陳進(jìn)銀 張莉 郭秀娜

摘要 植物病原真菌在侵染植物的過程中會(huì)分泌細(xì)胞壁降解酶來破壞植物細(xì)胞壁，以達(dá)到成功入侵寄主的目的。研究表明，病原菌分泌的細(xì)胞壁降解酶中的纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶、幾丁質(zhì)酶、酯酶均參與了植物細(xì)胞壁的降解和病原菌致病的過程，但是對(duì)于細(xì)胞壁降解酶中的裂解多糖單加氧酶在病原菌侵染植物過程中的功能研究較少。根據(jù)近年來輔助活性酶類以及屬于輔助活性酶類中的裂解多糖單加氧酶的研究進(jìn)展，綜述了輔助活性酶的分布、種類、功能以及裂解多糖單加氧酶植物病害中的作用研究，旨在為輔助活性酶類在植物病害中的功能研究和病害防控提供參考和依據(jù)。

關(guān)鍵詞 裂解多糖單加氧酶；細(xì)胞壁降解酶；輔助活性酶；真菌病害

中圖分類號(hào) Q945.8? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2024）03-0011-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.03.003

Research Progress of Lytic Polysaccharide Monooxygenase in Plant Diseases

Abstract During the process of infecting plants，phytopathogenic fungi secrete cell wall degrading enzymes to destroy plant cell walls in order to successfully invade the host.Studies have shown that cellulase，pectinase，xylanase，chitinase，and esterase in the cell wall degrading enzymes secreted by pathogenic bacteria are involved in the process of plant cell wall degradation and pathogenic bacteria.However，there is relatively little research on the function of the lytic polysaccharide monooxygenase in the cell wall degrading enzymes in the process of pathogen invasion of plants.Based on the recent research progress of auxiliary active enzymes and cleavage polysaccharide monooxygenases belonging to the auxiliary active enzymes，this article summarizes the distribution，types，functions of auxiliary active enzymes and the role of cleavage polysaccharide monooxygenases in plant diseases.The research aims to provide reference and basis for the function research and disease prevention and control of auxiliary active enzymes in plant diseases.

Key words Lytic polysaccharide monooxygenase;Cell wall degrading enzyme;Auxiliary active enzyme;Fungal disease

植物在正常生長發(fā)育過程中會(huì)遇到各種各樣的不利因素，如極端天氣、干旱、澇害、植物病害等，最終影響植物的產(chǎn)量和質(zhì)量，其中在生物因素中病原菌對(duì)植物生長發(fā)育影響較大。植物與病原真菌為了各自的生存，在數(shù)千年的相互對(duì)抗中進(jìn)化出了各種抵抗和入侵對(duì)方的策略。植物對(duì)抗病原菌的第一道屏障是植物細(xì)胞壁，主要由多糖物質(zhì)中的纖維素和果膠組成，而病原菌為了成功入侵寄主植物獲取自身所需營養(yǎng)，進(jìn)化出了一系列策略來破壞植物細(xì)胞壁，其中病原菌分泌細(xì)胞壁降解酶來降解植物細(xì)胞壁是最主要的一個(gè)策略。研究發(fā)現(xiàn)，碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫（carbohydrate-active enzymes database，CAZy，www.cazy.org）中的糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GHs）、多糖裂解酶（polysaccharide lyases，PLs）、碳水化合物酯酶（carbohydrate esterases，CEs）中的成員均參與了植物細(xì)胞壁的降解過程和病原菌的致病過程［1-6］。而CAZy中還有一類主要的酶類——輔助活性酶（auxiliary activities，AAs），其可以氧化裂解頑固多糖，但是對(duì)于其在病原菌致病過程中的功能研究較少。

目前，輔助活性酶類主要分為木質(zhì)素分解酶家族和裂解多糖單加氧酶家族（lytic polysaccharide mono-oxygenases，LPMO），其中在病原菌致病過程中僅有LPMO的研究成果。LPMO是一種銅離子依賴的氧化酶，其可以通過氧化和裂解的方式解聚頑固多糖中的糖苷鍵，對(duì)生物質(zhì)轉(zhuǎn)化具有積極意義。

1 輔助活性酶的研究進(jìn)展

AAs原來歸類于糖苷水解酶（61家族糖苷水解酶——GH61和33家族碳水化合物結(jié)合模塊——CBM33），但是研究發(fā)現(xiàn)其并不能通過水解的方式降解纖維素，而是通過氧化的方式裂解纖維素形成纖維寡糖，后來將其重新劃分歸類于輔助活性酶家族［7］。

AAs本身不具有纖維素水解酶的活性，但是近年來由于其可以顯著提高纖維素水解酶的活性而備受關(guān)注［8-9］。AAs在核酸序列和蛋白結(jié)構(gòu)上具有特殊性，AAs各家族成員的核酸序列保守性相對(duì)較低，但是其蛋白結(jié)構(gòu)中的酶活性中心相對(duì)保守，一般都2個(gè)組氨酸和1個(gè)酪氨酸形成的三N配體“組氨酸支架”和1個(gè)二價(jià)金屬離子構(gòu)成，并且其中1個(gè)組氨酸必須為成熟蛋白N端的第1個(gè)氨基酸，這對(duì)于AAs的酶活性是必須的［10-12］。

目前對(duì)于AAs的研究主要集中于蛋白結(jié)構(gòu)、底物的種類、電子供體、氧化方式、共底物、酶動(dòng)力學(xué)等方面（圖1）［13-19］。圖1A為 LPMO的基本結(jié)構(gòu)信息和反應(yīng)機(jī)理，來自解淀粉芽孢桿菌的 AA10 LPMO BaAA10 的蛋白結(jié)構(gòu)，其中活性位點(diǎn)銅顯示為球體，活性位點(diǎn)殘基顯示為棒狀； 圖1B為在AA9和AA10結(jié)構(gòu)中觀察到的銅活性位點(diǎn)示意； 圖1C為 LPMO 反應(yīng)機(jī)理，箭頭上方指示的 Cu（II）/Cu（I）是指活性位點(diǎn)中的銅離子及其在催化循環(huán)開始之前的氧化態(tài)［20］ 。

2 真菌中輔助活性酶的分布、種類和功能

2.1 種類與功能

在CAZy數(shù)據(jù)庫中將AAs分成了17個(gè)家族，AA1～AA17。AAs類目前分為9個(gè)木質(zhì)素分解酶家族（AA1～AA8、AA12）和8個(gè)裂解多糖單加氧酶家族（AA9～AA11、AA13～AA17）。木質(zhì)素分解酶可能不作用于碳水化合物，但是由于木質(zhì)素與植物細(xì)胞壁中的碳水化合物密切相關(guān)，而且木質(zhì)素分解酶確實(shí)與經(jīng)典的多糖解聚酶共同作用，所以CAZy 數(shù)據(jù)庫根據(jù)氨基酸序列的相似性對(duì)木質(zhì)素分解酶家族在家族和亞家族中進(jìn)行了分類，意圖反映蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征并促進(jìn)基因組注釋。目前對(duì)于LPMO的研究比較深入。LPMO可以氧化裂解糖苷鍵形成寡糖，但主要作用底物以及氧化切割底物的方式有所不同。AA9家族成員可以通過碳C1和/或C4和C6的氧化方式裂解纖維素鏈形成纖維寡糖；AA10家族成員可以通過碳C1和/或C4氧化裂解幾丁質(zhì)；AA11家族成員可以通過碳C1氧化裂解幾丁質(zhì)；AA13家族成員可以通過碳C1氧化裂解淀粉；AA14家族成員可以通過碳C1氧化裂解木聚糖；AA15家族成員可以通過碳C1和/或C4氧化裂解纖維素和幾丁質(zhì)；AA15家族成員可以通過碳C1氧化裂解纖維素；AA17家族成員可以通過碳C4氧化裂解同型半乳糖醛酸。

2.2 分布

AAs家族成員在可以降解纖維素的真菌與細(xì)菌的降解酶系統(tǒng)以及病毒中廣泛存在［21-23］。其中，真菌中的AAs主要存在于擔(dān)子菌門和子囊菌門中［24-26］。此外不同營養(yǎng)類型的植物病原真菌所擁有的數(shù)目也差異巨大，例如，活體營養(yǎng)型病原物小麥白粉菌Blumeria graminis的基因組［27］中AA9家族基因的數(shù)量明顯少于其他真菌，其中包含1個(gè)AA9家族基因［28］；死體營養(yǎng)型植物病原真菌如葡萄孢屬Botrytis cinerea有10個(gè)AA9家族基因，立枯絲核菌Rhizoctonia solani有34個(gè)AA9家族基因。現(xiàn)在，大量來源于致病菌的PMO基因已被編入CAZy數(shù)據(jù)庫（表1）和NCBI（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中，但是其功能大部分都未被鑒定。表1以AAs中第9家族（AA9）成員為例，展示部分植物病原菌中AA9家族基因的數(shù)量。

2.3 AA9 家族 LPMO 的底物特異性

AAs類可以解聚頑固多糖，目前不同AA家族成員已被證明具有多種底物活性，包括氧化裂解結(jié)晶纖維素、半纖維素、幾丁質(zhì)、木聚糖、木葡聚糖、淀粉等［13，18，29］。目前病原真菌中的多個(gè)LPMO也被證明有多重底物活性（表2），然而這些成分同時(shí)也是植物細(xì)胞壁的組成成分。這些結(jié)果暗示在病原菌侵染植物寄生的過程中LPMO是不可或缺的，其可以破壞植物細(xì)胞壁而幫助病原菌的成功入侵。

3 裂解多糖單加氧酶在病原菌與植物互作過程中的功能研究

LPMO最先在真菌和卵菌中被發(fā)現(xiàn)，其中，AA9是迄今為止數(shù)量最多的LPMO家族［34］。在尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）侵染豆科植物根部時(shí)，幾個(gè)編碼AA9的基因均上調(diào)表達(dá)［35］，同樣葡萄孢屬真菌侵染葡萄果實(shí)過程中，編碼AA9的相關(guān)基因（BC1G_07653andBC1G_07658）也明顯上調(diào)［36］，這說明AA9編碼基因可以在侵染植物時(shí)于多個(gè)組織和器官中發(fā)揮作用。

稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）附著胞成功定植的關(guān)鍵因素之一是其對(duì)表面信號(hào)的響應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，稻瘟病菌中的Aa91（MoAa91）是輔助活性酶第9家族的一個(gè)裂解多糖單加氧酶，MoAa91是一種受RGS和RGS樣蛋白調(diào)控的新型信號(hào)分子。MoAa91可以與植物體內(nèi)的免疫受體幾丁質(zhì)誘導(dǎo)結(jié)合蛋白前體（CEBiP）競爭幾丁質(zhì)結(jié)合，進(jìn)而抑制由幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的植物免疫應(yīng)答進(jìn)程，并且發(fā)現(xiàn)MoAA91受轉(zhuǎn)錄因子MoMsn2的調(diào)控，其破壞可以導(dǎo)致人工誘導(dǎo)表面附著胞的形成缺陷和病原菌的完全毒力缺陷［37］。

AA9 家族的 LPMO 在生物界廣泛保守，被植物病原體部署以裂解纖維素聚合物。作為回應(yīng)，植物進(jìn)化出復(fù)雜的機(jī)制來感知細(xì)胞壁損傷，從而自我觸發(fā)損傷觸發(fā)免疫反應(yīng)。非致病性病原真菌嗜熱硫桿菌（Thermothielavioides terrestris）LPMO家族的TtAA9E降解纖維素產(chǎn)生的C1和C4氧化產(chǎn)物AA9_COS在擬南芥遭受死體營養(yǎng)型病原真菌灰霉病菌（Botrytis cinerea）侵染時(shí)可以作為DAMP（Damage-associated molecular pattern）保護(hù)植物免受侵染，造成胼胝質(zhì)積累、病斑大小減小以及植物激素水平提高，引起擬南芥體內(nèi)轉(zhuǎn)錄重編輯，最終導(dǎo)致對(duì)壞死性真菌灰葡萄孢的抵抗力增加，表明 LPMO 可能在植物病原體相互作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用［38］。

ROS迸發(fā)是植物為抵御病原菌侵染時(shí)的一個(gè)重要防御反應(yīng)［39］。研究證明，H2O2可以驅(qū)動(dòng)LPMO的催化反應(yīng)，可以推測病原菌侵染植物過程中能夠利用寄主植物產(chǎn)生的H2O2激活LPMOs，從而起到致病作用［15，40］。在油菜黑脛病菌（Leptosphaeria maculans）侵染十字花科植物時(shí)，可以分泌LmCBP1，該酶含有小部分AA10結(jié)構(gòu)域，且具有較高的表達(dá)水平［41］。研究證明，LmCBP1屬于AA16家族且具有幾丁質(zhì)酶活性，將黑脛病菌體內(nèi)LmCBP1敲除后致病力下降，且對(duì)H2O2更加敏感，這證明LmCBP1可作為致病因子在病菌侵染植物過程中起作用［42］。

瓜類白粉病病原菌蒼耳足霉（Podosphaera xanthii）是葫蘆科白粉病的主要病原體，也是作物生產(chǎn)力的限制因素。這種真菌的生活方式取決于表皮細(xì)胞內(nèi)特殊寄生結(jié)構(gòu)的發(fā)展，稱為吸器，負(fù)責(zé)獲取營養(yǎng)物和釋放效應(yīng)物。研究發(fā)現(xiàn)，Podosphaera xanthii 中的PHEC27213基因是 P.xanthii 表達(dá)量最高的吸器特異性候選效應(yīng)物，PHEC27213的蛋白質(zhì)折疊與裂解多糖單加氧酶（LPMOs）的蛋白質(zhì)折疊相似，并包括一個(gè)保守的組氨酸支架，結(jié)合和酶促測定表明 PHEC27213 能夠結(jié)合和催化膠體幾丁質(zhì)以及殼寡糖，確定其是一種新的真菌 LPMO。RNAi 沉默試驗(yàn)表明，該蛋白質(zhì)具有阻止幾丁質(zhì)觸發(fā)免疫激活的潛力。此外，在其他形成吸器的真菌病原體中也發(fā)現(xiàn)了具有相似特征的蛋白質(zhì)［32］。

卵菌（Phytophthora infestans）是一種破壞性的作物病原體，也是研究植物與病原體相互作用的模式生物。研究發(fā)現(xiàn)，在卵菌中幾乎不存在AA9基因，但是存在AA16和AA17家族基因［33］，在6種重要疫霉菌（Phytophthora infestans、Phytophthora ramorum、Phytophthora capsici、Phytophthora cinnamomi、Phytophthora parasitica、Phytophthora sojae）基因組中都含有AA16的編碼序列，表明其在卵菌致病過程中可能發(fā)揮著重要作用［43］。在卵菌中存在另一種LPMO與其致病性相關(guān)，植物病原性卵菌中銅依賴性裂解多糖單加氧酶編碼基因PiAA17C，PiAA17C主要對(duì)均半乳糖醛酸進(jìn)行碳-C4特異性氧化，由此產(chǎn)生的C4氧化的低聚半乳糖醛酸不被C4作用的外聚半乳糖醛酸酶所接觸。PiAA17C在病原菌感染植物早期上調(diào)，并且分泌的酶氧化裂解組成植物細(xì)胞壁的果膠骨架。通過瞬時(shí)基因沉默試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PiAA17C沉默后的馬鈴薯晚疫病菌的致病能力顯著降低，證明了PiAA17C是致病疫霉侵染植物所必需的毒力因子［33］。

溶桿菌產(chǎn)酶菌（Lysobacter enzymogenes）是一種能夠產(chǎn)生抗病原真菌活性代謝物的生防細(xì)菌，其產(chǎn)生的LeLPMO10A屬于AA10，能降解幾丁質(zhì)，可以誘導(dǎo)抗菌化合物產(chǎn)生，被稱為耐熱抗真菌因子（heat stable antifungal factor，HSAF）［44］。

除了在致病中的作用，LPMO在寄主與病菌共生過程中也發(fā)揮了不可或缺的作用，共生菌Laccaria bicolor在楊樹上寄生過程中，編碼AA9的3個(gè)LPMOs基因均上調(diào)表達(dá)，與GH5和GH12內(nèi)切葡聚糖酶通過協(xié)同作用改變楊樹細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)自身的定殖［45］。X325，一種與LPMO結(jié)構(gòu)上類似的同源蛋白定位在菌絲體與植物細(xì)胞壁的交界處［46］，通過轉(zhuǎn)運(yùn)Cu離子維持真菌與植物之間的共生關(guān)系，避免金屬離子過度轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)植物造成傷害，表明LPMOs在建立真菌與植物安全共生界面中的重要作用［47-48］。另外，在云杉藍(lán)樹蜂（Sirex noctilio）寄生北美松樹時(shí)，會(huì)與一種鏈霉菌屬的細(xì)菌共生，為云杉藍(lán)樹峰提供纖維素等營養(yǎng)物質(zhì)［49］，而細(xì)菌自身也會(huì)分泌一種屬于AA10的LPMO（CBM33），促進(jìn)降解纖維素和半纖維素［50］。除此之外，天牛（Lyrodus pedicellatus）能夠與細(xì)菌（Teredinibacter turnerae）在寄主上共生，該細(xì)菌同樣能夠產(chǎn)生AA10，對(duì)纖維素具有活性，為天牛的生長提供營養(yǎng)物質(zhì)［51］。

這些研究表明，LPMO在病原菌侵染寄主植物的過程中不僅可以氧化裂解細(xì)胞壁中的頑固多糖破壞植物細(xì)胞壁，還可以作為效應(yīng)因子參與植物的致病過程或/和免疫反應(yīng)，除此之外，也可以作為協(xié)調(diào)因子促進(jìn)不同物種互利共生。

4 展望

4.1 輔助活性酶類在生物質(zhì)降解方面 能源物質(zhì)短缺已成為人類所必須面臨的一個(gè)問題，不可再生能源儲(chǔ)量是有限的，發(fā)展利用可再生能源是解決能源短缺的有限途徑之一。中國作為農(nóng)業(yè)大國，擁有豐富的木質(zhì)纖維素，而木質(zhì)纖維素為代表的可再生生物質(zhì)能源被認(rèn)為是世界第四大能源，將這部分生物質(zhì)加以高效利用可有效緩解我國的能源短缺問題。病原真菌中的輔助活性酶類不同家族成員具有多種底物活性，可以結(jié)合糖苷水解酶類等將生物質(zhì)降解為可高效利用的單糖。如何提高輔助活性酶類的活性以及和別的酶類的復(fù)配可能是新的研究趨勢。

4.2 LPMO在植物病害中的功能發(fā)掘 LPMO作為輔助活性酶類中的主要類別，其家族成員眾多，隨著基因挖掘，可能越來越多的家族和成員將會(huì)加入LPMO的大家族。從植物防御角度看，了解LPMO的調(diào)控元件、轉(zhuǎn)錄因子以及基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)于研究植物免疫至關(guān)重要。病原菌中存在大量的LPMO基因，從病原菌致病角度看，其作為細(xì)胞壁降解酶中的成員之一，它在病原菌致病過程中的功能、作用方式是單純的降解多糖破壞植物細(xì)胞壁還是作為效應(yīng)因子……這些都需要對(duì)LPMO的更多科學(xué)研究來闡釋。深度挖掘病原菌中LPMO基因的生物學(xué)功能，對(duì)于解析病原菌致病過程機(jī)理及其新型殺菌劑的開發(fā)具有重要的意義。

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