徐臘梅, 高潔, 李英, 劉立棟

1中國人民解放軍空軍第九八六醫(yī)院內(nèi)分泌科(陜西西安 710054); 2西安市工會醫(yī)院內(nèi)分泌科(陜西西安 710199)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)以持續(xù)無排卵、高雄激素血癥和胰島素抵抗為特征,涉及一組生殖、內(nèi)分泌和代謝疾病[1]。PCOS的臨床表現(xiàn)高度異質(zhì),肥胖是PCOS患者常見的臨床表型[2]。肥胖患者過多的脂肪儲存會增加血液中的胰島素濃度并觸發(fā)和加重胰島素抵抗,促進PCOS的發(fā)展[3]。近年來,腸道菌群與PCOS之間的相互關(guān)系越來越受到關(guān)注。Lindheim等[4]發(fā)現(xiàn),與健康女性相比,PCOS患者腸道中來自Tenericutes門的ML615J-28和124-7的豐度相當(dāng)?shù)?。根?jù)Mammadova等[5]說法,PCOS患者腸道中埃希菌/志賀菌的比例和鏈球菌的豐度增加,而阿克曼菌和瘤胃球菌科的豐度降低。盡管這些研究揭示PCOS患者腸道菌群多樣性與高雄激素血癥密切相關(guān),他們沒有進一步研究PCOS患者肥胖與腸道菌群的相關(guān)性,也沒有發(fā)現(xiàn)任何與PCOS發(fā)病密切相關(guān)的特定屬。因此,本研究的目的是調(diào)查肥胖、非肥胖PCOS女性和健康女性的腸道菌群組成,揭示腸道菌群特征及代謝功能。

1 資料與方法

1.1 一般資料 共招募了2020年6月至2022年6月在本院婦科就診的28例16～35歲的PCOS女性。這些PCOS患者包括16例肥胖女性(BMI≥28 kg/m2,肥胖PCOS組)和12例非肥胖女性(BMI為18.5～23.9 kg/m2,非肥胖PCOS組)。本研究中的PCOS診斷基于2003年荷蘭會議修訂的鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)[4]。此外,選擇本院體檢科14例健康年輕女性(BMI 18.5～23.9 kg/m2)作為非肥胖正常組,以及6例健康但肥胖女性(BMI≥28 kg/m2)作為肥胖正常組。排除具有以下情況之一的個體:懷孕、吸煙、腫瘤、慢性腹瀉、自身免疫性疾病、胃腸手術(shù)史和其他內(nèi)分泌疾病。沒有人接受口服避孕藥、抗雄激素、胰島素增敏劑、抗生素和益生菌治療。正常組的女性沒有月經(jīng)不調(diào)、不孕癥、內(nèi)分泌疾病或根據(jù)鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)診斷為PCOS的病史。所有參與者均知情同意。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)[審查批號:2020第(08)號]。

1.2 采樣 本次研究的所有受試者均需完成以下項目:(1)人體測量指標(biāo),包括身高、體重、腰圍和臀圍,以及體毛(對全身9個部位進行評分,每個部位0～4分,9個部位得分綜合≥8為多毛癥)和痤瘡(分為4個等級:一級癥狀較輕,數(shù)量<30個;二級數(shù)量在30～50之間;三級數(shù)量在50～100之間;四級數(shù)量>100)評分;(2)在月經(jīng)周期的第3天檢測生化指標(biāo),如性激素水平,包括黃體生成素(luteinizing hormone,LH)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、睪酮、雌二醇(E2)和脫氫表雄酮,以及口服葡萄糖耐量試驗期間的葡萄糖和胰島素水平;(3)糞便樣本的采集說明如下:在非月經(jīng)期間從每個參與者收集3～5 g新鮮糞便,并在2 h內(nèi)轉(zhuǎn)移到實驗室的冰盒中。然后將每個糞便樣本分別裝入4個EP管中,并在-80 ℃下冷凍直至使用。

1.3 DNA提取和PCR擴增 使用EZNA?土壤DNA試劑盒(美國Omega Bio-tek公司)獲得腸道微生物群的總DNA。使用NanoDrop2000分析提取的DNA的濃度和純度。DNA提取質(zhì)量通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用338F(5′-ACTCCTAC-GGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物通過PCR擴增細菌16S rDNA的V3-V4可變區(qū)。使用ABI GeneAmp? 9700進行擴增,設(shè)置如下:95 ℃預(yù)變性3 min,27個循環(huán)(95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,延伸72 ℃ 30 s)并在72 ℃延伸10 min。擴增混合物體積為20 μL,包括4 μL 5×FastPfu緩沖液、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs、0.8 μL引物(5 μmol/L)、0.4 μL FastPfu聚合酶和10 ng DNA模板。

1.4 Illumina MiSeq測序 使用2%瓊脂糖凝膠收集PCR擴增產(chǎn)物,并使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒(美國Axygen Biosciences公司)純化。純化產(chǎn)物用2%瓊脂糖電泳檢測,然后使用 QuantiFluorTM-ST(美國Promega公司)進行定量檢測。根據(jù)Illumina MiSeq平臺(美國Illumina公司)的標(biāo)準(zhǔn)操作方案,將純化的擴增片段構(gòu)建到PE 2*300的文庫中。構(gòu)造文庫步驟如下:(1)連接“Y”形接頭;(2)使用磁珠去除自連接片段;(3)通過PCR擴增富集文庫模板;(4)氫氧化鈉變性后產(chǎn)生ssDNA片段。測序過程在Illumina的Miseq PE300平臺上進行。

1.5 測序方法 原始序列由Trimmomatic軟件進行質(zhì)量控制,并通過FLASH軟件進行拼接。具體流程如下:(1)reads結(jié)束時20個以下的堿基被過濾,并設(shè)置50 bp的窗口。如果窗口中的平均質(zhì)量<20,我們從窗口中截斷后端堿基。質(zhì)控后過濾低于50 bp的reads,去除含有N堿基的reads;(2)根據(jù)測序數(shù)據(jù)之間的重疊關(guān)系,將paired reads拼接成重疊長度最小為10 bp的序列;(3)拼接序列重疊區(qū)最大允許錯配率為0.2,篩選出錯配序列;(4)利用序列兩端的barcode和引物區(qū)分樣本,調(diào)整序列方向。條形碼和引物的允許和最大錯配數(shù)分別為0和2。然后使用Qiime平臺的Usearch軟件(7.0版,http://drive5.com/uparse/),并根據(jù)97%的相似性對序列進行聚類。使用 RDP分類器(http://rdp.cme.msu.edu/)對聚類后的代表性序列進行注釋和聚類,并在70%的比較閾值下與Silva數(shù)據(jù)庫(SSU128/16s細菌)進行比較。

1.6 靶向代謝學(xué)分析 在患者就診時,將血液抽入含有檸檬酸鈉作為抗凝劑的CPT管中,至少禁食8 h。將試管在室溫下輕輕倒置8次,并在抽血后6 h內(nèi)以1 500g離心20 min。血漿等分試樣儲存在-80 ℃。使用AbsoluteIDQ p180試劑盒(澳大利亞BIOCRATES Life Sciences AG公司)對儲存的冷凍血漿樣本進行靶向代謝學(xué)分析。這種靶向方法同時使用液相色譜法和流動注射分析-質(zhì)譜法測量12種代謝物,包括犬尿氨酸/色氨酸、ADMA、脯氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、戊?；鈮A、十八烷二烯酰肉堿和3種甘油磷脂(PC ae C34:3、PC ae C36:5、PC ae C38:5),詳細的測定程序已在之前文獻[6]中描述過。

2 結(jié)果

2.1 肥胖和非肥胖PCOS女性的臨床和激素變量 與非肥胖正常組相比,非肥胖PCOS組中多毛癥評分、痤瘡評分、LH、LH/FSH、睪酮、E2和脫氫表雄酮顯著增加(P<0.05)。與肥胖正常組相比,肥胖PCOS組中多毛癥評分、LH/FSH和睪酮顯著升高(P<0.05),FSH顯著降低(P<0.05),見表1。

表1 參與者的臨床和生化特征

2.2 微生物多樣性和組成的比較 在對7 500個計數(shù)進行稀疏后,共發(fā)現(xiàn)了1 084個操作分類單位(OTU),其相似性截止為97%。在門水平上,在所有參與者中發(fā)現(xiàn)了厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和梭桿菌門,微生物豐度中位數(shù)分別為52%、35%、2.9%和0.8%(圖1)。在屬水平上,鑒定出147個屬的中位相對豐度為0.43%(IQR=0.1-0.88%),91個屬的平均相對豐度至少為0.1%。通過主坐標(biāo)分析(PCoA)將樣本群體的微生物群分布與屬水平的Bray-Curtis差異進行了協(xié)調(diào)。圖2A中的第一個和第二個主坐標(biāo)圖解釋了總方差的15.2%和8.7%,顯示沒有肥胖狀態(tài)或PCOS狀態(tài)的分離。每個測量的樣本內(nèi)微生物多樣性(觀察到的OTU豐富度、屬水平的Chao 1指數(shù)和香農(nóng)指數(shù))沒有顯著差異(圖2B-D)。

圖1 PCOS和正常的微生物組成比較

2.3 肥胖差異豐富的屬 表2顯示,差異豐度分析確定了與肥胖狀態(tài)顯著相關(guān)的4個屬(Finegoldia、Anaerococcus、Sneathia和Adlercreutzia)(P<0.05)。與沒有肥胖的女性相比,Finegoldia、Anaerococcus、Sneathia、Adlercreutzia在肥胖女性中的豐度顯著較低(P<0.05)(圖3)。在按PCOS狀態(tài)分層的分析中(表2),Finegoldia和Anaerococcus在PCOS和非PCOS女性中均與肥胖呈顯著負相關(guān),而PCOS和肥胖與Sneathia和Adlercreutzia之間存在暗示性但不顯著的相互作用(分別為PPCOS×肥胖= 0.090、0.057)。

圖3 4種細菌屬(Finegoldia、Anaerococcus、Sneathia、Adlercreutzia)的相對豐度

表2 肥胖狀態(tài)差異豐富的屬

2.4 代謝物與肥胖和細菌屬的關(guān)聯(lián) 為了進一步研究代謝物和腸道微生物組與肥胖的關(guān)系,我們檢查了4種與肥胖相關(guān)的腸道微生物屬與12種代謝物之間的相關(guān)性(圖4)。Anaerococcus與犬尿氨酸/色氨酸比率和纈氨酸呈負相關(guān)(r=-0.38、-0.32,P=0.007、0.041),而Adlercreutzia與脯氨酸和丙氨酸呈負相關(guān)(r=-0.37、-0.32,P=0.012、0.034)。另一方面,所有4種與肥胖相關(guān)的微生物屬都與肥胖相關(guān)的甘油磷脂呈正相關(guān)(所有3種甘油磷脂的r=0.12-0.36,r=0.29-0.36,P>0.05)。

注:*P<0.05,**P<0.01圖4 肥胖相關(guān)微生物屬與肥胖相關(guān)代謝物之間的Spearman相關(guān)性

3 討論

在本研究中,我們揭示了肥胖和非肥胖PCOS女性的臨床表現(xiàn)差異、血清激素水平和特征性腸道菌群。肥胖和非肥胖PCOS患者多毛評分、LH/FSH和血清睪酮水平顯著高于正常組。此外,我們發(fā)現(xiàn)肥胖與非肥胖的女性之間微生物群落的組成和多樣性沒有顯著差異。這些發(fā)現(xiàn)與大多數(shù)先前研究在正常人群中檢查腸道微生物群與肥胖之間的關(guān)系的研究[7-8]基本一致。然而,在檢查PCOS與微生物多樣性的關(guān)系時,本研究沒有發(fā)現(xiàn)顯著的關(guān)聯(lián),而之前的許多研究發(fā)現(xiàn)PCOS的這種差異有統(tǒng)計學(xué)意義,這可能與本研究納入的樣本量少有關(guān)[9]。

在屬水平上,我們發(fā)現(xiàn),與沒有肥胖的女性相比,肥胖女性中兩個屬(Finegoldia和Anaerococcus)的相對豐度顯著降低,并且PCOS患者和非PCOS患者的結(jié)果是一致的。早期微生物組研究確定了肥胖與人類腸道微生物組之間的聯(lián)系[10-11]。這些研究表明,肥胖小鼠和人類中Finegoldia的比例均降低。已知Anaerococcus菌會產(chǎn)生丁酸鹽,這是一種細菌發(fā)酵的產(chǎn)物,參與抗炎、提高胰島素敏感性和改善肥胖[12]。此外,本研究中Anaerococcus與犬尿氨酸/色氨酸比率和纈氨酸呈負相關(guān)。犬尿氨酸/色氨酸比率和纈氨酸曾被報道與PCOS人群中的肥胖有關(guān)。此外,色氨酸通過吲哚胺2,3-雙加氧酶分解代謝成犬尿氨酸,以響應(yīng)炎癥和免疫激活[13]。因此,我們的結(jié)果進一步支持了Anaerococcus菌在抗炎中的潛在參與。

此外,另外兩個屬Sneathia和Adlercreutzia在本研究中顯示出與肥胖的暗示性負相關(guān),并可能因PCOS而改變效果。值得注意的是,非肥胖PCOS組顯示出顯著較高的Sneathia相對豐度,而其他3個PCOS/肥胖狀態(tài)組顯示該屬的相對豐度較低且相似。這可能有助于說明為什么僅在PCOS人群中觀察到Sneathia與肥胖之間的負相關(guān)。Sneathia屬是陰道分娩過程中母體微生物組向新生兒自然傳播中的可能與1型肥胖、哮喘和肥胖有關(guān)的細菌之一[14]。然而,以前沒有研究檢查過PCOS與Sneathia之間的關(guān)系。本研究表明,在正常個體中,Adlercreutzia屬與肥胖之間存在負相關(guān),而之前的一項研究報告稱,與健康對照組和PCOS患者相比,肥胖PCOS患者的糞便樣本中Adlercreutzia屬減少[15]。盡管PCOS的潛在影響改變需要進一步研究,但Adlercreutzia與肥胖之間的暗示性關(guān)聯(lián)得到了該屬與本研究中觀察到的血漿脯氨酸之間的負相關(guān)性以及該屬可能參與過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)途徑的支持[16]。然而,由于樣本量相對較小,我們的結(jié)果應(yīng)該謹慎解釋。未來需要更大樣本量的研究來闡明這些屬與PCOS背景下的肥胖之間的關(guān)聯(lián)。

總之,本研究表明,在PCOS女性中,4種腸道微生物屬的相對豐度和與肥胖相關(guān)的相關(guān)代謝物變化降低。已知產(chǎn)生丁酸鹽的細菌屬在肥胖中具有較低的相對豐度,這與較高的色氨酸分解代謝相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明腸道菌群、肥胖和PCOS之間存在潛在的相互關(guān)系。然而,由于本研究樣本量較小,并且本研究沒有收集與微生物群落密切相關(guān)的膳食攝入信息。因此,需要進一步研究更大樣本量和宏基因組學(xué)數(shù)據(jù),以研究特定微生物及其在肥胖中的功能作用以及PCOS背景下的代謝特征。

利益相關(guān)聲明:本文所有作者聲明不存在任何利益沖突,本文中所有研究結(jié)果未在任何雜志發(fā)表過。

作者貢獻說明:徐臘梅負責(zé)了論文的全部撰寫和進行研究設(shè)計;高潔、李英負責(zé)實施了論文中病例收集、數(shù)據(jù)統(tǒng)計等;劉立棟在論文撰寫修改、討論以及研究設(shè)計中都有巨大貢獻。