劉桂麗, 房碩, 李丙南, 趙子申, 秦蘭英, 劉朋, 趙園瑩

滄州市人民醫(yī)院 1皮膚科, 2神經(jīng)內(nèi)科(河北滄州 061000)

大皰性類天皰瘡(bullous pemphigoid,BP)屬于自身免疫性皮膚疾病,常見(jiàn)于老年人,目前臨床上對(duì)于此類疾病僅有免疫抑制或免疫調(diào)節(jié)療法,通?；颊咝枰^長(zhǎng)時(shí)間使用上述藥物,導(dǎo)致病程較長(zhǎng),且疾病期間臨床表現(xiàn)較重,極易由于感染等并發(fā)癥導(dǎo)致死亡[1-2]。得益于基因研究的普及,臨床研究發(fā)現(xiàn)皮膚組織細(xì)胞中表達(dá)的跨膜半橋粒蛋白(transmembrane hemidesmosome,BP180),可以作為BP致病性抗體識(shí)別的主要靶抗原,在明確診斷、疾病嚴(yán)重程度及療效方面具有較好的效果[3]。而通過(guò)基因組學(xué)對(duì)BP180進(jìn)行探討后發(fā)現(xiàn),該蛋白還在神經(jīng)細(xì)胞中高度敏感,故國(guó)外有研究發(fā)現(xiàn)BP180與部分神經(jīng)系統(tǒng)疾病有直接關(guān)系,故進(jìn)一步引申出是否皮膚細(xì)胞組織內(nèi)BP180異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生的探討[4-5]。而本研究在既往研究的基礎(chǔ)上,以臨床較常見(jiàn)且已經(jīng)被證實(shí)與BP180具有相關(guān)性的血管性癡呆(vascular dementia,VD)及BP患者作為對(duì)象,對(duì)其血清內(nèi)BP180情況進(jìn)行探討,旨在進(jìn)一步明確兩種疾病之間的關(guān)系,為完善臨床治療方案提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2021年1月至2023年1月于我科就診的BP患者、同時(shí)間段于我院就診的VD患者及我院體檢中心明確為健康或疾病控制穩(wěn)定人群作為研究對(duì)象,分別納入BP組、VD組及對(duì)照組。

納入標(biāo)準(zhǔn):(1)BP組患者符合《大皰性類天皰瘡診斷和治療的專家建議》中對(duì)于BP的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6];(2)VD組患者符合文獻(xiàn)[7]中對(duì)于VD的診斷標(biāo)準(zhǔn);(3)年齡在18周歲以上;(4)所有患者及家屬均知情同意。

排除標(biāo)準(zhǔn):(1)BP組患者合并有神經(jīng)系統(tǒng)類疾病;(2)VD組患者合并有皮膚類疾病;(3)合并有自身免疫系統(tǒng)類疾病;(4)半年內(nèi)糖皮質(zhì)激素、免疫調(diào)節(jié)藥物及細(xì)胞毒類藥物使用史;(5)嚴(yán)重的肝腎功能不全;(6)合并惡性腫瘤疾病;(7)1年內(nèi)嚴(yán)重外傷史及手術(shù)史。

符合上述條件后共計(jì)納入BP組63例,VD組83例,對(duì)照組90例。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)同意后實(shí)施(批準(zhǔn)號(hào):K-2020284)。

1.2 BP180檢測(cè)方法 上海臻科生物科技有限公司生產(chǎn)的人抗BP180抗體ELISA檢測(cè)試劑盒對(duì)血清中BP180含量及滴度進(jìn)行檢測(cè);具體如下:抽取患者空腹靜脈血5 mL后加入EDTA作為抗凝劑,混合10～20 min后,使用離心20 min(2 000～3 000 r/min),并收集上清液作為待測(cè)樣本。試劑盒室溫狀態(tài)平衡20 min后設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔及樣本孔;標(biāo)準(zhǔn)品孔各加標(biāo)準(zhǔn)品50 μL,樣本孔中加入待測(cè)樣本50 μL,空白孔加入緩沖液;而后分別于標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL,并密封所有反應(yīng)孔,并置于37℃恒溫箱溫育60 min。棄去孔內(nèi)液體,并使用吸水紙拍干后于每孔加350 μL洗滌液,靜置1 min后甩去洗滌液,再次使用吸水紙上拍干,共計(jì)重復(fù)5次。完成上述操作后每孔加入底物A、B各50 μL,37℃避光孵育15 min。每孔加入終止液50 μL,15 min內(nèi),使用賽默飛世爾公司提供的NanoDrop ONE型分光光度計(jì)在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值,并根據(jù)OD值按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算樣本孔BP180陽(yáng)性率及濃度。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 一般資料 包括:年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、文化程度、吸煙史、基礎(chǔ)疾病。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)室檢查資料 包括:白細(xì)胞(WBC)、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(EOS)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、總膽紅素(TBiL)、血肌酐(Cr)、白蛋白、血壓、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、空腹血糖(FGB)、D-D二聚體、同型半胱氨酸(Hcy)、BP180陽(yáng)性率及濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 25.0軟件。計(jì)數(shù)資料以例(%)表示,組間比較采用2檢驗(yàn);計(jì)量資料以表示,組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn),三組間比較采用方差分析,兩兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。傾向性評(píng)分匹配(PSM)過(guò)程利用PSM擴(kuò)展程序進(jìn)行:以是否分組情況為因變量,各協(xié)變量為自變量,通過(guò)logistics回歸分析估計(jì)傾向性評(píng)分值,采用1∶1臨近匹配法進(jìn)行匹配,通過(guò)卡鉗值為0.02保證匹配結(jié)果的優(yōu)良性,然后比較組間協(xié)變量的標(biāo)準(zhǔn)差異在匹配前后的改變,匹配后的標(biāo)準(zhǔn)差異越接近于0,匹配結(jié)果越滿意,當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)差異絕對(duì)值<0.1時(shí),認(rèn)為組間變量的均衡性較好;最后使用多分類logistic回歸分析三組之間的關(guān)系;P<0.05時(shí)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組樣本匹配前一般資料比較 匹配前三組患者在年齡、BMI及吸煙史占比指標(biāo)比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其余指標(biāo)比較差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1。

表1 三組樣本匹配前一般資料比較 例

2.2 三組樣本匹配后一般資料比較 三組患者經(jīng)過(guò)傾向性評(píng)分匹配后每組共55例患者配對(duì)成功,在兩組間的協(xié)變量經(jīng)匹配后均達(dá)到平衡,經(jīng)PSM各協(xié)變量的均衡性得到了明顯提高(P>0.05),且匹配后樣本量經(jīng)過(guò)計(jì)算后符合正態(tài)分布(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 三組樣本匹配后一般資料比較 例

2.3 三組樣本匹配后實(shí)驗(yàn)室檢查資料比較 BP組患者EOS及BP180抗體陽(yáng)性率及濃度高于其他兩組,白蛋白低于其他兩組(P<0.05);而VD組BP180抗體陽(yáng)性率及濃度高于對(duì)照組(P<0.05),VD組和對(duì)照組EOS及白蛋白比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。VD組患者TG、TC、D-D二聚體及Hcy高于其他兩組(P<0.05);BP組患者D-D二聚體及Hcy高于對(duì)照組(P<0.05),但BP組及對(duì)照組TG、TC比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。BP組及VD組患者BP180抗體陽(yáng)性率均高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 三組樣本匹配后實(shí)驗(yàn)室檢查資料比較

2.4 影響VD及BP的危險(xiǎn)因素分析 以分組為因變量,以單因素分析P<0.05的指標(biāo)作為自變量進(jìn)行無(wú)序多分類logistic回歸分析,結(jié)果顯示: D-D二聚體、Hcy、BP180抗體濃度及BP180抗體陽(yáng)性是影響VD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05);BP180抗體濃度及BP180抗體陽(yáng)性是影響B(tài)P的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),見(jiàn)表4。

3 討論

BP早期臨床特征主要以軀體局部紅斑或表皮下水皰為首發(fā)癥狀,由于癥狀較普通,故通常會(huì)被當(dāng)作濕疹等其他皮膚疾病治療,從而導(dǎo)致病情進(jìn)展,且后期疾病發(fā)展速度較快,極易誘發(fā)局部感染、低蛋白血癥、電解質(zhì)紊亂等并發(fā)癥導(dǎo)致患者死亡[8-9]。有流行病學(xué)研究表明,罹患神經(jīng)系統(tǒng)及神經(jīng)退行性疾病患者,如腦血管病、多發(fā)性硬化癥和阿爾茨海默病發(fā)生BP的概率大于普通人群,我們可以認(rèn)為,這些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的存在增加了個(gè)體患BP的風(fēng)險(xiǎn),故二者之間可能存在一定的聯(lián)系[10]。

在本研究中,BP患者EOS明顯高于其他兩組,因?yàn)镋OS作為固有免疫細(xì)胞,在真表皮交界處有大量分布,其在維持宿主防御功能及機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)方面存在顯著作用[11-12]。EOS浸潤(rùn)是BP突出病理特征,當(dāng)BP患者真皮下EOS被激活后發(fā)生脫顆粒改變,進(jìn)而黏附在基底膜角質(zhì)形成細(xì)胞上并破壞基底角質(zhì)形成細(xì)胞導(dǎo)致真皮-表皮分離,此為BP患者發(fā)生大皰的主要病理機(jī)制[13]。臨床研究提示,在BP患者外周血、皮損中均可見(jiàn)EOS升高,本研究結(jié)果與之類似[14]。而白蛋白低于其他兩組則主要是由于大皰處大量組織液滲出,其中蛋白是滲出液的主要成分,故會(huì)導(dǎo)致機(jī)體白蛋白含量下降,從而誘發(fā)低蛋白血癥[15]。而VD與對(duì)照組患者由于排除了感染、寄生蟲等疾病,故二組上述兩指標(biāo)比較并無(wú)顯著差異。VD組患者TG、TC、Hcy、D-D二聚體均高于其他兩組,在Gui 等[16]的研究中,TC與TG濃度與VD的發(fā)病有著顯著的相關(guān)性。而Hcy作為蛋氨酸和半胱氨酸代謝過(guò)程中產(chǎn)生的重要中間產(chǎn)物,在血管壁細(xì)胞由于損傷等因素的影響會(huì)導(dǎo)致Hcy濃度升高,此項(xiàng)也是VD發(fā)病重要產(chǎn)物[17-18]。值得注意的是,此項(xiàng)在BP患者中濃度亦明顯高于對(duì)照組,說(shuō)明BP患者在發(fā)生局部皮膚組織改變的同時(shí),可能由于全身免疫反應(yīng)導(dǎo)致血管壁細(xì)胞代謝狀態(tài)改變,故而此項(xiàng)可能與BP患者發(fā)生血管神經(jīng)類疾病明顯相關(guān),但由于BP主要病理改變并未集中于循環(huán)系統(tǒng),故BP患者此項(xiàng)低于VD組。D-D二聚體是纖溶酶溶解的交聯(lián)纖維蛋白凝塊,有研究指出,VD由于血管內(nèi)皮狀態(tài)變化會(huì)導(dǎo)致D-D二聚體升高[19-20]。但在本研究中,BP患者D-D二聚體也明顯高于對(duì)照組,分析原因可能是由于BP患者炎性反應(yīng)加劇,導(dǎo)致大量細(xì)胞因子釋放并進(jìn)入血液,繼而誘發(fā)纖維蛋白溶酶、組織纖溶酶原激活物的過(guò)度表達(dá),最終導(dǎo)致纖溶系統(tǒng)亢進(jìn),而D-D二聚體是反應(yīng)機(jī)體纖溶系統(tǒng)功能的重要標(biāo)志物,故其含量會(huì)顯著升高。通過(guò)以上敘述不難看出,血管改變是BP患者全身并發(fā)癥之一,并非其主要病理改變,故BP患者此項(xiàng)指標(biāo)低于VD患者,但再次說(shuō)明此兩種疾病之間關(guān)系密切。

通過(guò)對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析結(jié)果提示,BP組及VD組患者BP180抗體濃度及BP180抗體陽(yáng)性為共同危險(xiǎn)因素,而將D-D二聚體及Hcy排除BP的獨(dú)立影響因素,由此我們不難看出,相較于血管改變,BP180抗體表達(dá)情況作為VD及BP的相似點(diǎn)更為可靠。在 BP 患者中存在有HLA-DQB1過(guò)表達(dá),從而可能會(huì)增加 T 細(xì)胞對(duì) BP180 的親和力,進(jìn)而導(dǎo)致T細(xì)胞異常分化為Th17,最終導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的發(fā)生[21]。但有研究結(jié)果提示了相反的方向,T細(xì)胞分化為Th17后也會(huì)進(jìn)行凋亡細(xì)胞清除,并承擔(dān)對(duì)病毒等抗原的呈遞作用,故而會(huì)導(dǎo)致此細(xì)胞的消耗,并不一定會(huì)通過(guò)負(fù)反饋導(dǎo)致BP180表達(dá)的升高。因此,在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的抗BP180自身抗體水平的升高可能僅僅反映了細(xì)胞損傷增加及蛋白水解過(guò)程的改變,以及對(duì)自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的抗原呈遞,并不能說(shuō)明BP180是否可能通過(guò)表位擴(kuò)散參與到VD的病理過(guò)程中[22-23]。通過(guò)以上分析我們不難看出,既往研究通過(guò)BP180構(gòu)成的關(guān)系解釋BP和VD之間的關(guān)系尚存在爭(zhēng)議。但是通過(guò)本研究結(jié)果,再次證明了BP180濃度升高時(shí)VD與BP患者之間聯(lián)系的重要因素。近期最新研究結(jié)果顯示血漿中BP180高表達(dá)可能引起神經(jīng)變性或神經(jīng)炎癥,導(dǎo)致血腦屏障的破壞,BP180穿過(guò)血腦屏障后主要作用于皮層和海馬神經(jīng)節(jié)層的錐體細(xì)胞中,引起皮膚和腦自身抗原之間的交叉反應(yīng)性免疫反應(yīng),進(jìn)而導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)微循環(huán)長(zhǎng)期處于高炎性反應(yīng)狀態(tài),從而誘發(fā)局部血管痙攣、閉塞等反應(yīng)誘發(fā)局部缺血的產(chǎn)生[4]。既往研究指出,VD可能是由于反復(fù)發(fā)作的局部缺血性疾病導(dǎo)致神經(jīng)功能受損所誘發(fā),結(jié)合之前的敘述,在BP180高表達(dá)狀態(tài)下,中樞神經(jīng)系統(tǒng)可能發(fā)生反復(fù)缺血的可能性,此項(xiàng)也是導(dǎo)致VD的基礎(chǔ)病理改變之一[24-25]。通過(guò)以上結(jié)果不難發(fā)現(xiàn),BP所導(dǎo)致的BP180升高有導(dǎo)致VD發(fā)生的病理基礎(chǔ),故BP180在BP及VD的發(fā)生中扮演著重要的角色。

本研究為單中心小樣本量研究,結(jié)果可能存在偏倚;同時(shí)對(duì)于BP180在VD及BP患者中的作用機(jī)制是建立于既往研究基礎(chǔ)之上進(jìn)行解釋,說(shuō)服力欠佳,故以后會(huì)針對(duì)上述不足進(jìn)一步加強(qiáng)基礎(chǔ)研究,進(jìn)一步完善具體BP180在上述兩病中的作用機(jī)制。但這并不影響通過(guò)本研究得出BP180在BP及VD患者中表達(dá)變化類似,且可能是兩種疾病相互影響的關(guān)鍵因素的結(jié)論。

利益相關(guān)聲明:本文所有作者均聲明不存在相關(guān)利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明:劉桂麗、房碩負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)總體設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)部分操作、數(shù)據(jù)收集及論文擬稿;李丙南、趙子申、秦蘭英負(fù)責(zé)試驗(yàn)部分操作及數(shù)據(jù)整理分析;劉朋負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)及論文內(nèi)容潤(rùn)色、修改;趙園瑩協(xié)助實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備及進(jìn)行。