趙勇, 梁麗麗, 江南

1商丘市胸科醫(yī)院結(jié)核科(河南商丘 476005); 河南省胸科醫(yī)院 2結(jié)核內(nèi)科, 3結(jié)核外科(河南鄭州 450008)

結(jié)核病是一種通過吸入結(jié)核分枝桿菌(MTB)傳播的慢性傳染病,不僅會感染患者肺部,還可累及多個器官及組織[1]。我國在2020年已成為結(jié)核第2負擔國,新發(fā)病例為82.5萬,防控形勢較為嚴峻[2]?；顒有苑谓Y(jié)核(ATB)是結(jié)核病的主要傳染源,其病灶處于活動期,痰涂片陽性,病程進展快,且該類患者多存在耐藥性,病死率高[3]。因此,急需篩選可用于評估ATB治療效果的標志物,以助于改善預后。眾所周知,ATB發(fā)病過程與免疫功能紊亂有關,多種炎癥因子、異常表達的微小RNA(miRNA)均參與其中[4]。微小RNA(miR)miR-451a在肺結(jié)核患者血清中水平降低,通過調(diào)控免疫應答過程中關鍵基因表達參與巨噬細胞抗MTB感染過程[5]。Toll樣受體4(TLR4)位于巨噬細胞表面,當MTB入侵時,激活TLR4信號通路,并將信號傳遞到細胞內(nèi),激活免疫應答,機體大量分泌炎癥因子,消滅MTB[6]。已證實,miR-451a可靶向調(diào)控TLR4信號通路,參與MTB感染過程[7]。但miR-451a與ATB患者抗結(jié)核治療預后的關系尚未明確。本研究通過檢測ATB患者血清miR-451a、TLR4 mRNA水平,分析其與炎癥反應及預后相關性,以改善抗結(jié)核治療效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年2月至2022年10月商丘市胸科醫(yī)院收治的肺結(jié)核患者350例,其中ATB患者162例(ATB組),非ATB患者188例(NATB組)。另取同期健康體檢者180例為對照組。ATB組依據(jù)抗結(jié)核6個月療效分為預后良好組(n=120)、預后不良組(n=42)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(編號:2020-02-025)。

納入標準:(1)符合ATB相關診斷標準[8],具有盜汗、咯血、發(fā)熱等體征,痰抗酸桿菌陽性,影像學檢查提示ATB病變特征;(2)初次確診;(3)肝腎功能正常;(4)單一肺結(jié)核感染。

排除標準:(1)未完成隨訪;(2)慢性支氣管炎、慢阻肺等其他肺部疾病;(3)惡性腫瘤;(4)自身免疫性疾病;(5)耐藥性肺結(jié)核、肺外結(jié)核;(6)呼吸道病毒急性感染等其他急、慢性感染性疾病。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料 統(tǒng)計入組受試者人口學資料性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)等,實驗室指標:白細胞計數(shù)(WBC)、C反應蛋白(CRP)、紅細胞沉降率(ESR)、干擾素-γ(IFN-γ),白細胞介素-12(IL-12)。其中WBC采用全自動血細胞分析儀(BC-6900型,深圳邁瑞公司)檢測,ESR采用魏氏法,CRP、IFN-γ、IL-12利用檢測試劑盒在全自動生化分析儀(羅氏C702)測定,貨號為H126-1-2、H025-1-2、H010,均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2.2 血清miR-451a、TLR4水平檢測 取對照組體檢當天、肺結(jié)核患者入院次日清晨空腹外周血5 mL,高速離心肌(型號Centrifuge 5810R,Eppendorf公司)3 000 r/min轉(zhuǎn)速,離心10 min,取血清,實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測血清miR-451a、TLR4 mRNA表達。使用TRIzol試劑(貨號15596-062,美國Invitrogen公司)從血清中獲得總RNA,利用第一鏈cDNA合成預混體系Master Premix(貨號:RT-01022,重慶致宏生物科技有限公司)得到互補DNA,隨后采用一步法RT-qPCR試劑盒(貨號:RT-02111,重慶致宏生物科技有限公司)說明書進行RT-qPCR反應,QuantStudio 3熒光定量PCR儀為美國ABI公司。PCR擴增程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,共計40個循環(huán)。引物序列見表1,由上海漢恒生物公司提供合成,miR-451a、TLR4分別以U6、GAPDH作為內(nèi)參。采用2-ΔΔCt法分析miR-451a、TLR4 mRNA相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 治療方案及預后評估

1.3.1 治療方案 ATB患者均給予標準2HRZE/4HR方案[8],強化期(2個月)給予異煙肼(國藥準字H33020938,浙江巨泰藥業(yè)有限公司)0.3 g/次,1次/d;利福平(國藥準字H13022231,浙江萬邦藥業(yè)有限公司)0.45 g/次,1次/d;吡嗪酰胺(國藥準字H31020800,上海信誼藥廠有限公司)0.75 g/次,2次/d;乙胺丁醇(國藥準字H44020758,廣東華南藥業(yè)集團有限公司),0.75 g/次,1次/d;鞏固期(4個月)給予異煙肼、利福平,治療方案同上。

1.3.2 療效觀察 治療6個月后評估療效[9]。預后良好:癥狀體征消失,3次痰涂片轉(zhuǎn)陰,X線檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)病灶部分吸收或完全吸收、消散、空洞閉合。預后不良:癥狀無明顯好轉(zhuǎn),胸片未正常,痰涂片陽性。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 25.0軟件處理數(shù)據(jù),計數(shù)資料以例(%)表示,采用2檢驗;計量資料以表示,兩組間比較采用t檢驗,3組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較為SNK-q檢驗;Pearson法進行相關性分析;多因素logistic回歸分析ATB患者預后影響因素;受試者工作特征(ROC)曲線評價血清miR-451a、TLR4對ATB患者預后預測價值,ROC曲線下面積(AUC)比較采用Z檢驗;P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3組受試者臨床資料比較 ATB組CRP、ESR、IFN-γ、IL-12水平高于NATB組、對照組,NATB組又高于對照組(P<0.05);3組間性別、WBC、學歷、年齡、居住地、BMI、婚姻狀態(tài)、吸煙史、基礎疾病相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組受試者臨床資料比較

2.2 3組受試者血清miR-451a、TLR4 mRNA水平比較 ATB組、NATB組、對照組血清miR-451a水平依次升高,而血清TLR4 mRNA水平依次降低(P<0.05)。見表3。

表3 3組受試者血清miR-451a、TLR4 mRNA水平比較

2.3 ATB組血清miR-451a、TLR4 mRNA水平與臨床指標相關性 經(jīng)Pearson分析發(fā)現(xiàn),ATB組血清miR-451a與TLR4 mRNA水平呈負相關(r=-0.519,P<0.05),見圖1。血清miR-451a與CRP、ESR、IFN-γ、IL-12呈負相關(r=-0.404、-0.377、-0.435、-0.391,P<0.05),血清TLR4 mRNA與CRP、ESR、IFN-γ、IL-12呈正相關(r=0.469、0.361、0.442、0.384,P<0.05),miR-451a、TLR4 mRNA均與WBC無明顯相關性(r=-0.166、0.172,P>0.05),見圖2。

圖1 血清miR-451a與TLR4 mRNA水平相關性

圖2 血清miR-451a、TLR4 mRNA水平與各臨床指標相關性

2.4 不同預后組ATB患者臨床資料及血清miR-451a、TLR4 mRNA水平比較 與預后良好組相比,預后不良組TLR4 mRNA、IFN-γ、IL-12水平升高,miR-451a水平降低(P<0.05);兩組間居住地、年齡、BMI、CRP、ESR、性別、治療前胸片X線表現(xiàn)、婚姻狀態(tài)、治療前臨床表現(xiàn)、學歷、WRC、吸煙史、基礎疾病相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 不同預后組ATB患者臨床資料及血清miR-451a、TLR4 mRNA水平比較

2.5 多因素logistic回歸分析ATB患者預后影響因素 以ATB患者預后不良為因變量(預后不良=1,預后良好=0),將TLR4 mRNA(實測值)、IFN-γ(實測值)、IL-12(實測值)、miR-451a(實測值)為自變量,代入logistic回歸模型,結(jié)果顯示,TLR4 mRNA、miR-451a是ATB患者預后影響因素(P=0.001、0.009)。見表5。

表5 多因素logistic回歸分析ATB患者預后影響因素

2.6 血清miR-451a、TLR4 mRNA水平對ATB患者預后預測效能 血清miR-451a、TLR4 mRNA單獨預測ATB患者預后不良截斷值分別為0.70、2.01,AUC分別為0.852、0.821,敏感度分別為92.86%、73.81%,特異度分別為73.33%、86.67%,二者聯(lián)合檢測的AUC為0.949,優(yōu)于單一指標檢測AUC(Z=2.827、2.896;P=0.005、0.004),其敏感度為92.86%,特異度為85.83%。見圖3。

圖3 血清miR-451a、TLR4 mRNA預測ATB患者預后的ROC曲線

3 討論

ATB具有高病死率、高傳染性,也是我國重點防控的慢性傳染病[10]。確診ATB后給予及時、規(guī)律的抗結(jié)核治療,多數(shù)患者可取得較好預后,若治療不合理或不及時,將加重病情,造成永久性肺損傷,甚至引起其他臟器損傷[11-12]。肺結(jié)核發(fā)生、發(fā)展離不開炎癥因子,MTB入侵人體后,機體將啟動免疫反應,激活免疫細胞,同時IFN-γ、IL-12等大量分泌,并導致CRP、ESR升高參與病情進展。本研究發(fā)現(xiàn),ATB組CRP、ESR、IFN-γ、IL-12水平明顯升高,表明ATB患者機體免疫炎癥反應紊亂。本研究中162例ATB患者抗結(jié)核治療6個月預后不良發(fā)生率為25.93%,與侯學靜等[3]報道26.88%相近,說明ATB患者抗結(jié)核治療預后不良風險較高,需引起重視。故探究ATB抗結(jié)核治療預后相關指標,有助于制定個體化治療方案、促進疾病轉(zhuǎn)歸。

miRNA通過與特定的mRNA結(jié)合并調(diào)控其翻譯,參與細胞活動、抗病毒防御及免疫反應,并可介導宿主對MTB的反應[13]。值得注意的是,miR-451a是miRNA家族一員,近期研究顯示,miR-451a在肺結(jié)核患者中表達降低,能較好地區(qū)分ATB與潛伏性結(jié)核感染[14]。相關研究亦證實,miR-451a在肺結(jié)核患者外周血中呈現(xiàn)低表達[5]。本研究中,ATB患者血清miR-451a水平較NATB患者及對照組明顯降低,與既往研究一致。據(jù)報道,類風濕性關節(jié)炎、小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎、2型糖尿病均與免疫紊亂有關,在這類疾病中均觀察到miR-451a異常表達,并認為miR-451a是調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)異常的重要生物標志物[15]。Li等[16]研究顯示,miR-451a通過靶向MIF抑制炎癥,并促進M1巨噬細胞向M2巨噬細胞極化,參與機體免疫調(diào)節(jié)。本研究相關性分析發(fā)現(xiàn),miR-451a與CRP、ESR、IFN-γ、IL-12呈負相關,表明miR-451a水平變化與ATB患者炎癥狀態(tài)關系密切,推測miR-451a通過靶向巨噬細胞表面抗原,調(diào)控炎癥信號通路,進而參與ATB免疫炎癥反應。朱江等[17]研究顯示,miR-451a與HBV-ACLF患者預后密切相關,并認為miR-451a可作為該病預后評估指標。本研究發(fā)現(xiàn)預后不良者血清miR-451a水平低于預后良好者,且miR-451a是ATB患者預后不良影響因素,表明血清miR-451a水平與ATB抗結(jié)核治療效果密切相關,miR-451a水平降低,預后較差,檢測miR-451a水平變化有助于評估預后。結(jié)合本研究結(jié)果推測,低水平miR-451a對下游炎癥通路抑制作用減弱,導致相關炎癥反應因子水平增加,加重機體肺部炎癥,促使肺損傷加重,從而使患者預后較差。

Toll樣受體(TLRs)是模式識別受體的重要亞群,主要存在于肺泡巨噬細胞等抗原呈遞細胞上,在宿主免疫細胞對MTB的先天識別中起著關鍵作用,TLR2、TLR4、TLR9均參與MTB殺滅過程[6]。其中,TLR4位于人染色體9q32-33,集中分布于免疫細胞表面,是首個被發(fā)現(xiàn)的TLRs家族成員,當感知到MTB入侵時,通過與核因子-κB(NF-κB)結(jié)合激活NF-κB信號途徑,或通過MyD88依賴性途徑,調(diào)節(jié)相關蛋白表達,形成免疫抑制微環(huán)境,抑制MTB感染[6]。此外,TLR4基因多態(tài)性可導致巨噬細胞對細菌成分的反應降低,導致結(jié)核病的易感性增加[18]。本研究結(jié)果顯示,ATB患者血清TLR4水平升高,且ATB患者TLR4與miR-451a呈負相關,與曹建等[7]研究結(jié)果相似,表明miR-451a、TLR4與ATB發(fā)病過程密切相關,推測miR-451a靶向調(diào)控TLR4水平,進而通過NF-κB信號途徑或MyD88依賴性途徑,調(diào)控MTB抗感染過程。進一步分析TLR4與炎癥因子相關性,結(jié)果顯示TLR4與CRP、ESR、IFN-γ、IL-12呈正相關,表明TLR4與結(jié)核發(fā)病過程中免疫炎癥反應紊亂有關,推測TLR4水平升高將加重肺部炎癥。徐紅波等[19]研究證實,臨床預后好轉(zhuǎn)者TLR4水平低于未好轉(zhuǎn)者,且其是肺結(jié)核患者預后不良危險因素。本研究同樣發(fā)現(xiàn),ATB治療后預后不良者TLR4水平較高,且TLR4是ATB患者預后不良危險因素,表明檢測TLR4水平變化可為臨床提供預警作用。推測高水平TLR4將增加炎癥因子分泌,促進炎癥反應加重,加重肺損傷,因而不利于預后轉(zhuǎn)歸。另有研究顯示,外周血TLR4可用于診斷脊柱結(jié)核,并對脊柱結(jié)核復發(fā)有較好預測效能[20]。此外,miRNA在MTB感染中發(fā)揮重要作用,血清miRNA檢測方法簡便,且較穩(wěn)定,是結(jié)核病的候選標志物,其中miR-378已被初步確定為結(jié)核患者血清中特異性miRNA之一[21]。因此,檢測血清miR-451a、TLR4 mRNA水平變化對預測ATB患者抗結(jié)核療效有重要參考價值。ROC曲線顯示,miR-451a聯(lián)合TLR4 mRNA檢測的AUC與準確度均高于單一指標檢測,且敏感度、特異度均與單獨檢測時接近,表明二者聯(lián)合檢測時對ATB患者預后有較高預測價值,有助于早期預測預后以指導臨床工作。

綜上所述,ATB患者血清miR-451a水平降低、TLR4 mRNA水平升高,二者呈負相關,并與炎癥因子及預后密切相關,miR-451a聯(lián)合TLR4 mRNA對預后預測價值較高,能為臨床預測ATB患者預后提供參考。但本研究未探討miR-451a、TLR4 mRNA參與ATB的具體調(diào)控機制,有待后續(xù)通過基礎研究進一步明確。

利益相關聲明:論文所有作者共同認可論文無利益沖突。

作者貢獻說明:趙勇提出課題及設計實驗,參與實施研究,論文撰寫;梁麗麗研究指導,對論文進行審閱;江南采集數(shù)據(jù)及分析數(shù)據(jù),參與統(tǒng)計分析。