王曉艷, 李蓮英, 王燕俠, 張翰儒, 劉婷婷

甘肅省婦幼保健院婦產(chǎn)科(甘肅蘭州 730050)

子癇前期(pre-eclampsia, PE)是常見的妊娠并發(fā)癥,患者可出現(xiàn)血壓升高及蛋白尿臨床癥狀,發(fā)病機制復(fù)雜,可導(dǎo)致全球2%～8%的妊娠復(fù)雜化[1]。PE患者可增加腎衰竭、急性肺水腫、胎兒窘迫及死產(chǎn)的發(fā)生風險,嚴重影響母嬰生命安全[2]。PE的誘發(fā)因素存在多種,包含氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝異常、內(nèi)皮細胞損傷等,但是具體機制還不清楚。腸道微生態(tài)系統(tǒng)由正常的腸道菌群及其生存環(huán)境組成。腸道菌群是腸道微生態(tài)系統(tǒng)的核心部分,占據(jù)人體微生物78%,腸道菌群穩(wěn)定性對機體健康至關(guān)重要,當其穩(wěn)定性被破壞后可誘發(fā)多種腸道及其他疾病[3]。以往研究證實腸道菌群對機體新陳代謝、營養(yǎng)吸收等產(chǎn)生影響,當腸道菌群失衡可誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng),增加2型糖尿病、動脈硬化、慢性腎病及PE的發(fā)生概率[4]。PE的發(fā)生、發(fā)展與腸道菌群失衡存在關(guān)聯(lián),認為腸道菌群紊亂后調(diào)節(jié)機體免疫細胞,加快炎癥反應(yīng)而降低抑炎因子的表達,當致炎因子增加和抑炎因子表達失衡后,加快血管內(nèi)皮細胞收縮,血管內(nèi)皮細胞功能紊亂認為是導(dǎo)致血壓升高的的病理生理機制[5]。腸道微生物與人體形成一個超級有機體,微生物的改變會對孕婦的健康產(chǎn)生影響,因此了解腸道微生態(tài)與PE之間的關(guān)系,對于患病風險預(yù)測和精準干預(yù)非常重要。本研究探討腸道微生態(tài)與PE的關(guān)系,為相關(guān)研究提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2021年1月至2022年6月我院收治的40例PE患者作為研究對象。診斷標準:符合謝幸等主編的第8版《婦產(chǎn)科學(xué)》教材中PE的標準[6]。納入標準:(1)漢族;(2)年齡18～34歲;(3)單胎妊娠;(4)自然受孕;(5)無感染及近期用藥史;(6)具有良好的依從性。排除標準:(1)近2周內(nèi)服用益生菌、抗生素、激素等影響腸道菌群的藥物。(2)患有惡性腫瘤;(3)有胎膜早破、陰道流血、腹痛等臨產(chǎn)征象者。40例PE患者中孕26周20例,孕36周為20例,同一時期收取40例健康孕婦,其中26周20例,孕36周為20例,所有研究對象均知曉本研究內(nèi)容,并簽署知情同意書。已經(jīng)我院倫理委員會審核批準(2021-0010)。

1.2 方法

1.2.1 分組及一般資料 40例PE患者按照孕周不同分為兩組,26周PE孕婦作為A1組(n=20),36周PE孕婦作為A2組(n=20);40例健康孕婦按照孕周不同分為兩組,26周健康孕婦作為B1組,36周健康孕婦作為B2組(n=20)。各組研究對象一般資料見表1。

表1 各組研究對象一般資料比較

1.2.2 糞便標本 各組研究對象在入院后首日及健康體檢時,采用糞便標本5 g。方法:排凈尿液,將無菌墊單鋪在便池內(nèi),糞便排在其上,洗凈雙手后采用樣勺挖取未接觸空氣及墊單等糞便約5 g,-80℃保存。

1.2.3 DNA提取及16S rDNA的擴增及測序 (1)DNA提取:采用Omega Stoo1DNAKit試劑盒(廣州飛揚生物工程有限公司)提取糞便標本基因組DNA,具體方法嚴格按照試劑盒說明書進行。(2)16S rDNA的擴增及測序:將稀釋(1∶25)后的基因組DNA為模板,采用含有Barcode的細菌的16S rDNA基因V3-V4的特異性引物。對糞便中細菌的DNA進行擴增。反應(yīng)條件:①94℃預(yù)變性5 min;②94℃變性30 s,56°退火30 s,72℃延伸20 s,40個循環(huán);③循環(huán)結(jié)束后,72℃延申5 min。對PCR產(chǎn)物進行電泳分析,磁珠純化后進行定量分析。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行定量分析,并上機測序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 (1)采用Illumina-Misq高通量測序平臺進行測序,得到結(jié)果以Fq文件進行存儲。(2)采用Trimmomatic軟件去雜,后進行拼接,得到完整序列。對序列進行處理最終得到有效標簽。(3)采用Vsearch軟件將有效標簽,按照≥97%的相似度進行分類,得到可操作分類單元,將其中豐度最大的序列作為該單元的代表序列。(4)按照界、門、綱、目、科、屬逐級將腸道菌群進行結(jié)構(gòu)分層,得到可操作單元注釋結(jié)果后按照分類進行匯總,得到各個樣本的相對豐度,基于16S rRNA擴增子測序結(jié)果預(yù)測生物群落功能,與《京都基因及基因組百科全書》對比差異。

2 結(jié)果

2.1 B1組及B2組腸道菌群α多樣性及腸道菌群差異的比較 B1組及B2組腸道菌群α多樣性比較,B2組Chao1及Observed-Species指數(shù)均低于B1組(P<0.001),見表2、圖1。B1組及B2組腸道菌群差異比較:與B1組相比,B2組艱難梭狀芽胞桿菌(Clostridium)、馬氏羊蹄菌(Fournierella)、普雷沃菌(Prevotella)、梭桿菌屬(Fusobacterium)的豐度升高,雙歧桿菌(Bifidobacterium)及普拉梭菌(Faecalibacterium)的豐度降低,見圖2。

圖1 B1組及B2組腸道菌群α多樣性

圖2 B1組及B2組腸道菌群差異比較

表2 B1組及B2組腸道菌群α多樣性比較

2.2 A1組及B1組腸道菌群α多樣性及腸道菌群差異的比較 A1組及B1組腸道菌群α多樣性比較,A1組Chao1及Observed-Species指數(shù)均低于B1組(P<0.001),見表3、圖3。A1組及B1組腸道菌群差異比較:與B1組相比,A1組Clostridium、Fournierella、Prevotella、Fusobacterium豐度升高,Bifidobacterium及Faecalibacterium的豐度降低(P<0.05),見圖4。

圖3 A1組及B1組腸道菌群α多樣性比較

圖4 A1組及B1組腸道菌群差異比較

表3 A1組及B1組腸道菌群α多樣性比較

2.3 A2組及B2組α多樣性及腸道菌群差異的比較 A2組及B2組腸道菌群α多樣性比較;A2組Chao1及Observed-Species指數(shù)均低于B2組(P<0.001),見表4、圖5。A2組及B2組腸道菌群差異比較:與B2組相比,A2組Clostridium、Fournierella、Prevotella、Fusobacterium豐度升高,Bifidobacterium及Faecalibacterium的豐度降低,見圖6。

圖5 A2組及B2組α多樣性比較

圖6 A2組及B2組腸道菌群差異比較

表4 A1組及B1組腸道菌群α多樣性比較

2.4 A1組及A2組α多樣性及腸道菌群差異的比較 A1組及A2組腸道菌群α多樣性比較:A2組Chao1及Observed-Species指數(shù)均低于A1組(P<0.001),見表5、圖7。A1組及A2組腸道菌群差異的比較:與A1組相比,A2組Clostridium、Fournierella、Prevotella、Fusobacterium豐度升高,Bifidobacterium及Faecalibacterium的豐度降低,見圖8。

圖7 A1組及A2組α多樣性比較

圖8 A1組及A2組腸道菌群差異的比較

表5 A1組及A2組α多樣性比較

3 討論

PE是妊娠期常見的疾病之一,妊娠20周后患者出現(xiàn)血壓升高及蛋白尿,患者可產(chǎn)生頭痛、胃腸道反應(yīng)等癥狀,并隨著疾病的發(fā)展,可出現(xiàn)抽搐及昏迷等癥狀,增加母嬰不良反應(yīng)甚至導(dǎo)致妊娠終止。現(xiàn)階段,有研究認為PE與腸道微生態(tài)息息相關(guān),而腸道菌群是腸道微生態(tài)主要組成部分,可通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)發(fā)育及營養(yǎng)物質(zhì)的的正常代謝,但是當其穩(wěn)定性失調(diào)后可誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)或其他系統(tǒng)疾病,而影響母嬰安全[7]。本研究通過分析PE與腸道菌群的關(guān)系,認為隨著PE患者孕周的延長而腸道菌群致病性增加。

本研究結(jié)果顯示,與B1組相比,B2組腸道菌群α多樣性降低,且Clostridium、Fournierella、Prevotella、Fusobacterium等致病菌豐度升高,Bifidobacterium及Faecalibacterium等有益菌豐度降低,說明女性腸道菌群成分及腸道菌群的占比也會發(fā)生改變,隨著孕周的延長而腸道菌群致病性增加。在妊娠過程中隨著孕期的增加,生理腸道菌群發(fā)生改變,細胞多樣性降低,致病菌豐度升高[8]。本研究與之相似。但孕早期這種現(xiàn)象不明顯,孕晚期較明顯。在妊娠期間,腸道菌群會隨著進程的增加而改變,妊娠中晚期菌群多樣性降低,且Clostridium、Fournierella、Prevotella、Fusobacterium豐度增加,Bifidobacterium及Faecalibacterium菌群豐度降低。原因與妊娠期間發(fā)生免疫系統(tǒng)改變,而腸道菌群又影響著免疫細胞活化狀態(tài),導(dǎo)致上述致病菌增加,加快腸道疾病的產(chǎn)生[9]。

本研究結(jié)果顯示:與B1/B2組相比,A1/A2組腸道菌群α多樣性降低,致病菌豐度增加,有益菌豐度降低,并隨著孕周時間的延長而變化顯著,說明PE疾病與腸道菌群感染存在關(guān)聯(lián),并與孕期時間相關(guān)。PE患者的腸道菌群因短鏈脂肪酸分泌降低,故產(chǎn)生有益菌的能力降低,導(dǎo)致腸道菌群動態(tài)平衡被打破,致病菌增加[10]。Clostridium屬于革蘭陽性厭氧菌,能夠分泌毒素而參與動脈血管痙攣,同時釋放升壓物質(zhì)而導(dǎo)致血壓升高[11]。Prevotella屬于革蘭陰性厭氧菌,可表達一些與氧化應(yīng)激相關(guān)的還原酶類物質(zhì),并可調(diào)節(jié)炎癥物質(zhì)而加快免疫性疾病或機體的感染率[12]。Fusobacterium是梭菌門最主要的菌屬,革蘭陰性厭氧菌,可在人類和動物的身體共生,可聚集在結(jié)腸,會引起菌血癥和各種快速進展的感染。同時,Fusobacterium毒性更強,能夠產(chǎn)生重要的脂多糖(LPS)、內(nèi)毒素和溶血素等,增加機體毒力[13-14]。Bifidobacterium為革蘭陽性厭氧桿菌,具有合成維生素、與其他厭氧菌在黏膜表面形成生物屏障、防止外襲菌、刺激免疫功能、激活巨噬細胞、提高宿主抗感染能力及抗腫瘤等功能[15]。Faecalibacterium在健康人體中表達較高,可減少脂肪組織及腸道組織中炎癥表達,同時具有維持腸道完整性及改善炎癥損傷的作用[16]。有研究表明,在PE組的腸道菌群中,致病菌之間的正相關(guān)更為顯著,例如Fusobacterium及Clostridium豐度升高,有益菌豐度降低,表示患者腸道菌群共生關(guān)系發(fā)生紊亂,加重腸道功能障礙,并認為與PE的發(fā)生關(guān)系密切[17-18]。與健康孕婦相比,PE患者腸道有益菌降低,本研究表明,與26/36周健康孕婦的腸道菌群相比,與26/36周的PE患者中腸道菌群存在差異,主要表現(xiàn)為致病菌豐度增加而有益菌豐度降低。原因是血壓升高時去甲腎上腺及交感神經(jīng)活性增強,導(dǎo)致腸道通透性升高,腸道炎癥反應(yīng)加重,進一步紊亂腸道菌群,致病菌活性增強并可隨著病程時間的延長而加劇。

本研究結(jié)果顯示:與A1組相比,A2組孕婦腸道菌群多樣性降低,且上述致病菌升高而有益菌豐度降低,認為PE孕婦本身腸道菌群紊亂性較高,并隨著孕周的延長而紊亂性更強。有研究表明,隨著孕期的延長母體腸道菌群會發(fā)生改變,達到孕晚期時腸道菌群多樣性顯著降低,原因與機體代謝功能、內(nèi)分泌系統(tǒng)等相關(guān)[19]。另外,有研究表明,妊娠過程中腸道抗炎作用的菌群豐度降低,致病菌豐度升高,在孕早期變化不明顯,孕晚期表現(xiàn)最顯著[20]。本研究認為與子癇前期孕26周孕婦相比,36周子癇前期孕婦隨著孕周的延長腸道菌群多樣性降低,致病性增高,針對這種情況,臨床醫(yī)生應(yīng)重點對孕晚期孕婦的腸道菌群進行排查,有利于降低對胎兒發(fā)育的不良影響。

綜上所述,健康孕婦會隨著孕周的延長腸道菌群α多樣性降低,致病菌Clostridium、Fournierella、Prevotella、Fusobacterium豐度增加;PE腸道菌群致病性高于健康孕婦,且α多樣性降低;PE會隨著孕周的增加,腸道菌群α多樣性降低,且上述致病菌豐度增加,有益菌Bifidobacterium及Faecalibacterium占比降低,認為加強PE機體腸道菌群的監(jiān)測對于預(yù)防炎癥性疾病具有重要意義。

利益相關(guān)聲明:本文無利益沖突。

作者貢獻說明:王曉艷進行論文的構(gòu)思與設(shè)計、統(tǒng)計學(xué)處理,撰寫論文,并對論文整體負責、監(jiān)督管理;李蓮英:進行研究的實施與可行性分析、數(shù)據(jù)整理;王燕俠、張翰儒:進行數(shù)據(jù)收集;王曉艷、劉婷婷:進行結(jié)果的分析與解釋、論文的修訂,負責論文的質(zhì)量控制及審校。