si-LncRNA MEG3,si-LncRNA MEG3+anti-miR-NC組、si-LncRNA MEG3+anti-miR-17-5p組除注射si-LncRNA MEG3外注射5 μL anti-miR-NC與anti-miR-17-5p,注射完畢退針。

1.2.2 神經(jīng)功能評分 各組小鼠處理完畢后均進(jìn)行Longa評分。0分:無神經(jīng)功能損傷;1分:小鼠不能完全的伸直前肢;2分:小鼠一側(cè)癱瘓,存在追尾現(xiàn)象;3分:小鼠不能打滾及站立;4分:小鼠無法進(jìn)行自發(fā)性活動,存在意識障礙。

1.2.3 血-腦屏障通透性測定 各組小鼠造模后按照1.2.1的分組方法處理24 h,然后每組挑選5只小鼠通過尾靜脈注射2% EB(2 mL/kg),循環(huán)1 h后,生理鹽水灌流,斷頭取缺血側(cè)腦組織,于冰上分離,稱量濕重,加入5 mL甲酰胺,對腦組織進(jìn)行勻漿,水浴48 h,離心(4000 r/min、15 min)。分光光度計測定上清液吸光度值(630 nm處),計算腦組織中EB含量,設(shè)置3個重復(fù)。EB含量與血-腦屏障通透性呈正比。

1.2.4 腦含水量情況測定 各組小鼠造模后按照1.2.1的分組方法處理24 h,然后每組挑選5只小鼠,采用戊巴比妥鈉麻醉后斷頭取左側(cè)腦組織,稱量濕重,烘干后測干重。腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.2.5 LncRNA MEG3、miR-17-5p水平測定 每組選取剩余的5只小鼠分離血腫組織,平均分為3份。提取其中一份腦組織RNA,將一定量的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,通過實時熒光定量PCR法進(jìn)行擴增,程序設(shè)定為:95 ℃預(yù)熱5 s,95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s,以2-△△Ct方法分析LncRNA MEG3、miR-17-5p表達(dá)情況,其中LncRNA MEG3以GAPDH作為內(nèi)參,miR-17-5p以U6作為內(nèi)參,引物見表1。

表1 qRT-PCR引物

1.2.6 小鼠血-腦屏障結(jié)構(gòu)觀察 取1.2.5中腦組織一份,經(jīng)過固定(1%鋨酸)、脫水、包埋后切片(60 nm),進(jìn)行醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色,透射電鏡觀察腦組織切片超微結(jié)構(gòu)。

1.2.7 小鼠腦組織ZO-1、Occludin蛋白測定 取1.2.5中腦組織一份并裂解,離心后得上清,總蛋白經(jīng)蛋白提取試劑盒提取,定量蛋白(BCA試劑盒),經(jīng)SDS-PAGE電泳后將目的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜,封閉,添加ZO-1、Occludin、GAPDH一抗(稀釋比均為1∶1000),孵育過夜后添加二抗,孵育1 h,ECL試劑進(jìn)行顯色后經(jīng)凝膠成像儀曝光、觀察,Image-J軟件分析ZO-1、Occludin蛋白灰度值,并計算其含量。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠神經(jīng)功能缺損評分的比較 與對照組(0分)相比,模型組[(2.60±0.32)分]小鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著升高(P<0.05)。與模型組相比,si-NC組[(2.57±0.28)分]小鼠神經(jīng)功能缺損評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),si-LncRNA MEG3組[(1.40±0.15)分]小鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著降低(P<0.05)。與si-LncRNA MEG3組相比,si-LncRNA MEG3+anti-miR-NC組[(1.42±0.17)分]小鼠神經(jīng)功能缺損評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),si-LncRNA MEG3+anti-miR-17-5p組[(1.94±0.21)分]小鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著升高(P<0.05)。

2.2 各組小鼠腦含水量的比較 與對照組[(62.10±2.15)%]相比,模型組[(85.23±2.25)%]小鼠腦含水量顯著升高(P<0.05)。與模型組相比,si-NC組[(83.57±2.26)%]小鼠腦含水量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),si-LncRNA MEG3組[(72.79±2.04)%]小鼠腦含水量顯著降低(P<0.05)。與si-LncRNA MEG3組相比,si-LncRNA MEG3+anti-miR-NC組[(73.75±2.06)%]小鼠腦含水量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),si-LncRNA MEG3+anti-miR-17-5p組[(78.58±2.19)%]小鼠腦含水量顯著升高(P<0.05)。

2.3 各組小鼠血-腦屏障血管內(nèi)皮細(xì)胞情況 見圖1。對照組小鼠血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)完整、薄厚均勻、無明顯水腫、內(nèi)皮細(xì)胞連接緊密,吞飲小泡數(shù)量少。模型組小鼠血管內(nèi)皮薄厚不均多處呈現(xiàn)水腫狀態(tài)、內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)性消失、吞飲小泡數(shù)量增多。與模型組相比,si-LncRNA MEG3組血管內(nèi)皮細(xì)胞逐漸連接緊密、薄厚較為均勻,水腫減少;與si-LncRNA MEG3組相比,si-LncRNA MEG3+anti-miR-17-5p組血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷加重。

圖1 各組小鼠血-腦屏障血管內(nèi)皮細(xì)胞電鏡圖(×15000)

2.4 各組小鼠血-腦屏障通透性比較 與對照組[(8.72±1.06)μg/g]相比,模型組[(31.75±4.69)μg/g]小鼠EB含量升高(P<0.05)。與模型組相比,si-NC組[(32.16±4.52)μg/g]小鼠EB含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),si-LncRNA MEG3組[(14.35±2.71)μg/g]小鼠EB含量降低(P<0.05)。與si-LncRNA MEG3組相比,si-LncRNA MEG3+anti-miR-NC組[(14.62±2.69)μg/g]小鼠EB含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),si-LncRNA MEG3+anti-miR-17-5p組[(21.37±3.58)μg/g]EB含量升高(P<0.05)。

2.5 各組小鼠miR-17-5p、LncRNA MEG3表達(dá)情況的比較 見表2。與對照組相比,模型組小鼠LncRNA MEG3水平顯著升高,miR-17-5p顯著降低(均P<0.05)。與模型組相比,si-NC組小鼠LncRNA MEG3、miR-17-5p水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05),si-LncRNA MEG3組小鼠LncRNA MEG3水平顯著降低,miR-17-5p水平顯著升高(均P<0.05)。與si-LncRNA MEG3組相比,si-LncRNA MEG3+anti-miR-NC組小鼠LncRNA MEG3、miR-17-5p水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05),si-LncRNA MEG3+anti-miR-17-5p組miR-17-5p水平顯著降低(P<0.05)。

表2 各組小鼠LncRNA MEG3、miR-17-5p水平的比較(n=5)

2.6 各組小鼠ZO-1、Occludin蛋白水平的比較 見圖2、表3。與對照組相比,模型組小鼠ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)顯著降低(均P<0.05)。與模型組相比,si-NC組小鼠ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05),si-LncRNA MEG3組小鼠ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)顯著升高(均P<0.05)。與si-LncRNA MEG3組相比,si-LncRNA MEG3+anti-miR-NC組小鼠ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05),si-LncRNA MEG3+anti-miR-17-5p組ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)顯著降低(均P<0.05)。

圖2 各組小鼠ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)A:對照組;B:模型組;C:si-NC組;D:si-LncRNA MEG3組;E:si-LncRNA MEG3+anti-miR-NC組;F:si-LncRNA MEG3+anti-miR-17-5p組。

表3 各組小鼠腦組織ZO-1、Occludin蛋白水平的比較(n=5)

3 討 論

新生兒HIE是圍生期窒息引發(fā)的腦部缺血缺氧導(dǎo)致腦組織受損的疾病,對患兒的生存以及日后生活質(zhì)量均有負(fù)面影響[11]。血-腦屏障是遍布于腦組織周圍的腦毛細(xì)血管壁構(gòu)成的脈絡(luò)叢屏障,可以有效隔開血漿與CSF,阻礙血液中的一些有害物質(zhì)進(jìn)入,在維護(hù)CNS的生理功能方面發(fā)揮重要作用[12]。缺血缺氧造成的刺激會引起血-腦屏障結(jié)構(gòu)的損害,為繼發(fā)性腦損傷提供條件。

本研究通過構(gòu)建新生小鼠HIBD模型進(jìn)行血-腦屏障影響相關(guān)機制的研究,所構(gòu)建模型腦組織含水量升高,出現(xiàn)神經(jīng)受損癥狀,提示新生小鼠造模成功,有神經(jīng)受損、氧化應(yīng)激損傷癥狀。LncRNA在大腦中特異性表達(dá),并參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病。大量研究[13-14]顯示,LncRNA在HIBD模型中表達(dá)異常。LncRNAMEG3是一種抑癌基因,在腦損傷相關(guān)疾病中發(fā)揮一定作用。LncRNA MEG3在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中異常表達(dá),如MEG3-miR-455-pI3K軸在大腦中動脈閉塞小鼠腦梗死缺氧神經(jīng)干細(xì)胞損傷模型的氧化應(yīng)激、增殖、凋亡中發(fā)揮作用[15];下調(diào)MEG3可減少中腦動脈閉塞/再灌注模型小鼠腦梗死面積[16];MEG3可調(diào)控腦卒中后血管新生的功能[17];下調(diào)MEG3可減輕過氧化氫誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷[18]。本研究中模型組小鼠MEG3水平升高,此時小鼠神經(jīng)功能損傷評分升高,腦含水量升高,血-腦屏障通透性升高,ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)降低,提示MEG3改變可能與HIBD小鼠的發(fā)病有關(guān),MEG3變化可能與血-腦屏障完整性有關(guān)。Occludin是體內(nèi)血-腦屏障功能完整性的關(guān)鍵跨膜調(diào)節(jié)劑。ZO-1是一種膜相關(guān)鳥苷酸激酶樣蛋白,將跨膜緊密連接蛋白連接到肌動蛋白細(xì)胞骨架上。ZO-1與結(jié)復(fù)合體的分離導(dǎo)致血-腦屏障通透性增加[19]。血-腦屏障破壞與這些緊密連接蛋白和血-腦屏障轉(zhuǎn)運蛋白的異常表達(dá)有關(guān)[20]。ZO-1、Occludin表達(dá)的下降導(dǎo)致血-腦屏障完整性受損[21],與本研究一致。當(dāng)沉默MEG3表達(dá)后,小鼠神經(jīng)功能損傷評分降低,血-腦屏障通透性降低,ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)升高,提示MEG3沉默可能通過調(diào)節(jié)ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)恢復(fù)血-腦屏障的阻滯作用,保護(hù)HIBD小鼠免受有害物質(zhì)的侵襲。

miRNA被認(rèn)為是HIBD發(fā)病機制中的關(guān)鍵介質(zhì)。LncRNA通常通過海綿化miRNA調(diào)控相關(guān)靶基因發(fā)揮作用,在HIBD期間,miRNA表達(dá)發(fā)生顯著變化。miR-17-5p可保護(hù)新生小鼠免受HIBD[22]。Chen等[7]研究顯示,miR-17-5p在抑制HIBD新生大鼠炎性激活中發(fā)揮作用。本研究中,HIBD模型小鼠miR-17-5p水平降低,提示其在HIBD中發(fā)揮作用。研究[8]顯示,miR-17-5p是MEG3的靶標(biāo)。MEG3沉默可能通過海綿化miR-17-5p降低血-腦屏障通透性。進(jìn)一步研究表明,在MEG3沉默基礎(chǔ)上抑制miR-17-5p表達(dá)后,MEG3的沉默不能顯著減輕HIBD小鼠的神經(jīng)損傷、腦水腫以及血-腦屏障通透性。MEG3沉默可能通過上調(diào)miR-17-5p發(fā)揮對HIBD小鼠的神經(jīng)保護(hù)以及血-腦屏障保護(hù)作用。

綜上所述,LncRNA MEG3沉默可能通過上調(diào)miR-17-5p,降低HIBD新生小鼠血-腦屏障通透性,維持血-腦屏障對大腦的保護(hù)作用,保護(hù)腦組織。下一步將開展細(xì)胞實驗進(jìn)行進(jìn)一步驗證。

作者貢獻(xiàn)說明范敏娜指導(dǎo)選題、設(shè)計研究,指導(dǎo)起草、修改文章,提供技術(shù)材料;李明提出選題,設(shè)計、實施研究,采集、分析、解釋數(shù)據(jù),撰寫、修改文章