王新惠，何 峰，李瑞麗，王翰書，梁 淼，張逸寒，潘文亮,，張峻松,

（1.鄭州輕工業(yè)大學食品與生物工程學院，河南 鄭州 450000；2.河北中煙工業(yè)有限責任公司技術(shù)中心，河北 石家莊 050051）

無花果為?？崎艑僦参铮缓鞍踪|(zhì)、多酚、維生素、膳食纖維等，不僅營養(yǎng)豐富、味道甘甜，同時具有潤肺、改善脾胃、治療咽喉腫痛等藥用價值，是優(yōu)質(zhì)的食療保健性水果[1-2]。作為一種香味原料，無花果常以浸膏、精油、酊劑等形式存在于食品、日化等領(lǐng)域。目前國內(nèi)外有關(guān)無花果的研究主要集中在有效成分提取工藝的優(yōu)化[3-5]、揮發(fā)性成分的提取分析方法及應用[6-8]、相關(guān)制品感官品質(zhì)的影響因素等方面[9-11]。如研究人員利用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)鑒定無花果超臨界提取物中的19 種化合物，發(fā)現(xiàn)主要成分有長鏈有機酸、香豆素和苯丙烷類化合物[7]。鄧星星等[11]采用GC-MS、電子鼻及感官評價，檢測出無花果及其果酒的揮發(fā)性成分分別為28 種和21 種，共有成分8 種，自制果酒不僅保留了無花果的揮發(fā)性成分，且有新的揮發(fā)性成分產(chǎn)生。

目前無花果的研究主要圍繞藥理、保鮮技術(shù)、成分分析等[12]，無花果提取物作為天然香原料，其組成成分較為復雜，關(guān)于無花果提取物香氣活性化合物鮮有報道。為鑒定特征香氣成分，氣相色譜-嗅聞（gas chromatography-olfactometry，GC-O）技術(shù)、香氣活性值（odour activity value，OAV）及香氣重組缺失等是找出關(guān)鍵特征風味成分的重要方法。如蔡莉莉等[13]以感官為導向，通過GC-MS分析確定了葫蘆巴內(nèi)酯和香蘭素為3 種市售楓槭浸膏烤甜香的關(guān)鍵致香成分。劉子豪等[14]利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）、GC-O等分析鑒定得知菇娘果特征香氣成分為2-甲基丁酸甲酯、甲硫基丙醛和己醛。李瑞麗等[15]通過HS-SPME-GC-MS分析香莢蘭提取物揮發(fā)性香氣成分，利用嗅覺閾值、OAV及香氣重組實驗明確了香蘭素、愈創(chuàng)木酚、乙酸等14 種化合物為香莢蘭特征風味物質(zhì)。因此，本研究通過HS-SPME-GCMS對無花果提取物進行成分分析，結(jié)合GC-O、OAV確定對無花果提取物具有重要貢獻的特征風味物質(zhì)，并通過香氣重組和缺失實驗明確無花果提取物關(guān)鍵特征風味物質(zhì)。旨在為無花果特征風味天然香原料的開發(fā)及質(zhì)量控制提供理論基礎，也為無花果相關(guān)產(chǎn)品的風味品質(zhì)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無花果購于云南昆明新泰商貿(mào)有限公司。

無水乙醇 天津市富宇精細化工有限公司；乙酸苯酯（98%）、乙酸（99.5%）、異丁酸（99%）、羥基丙酮（98%）、2,3-丁二醇（98%）、糠醛（99%）、糠醇（標準品）、2-乙酰基呋喃（98%）、5-甲基糠醛（99%）、苯甲醛（98%）、吡咯-2-甲醛（98%）、甲基環(huán)戊烯醇酮（99%）、苯甲醇（≥98%）、γ-己內(nèi)酯（98%）、4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮（98%）、芳樟醇（標準品）、反式-2-壬烯醛（97%）、2-乙?；量?8%）、2-丙酰呋喃（97%）、癸醛（標準品）、DL-蘋果酸二乙酯（98%）、5-羥甲基糠醛（98%）、香蘭素（99%）、香葉基丙酮（標準品）、鄰苯二甲酸二甲酯（98%）、二氫獼猴桃內(nèi)酯（標準品）、棕櫚酸乙酯（97%）、油酸乙酯（標準品）、正構(gòu)烷烴 北京百靈威科技有限公司；壬醛（96%）、2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮（95%）、亞麻酸乙酯（≥98%）上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

7890B-5977B GC-MS聯(lián)用儀（配有ODP-2嗅覺檢測器端口）美國Agilent公司；手動SPME進樣器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭 美國Supelco公司；PEN 3.5型便攜式電子鼻傳感器 德國Airsense公司；B13-3智能恒溫定時磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司；EL-204電子天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；HZ-2電熱恒溫水浴鍋 北京市醫(yī)療設備總廠；DLSB-10/25低溫冷卻液循環(huán)泵 鄭州凱鵬實驗儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；SHB-3循環(huán)水多用真空泵 鄭州杜甫儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 無花果提取物的制備

采用熱風干燥法制備無花果干，取無花果干果片為原料，打碎成粉，采用80%乙醇溶液以料液比為1∶5進行熱浸提，回流提取3 h后，減壓過濾除去濾渣，減壓旋蒸除去乙醇，得到無花果浸膏[16]。

1.3.2 HS-SPME前處理

參考黃貴元等[17]的方法，并稍作修改。將萃取頭在氣相色譜進樣口于250 ℃老化10 min。取0.5 g無花果提取物和1 μL 0.2 μg/μL的乙酸苯酯置于40 mL頂空瓶中，加蓋密封，60 ℃平衡30 min，然后在持續(xù)加熱和攪拌（200 r/min）條件下，插入萃取頭，吸附50 min后，立即取出萃取頭并插入GC進樣口，250 ℃解吸3 min。

1.3.3 GC-MS條件和GC-O分析

GC條件：HP-5MS色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；DB-WAX毛細管色譜柱（30 m×0.25 μm，0.25 μm）；載氣：He氣；恒流模式2.0 mL/min；升溫程序：50 ℃保持2 min，以5 ℃/min速率升至180 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min；不分流進樣；進樣口溫度250 ℃；傳輸線溫度280 ℃。

MS條件：離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；電離電壓：70 eV；傳輸線溫度：280 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z30～550[17]。

定性定量分析：根據(jù)NIST17質(zhì)譜庫檢索、標準品保留時間、保留指數(shù)、香氣描述對香氣化合物進行定性，采用內(nèi)標法建立各化合物的標準曲線，對OAV＞1的化合物進行定量分析[18]。

GC-O分析：采用檢測頻率（detection frequency，DF）法，由8 位實驗人員對經(jīng)色譜柱分離出的物質(zhì)進行嗅聞，統(tǒng)計每種物質(zhì)的出現(xiàn)頻率，記錄出現(xiàn)的次數(shù)，記為DF值，并篩選頻率大于50%的成分為關(guān)鍵風味物質(zhì)進行分析[19]。

1.3.4 OAV測定

OAV為各化合物在提取物中的質(zhì)量濃度與嗅覺閾值的比值；OAV＞1，表示該物質(zhì)對總體香氣有貢獻，一般來說，OAV越大表示該物質(zhì)對總體的香氣貢獻越大[20]。

1.3.5 無花果提取物及香氣重組樣品感官評價

經(jīng)DF法和OAV分析篩選出對無花果提取物整體風味有重要貢獻的物質(zhì)（OAV＞1），按其利用內(nèi)標標準曲線法在提取物中測定的實際濃度進行香氣重組。

參照GB/T 10220—2012《感官分析方法學總論》[21]，組織8 位專業(yè)人員組成感官評價小組（評價小組人員均具有良好的氣味感知能力和感官評價經(jīng)驗），對無花果提取物樣品及重組樣品的香氣輪廓進行定量描述性感官分析。實驗在25 ℃室溫條件下進行，依據(jù)評價標準（表1），對樣品進行香氣評價，采用十分制。結(jié)果取8 位感官評價員打分的平均值。

表1 嗅香評價標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of aromas

1.3.6 香氣缺失實驗

為深入評價OAV＞1香氣活性化合物的貢獻，參考文獻[22]進行香氣缺失實驗。缺失模型即從重組樣品中對其中一組化合物或單個化合物進行缺失，共設計16 個缺失模型。采用3 點檢驗[23]進行評價，為評價人員提供2 個重組模型和1 個缺失模型，所有的樣品隨機編碼，要求評價人員在每組樣品中選擇差異較大的樣品，確定缺失模型和重組模型之間差異的顯著性。

1.3.7 電子鼻分析條件

精確稱量0.1 g樣品，加入40 mL吹掃捕集瓶中，擰緊瓶蓋，于室溫放置20 min后開始用電子鼻檢測。傳感器清洗時間為120 s；歸零時間為5 s；樣品準備時間為5 s；樣品采集時間為60 s，載氣為潔凈空氣，載氣和樣品氣體流量均為400 mL/min，每個樣品重復測定3 次。PEN 3.5型電子鼻由10 個加熱型金屬氧化物傳感器陣列、氣體流量控制系統(tǒng)及分析控制軟件組成，10 根傳感器描述如表2所示[17]。

表2 PEN3.5 電子鼻傳感器敏感物質(zhì)Table 2 Performance description of PEN3.5 electronic nose sensors

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 HS-SPME-GC-MS結(jié)合GC-O鑒定無花果提取物特征風味物質(zhì)

利用HS-SPME-GC-MS分析無花果提取物，共鑒定出揮發(fā)性香氣成分40 種，主要包括酸類4 種、醇類3 種、酯類12 種、醛類7 種、酮類4 種、呋喃類8 種、其他類2 種。評價人員通過GC-O共感知到31 種，結(jié)果如表3所示。趙巨堂等[16]采用HS-SPME-GC-MS法對無花果浸膏進行香氣成分分析，發(fā)現(xiàn)其主要香氣成分有芳樟醇氧化物、糠醛、苯甲醇、高級脂肪酸等化合物，且含量較高，這可能是對無花果提取物特征風味有重要貢獻的香氣化合物。

酯類化合物是一類重要的香氣活性化合物，大多具有水果香氣，可賦予無花果提取物果香、花香和甜香。γ-內(nèi)酯類化合物是果香的重要香氣物質(zhì)[24]，廣泛存在于水果、葡萄酒、奶制品等多種食品[25-26]。其中γ-丁內(nèi)酯具有微弱的好聞的淡奶油芳香，γ-己內(nèi)酯具有椰香、甜香，一些高級脂肪酸乙酯，如棕櫚酸乙酯、亞麻酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯等，均具有微弱的脂香味和奶油香。其中，γ-己內(nèi)酯DF值最高（DF＝7），γ-丁內(nèi)酯（DF＝4）、棕櫚酸乙酯（DF＝5）具有較高的DF值，這些化合物對無花果提取物的整體香氣輪廓具有重要貢獻。

呋喃類是無花果提取物中另一類重要的香氣活性化合物，其種類和含量均較高。其中糠醛、5-甲基糠醛、5-羥甲基糠醛、2-乙?；秽?-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮的檢測頻率較高（DF≥4），且這些化合物均具有甜香、焦糖及焙烤特征香氣。有研究報道[27]，含糖豐富的食品在熱加工過程中會產(chǎn)生大量的糠醛和5-羥甲基糠醛、2-乙酰基呋喃、4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮等焦糖香物質(zhì)，表明焦糖香物質(zhì)的形成均與糖類物質(zhì)有關(guān)，無花果是一種含糖量豐富的果實，因此，在無花果提取物中檢測到這類物質(zhì)含量較多。

醛類化合物中苯甲醛（DF＝6）具有苦杏仁、堅果香，在香精香料中常用來配制花香香精；壬醛（DF＝4）具有油脂氣息，可為果汁等產(chǎn)品貢獻花香和果香；反式-2-壬烯醛（DF＝4）具有花香和果香；香蘭素（DF＝5）具有奶香、花香，共同構(gòu)成了無花果提取物豐富的果香、甜香、烘焙香等特征香氣[27]。酸類化合物主要呈酸香，其存在可以使風味更加飽滿，可為無花果提取物提供酸香香韻，如異丁酸（DF＝5）。

醇類是一類閾值較高的揮發(fā)性化合物，主要是多不飽和脂肪酸在一系列酶的作用下發(fā)生脂質(zhì)氧化的產(chǎn)物[28]。其中苯甲醇（DF＝5）具有微弱的芳香、花香和果香，芳樟醇的DF值最高（DF＝7），香氣較為復雜，兼有花香、果香和木香[29]，共同賦予了無花果提取物花香、果香氣息，對無花果提取物的整體香氣輪廓具有重要貢獻。

酮類化合物大多被認為呈脂香和焦香，且隨著碳鏈的增長呈現(xiàn)較強的花香氣息[30]，酮類物質(zhì)主要由脂肪氧化、酯類分解或糖類熱解反應形成[31]。如甲基環(huán)戊烯醇酮（DF＝6）具有焦糖、堅果香氣，為無花果提取物的特征風味做出重要貢獻。

2.2 無花果提取物特征風味物質(zhì)OAV分析結(jié)果

OAV是揮發(fā)性成分含量與其在食物中檢測閾值的比值，能夠反映某個香氣化合物對整體香氣的貢獻程度，OAV在0.1～1.0內(nèi)表明化合物具有修飾整體風味的作用，大于1.0表明該化合物是關(guān)鍵風味物質(zhì)，可影響樣品整體風味，且OAV越大表示對樣品的整體風味貢獻越大。由表4可知，鑒定出18 種香氣化合物的OAV大于1。組成無花果提取物的特征風味物質(zhì)中包括酯類8 種、醇類3 種、呋喃類8 種、醛類6 種、酮類3 種、酸類2 種、雜環(huán)類1 種。其中酯類、醇類、呋喃類的含量較高，分別占總量的20.94%、18.87%、44.87%。

內(nèi)酯類化合物對樣品整體風味的形成具有重要作用，如γ-己內(nèi)酯在芒果、杏、桃等多種水果的香氣中具有重要貢獻作用[32-36]；二氫獼猴桃內(nèi)酯具有甜香、果香氣息[37]；棕櫚酸乙酯具有奶油香；苯甲醇和芳樟醇具有果香和花香；5-羥甲基糠醛、甲基環(huán)戊烯醇酮和4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮具有焦糖香、烘烤香，這些物質(zhì)的OAV均大于100，表明這些物質(zhì)對無花果提取物的風味貢獻均較大。其次是苯甲醛、壬醛、香蘭素、糠醛、糠醇、2-乙?；秽?-甲基糠醛、二氫獼猴桃內(nèi)酯，這些物質(zhì)的OAV相對較大，同時對風味輪廓的形成起重要作用。其中，香蘭素的含量不高（20.31 mg/kg），但因其閾值低（0.578 mg/kg）而被鑒定為特征風味物質(zhì)，類似的物質(zhì)有壬醛。除此之外，部分化合物的含量較高，但由于閾值高得到的OAV小于1，如乙酸（900 mg/kg）、2-乙酰基吡咯（170 mg/kg）、2,3-丁二醇（1000 mg/kg），說明化合物的含量高低并不能代表對樣品整體風味的貢獻強弱，由此推測這些物質(zhì)對無花果提取物風味輪廓的形成影響較小。

2.3 香氣重組與缺失實驗

為進一步證實無花果提取物中的特征香氣化合物，將OAV＞1的18 種物質(zhì)進行香氣重組與缺失實驗。由圖1可知，重組樣品與無花果提取物香氣屬性相比較，果香、焦糖香、烘焙香等香韻較無花果提取物的得分稍高，重組樣品與無花果提取物的香氣輪廓相似，表明重組樣品成功地模擬了無花果提取物的整體風味特征。

圖1 重組樣品及無花果提取物的嗅香香氣輪廓圖Fig.1 Aroma profile of recombined samples and fig extract

為深入評價OAV＞1香氣活性化合物的貢獻，設計了16 個缺失模型，對其中一組化合物或單個化合物進行缺失。如表5所示，所有的評價人員能夠識別出缺乏所有酯類物質(zhì)的模型（模型1），且具有非常高的顯著性，說明酯類化合物表現(xiàn)出的果香、甜香在無花果提取物的整體特征風味中發(fā)揮了重要作用。除γ-丁內(nèi)酯、二氫獼猴桃內(nèi)酯外（OAV＞200）的所有酯（模型1-3）缺失時，與重組模型無顯著差異（P＞0.05），因此，說明γ-丁內(nèi)酯、二氫獼猴桃內(nèi)酯對整體風味作用不明顯。進一步對γ-己內(nèi)酯（模型1-1）、棕櫚酸乙酯（模型1-2）分別建立缺失模型，發(fā)現(xiàn)γ-己內(nèi)酯的缺失與重組模型具有極顯著差異（P＜0.01），棕櫚酸乙酯缺失時與重組模型相比具有顯著差異（P＜0.05），說明γ-己內(nèi)酯和棕櫚酸乙酯對整體風味具有重要作用。對醇類物質(zhì)分別做缺失實驗，發(fā)現(xiàn)芳樟醇（模型2-1）和苯甲醇（模型2-2）的缺失與重組模型相比差異顯著（P＜0.05），可知芳樟醇和苯甲醇具有的果香、甜香對無花果提取物整體香氣具有重要作用。缺失所有醛類（模型3）時與重組模型相比具有極顯著差異（P＜0.01）。當缺失苯甲醛（模型3-1）時與重組模型相比具有極顯著差異（P＜0.01），缺失香蘭素（模型3-2）時與重組模型相比差異顯著（P＜0.05），可知這兩種物質(zhì)對整體風味形成具有一定的作用。缺失所有呋喃類化合物（模型4）時與重組模型相比具有高度顯著差異（P＜0.001）。對OAV＞100的化合物分別進行缺失實驗，發(fā)現(xiàn)缺失5-羥甲基糠醛（模型4-1）時與重組模型相比具有極顯著差異（P＜0.01），缺失4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮（模型4-2）時與重組模型相比具有顯著差異（P＜0.05），進一步省略糠醛（模型4-3）時與重組模型相比差異不顯著（P＞0.05）；此外，缺失除4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮、5-羥甲基糠醛、糠醛的所有呋喃類物質(zhì)（模型4-3和模型4-4）與重組模型相比無顯著差異（P＞0.05），因此，說明4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮、5-羥甲基糠醛表現(xiàn)出的焦糖、烘焙香氣對無花果提取物香氣具有重要作用。缺失甲基環(huán)戊烯醇酮（模型5）時與重組模型相比具有顯著差異（P＜0.05），說明甲基環(huán)戊烯醇酮對風味影響具有一定的作用。結(jié)果表明，γ-己內(nèi)酯、棕櫚酸乙酯、苯甲醇、芳樟醇、香蘭素、苯甲醛、4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮、5-羥甲基糠醛、甲基環(huán)戊烯醇酮是無花果提取物特征風味的重要來源。

表5 無花果提取物完整重組樣品的缺失實驗Table 5 Results of omission experiments for complete recombinant samples of fig extract

2.4 電子鼻分析

電子鼻的10 個金屬傳感器能針對不同氣體產(chǎn)生不同響應信號。對γ-己內(nèi)酯、棕櫚酸乙酯、苯甲醇、芳樟醇、香蘭素、苯甲醛、4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮、5-羥甲基糠醛、甲基環(huán)戊烯醇酮按比例調(diào)配后的混合樣品與無花果提取物進行電子鼻分析。圖2為混合物與無花果提取物的電子鼻雷達圖，可以看出，兩者在W1W傳感器的響應值最大，其次是W2W傳感器，這與樣品中具有類似萜烯結(jié)構(gòu)香氣成分、芳香類化合物有關(guān)[38]。另外兩者在W1S、W2S、W5S均有響應，且差別不大。綜合來看，無花果提取物相比于混配樣品在10 個傳感器的響應值整體偏低，兩者的香氣輪廓高度相似，表明混配樣品能夠很好地反映無花果提取物的香氣特征。

圖2 混配樣品及無花果提取物的電子鼻數(shù)據(jù)雷達圖Fig.2 Radar plot of electronic nose data for mixed samples and fig extract

3 結(jié)論

本研究利用HS-SPME-GC-MS、GC-O分析、DF法結(jié)合OAV、香氣重組缺失實驗對無花果提取物的香氣成分進行分析。GC-MS與GC-O共鑒定出31 種化合物，結(jié)合OAV確定18 種重要風味物質(zhì)。經(jīng)重組實驗驗證，重組樣品與無花果提取物的香氣輪廓相似度高，呈現(xiàn)果香、甜香、烘焙香、焦糖香等典型的風味特征，略帶酸香、膏香、奶香，具有明顯的無花果提取物風味特征。采用缺失實驗進一步明確無花果提取物關(guān)鍵特征風味物質(zhì)，結(jié)果表明γ-己內(nèi)酯、棕櫚酸乙酯、苯甲醇、芳樟醇、香蘭素、苯甲醛、4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮、5-羥甲基糠醛、甲基環(huán)戊烯醇酮為無花果提取物的關(guān)鍵特征風味物質(zhì)。通過電子鼻對9 種關(guān)鍵特征風味物質(zhì)的混配樣品和無花果提取物進行對比分析，發(fā)現(xiàn)兩者的香氣輪廓具有高度相似性，表明混配樣品能夠很好地反映無花果提取物的香氣特征。上述實驗結(jié)果明確了無花果提取物的特征風味成分，可為無花果特征風味的香原料的開發(fā)及質(zhì)量控制提供理論支撐，同時為無花果風味相關(guān)產(chǎn)品的研究提供參考。