溫國(guó)揚(yáng) ，羅文

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510000

川崎病是由感染因素引發(fā)的急性全身免疫性血管炎，其嚴(yán)重并發(fā)癥為冠狀動(dòng)脈病變，尤其好發(fā)于5歲以下兒童，而川崎病引起的冠狀動(dòng)脈病變已成為部分國(guó)家和地區(qū)常見的后天性心臟病之一[1]，其發(fā)病率呈增高趨勢(shì)[2-3]。過敏性紫癜也稱IgA血管炎，是一種發(fā)生在兒童時(shí)期的系統(tǒng)性血管炎，其機(jī)制與免疫紊亂相關(guān)，以四肢對(duì)稱性出血性皮疹為特征，常伴關(guān)節(jié)、消化道及腎臟等多系統(tǒng)器官損害[4]。兩種疾病嚴(yán)重影響兒童的健康。目前川崎病和過敏性紫癜治療尚缺乏針對(duì)性、統(tǒng)一性，尚無(wú)特效方法。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，川崎病由小兒正氣不足、邪氣內(nèi)伏引起，治療上以溫病衛(wèi)氣營(yíng)血理論進(jìn)行指導(dǎo)論治，治以清熱、涼血等[5-6]。兒童過敏性紫癜病機(jī)為伏邪潛內(nèi)、外因觸發(fā)，應(yīng)驅(qū)除邪氣，治以清火解毒、化瘀通絡(luò)[7]。血管炎發(fā)病由“伏火”引起，治以清火、降火、散瘀、化瘀等[8]。犀角地黃湯具有清熱涼血散瘀的功效，用于各種出血、斑疹等免疫性血管炎如過敏性紫癜、川崎病等。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討犀角地黃湯“異病同治”川崎病和過敏性紫癜的分子機(jī)制，為后續(xù)相關(guān)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 犀角地黃湯靶點(diǎn)收集

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)[9]（TCMSP，https://www.tcmsp-e.com/tcmsp.php）以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為條件進(jìn)行篩選，檢索牡丹皮、赤芍的活性成分，借助Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）轉(zhuǎn)化為所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)名稱；生地黃、水牛角的活性成分根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)[10-12]收集，從PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)[13]（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取化學(xué)結(jié)構(gòu)，通過Swiss ADME（http://www.swissadme.ch/）進(jìn)行活性成分 篩 選 ， 使 用 SwissTargetPrediction （http://swisstargetprediction.ch/）進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，得到犀角地黃湯活性成分及其作用靶點(diǎn)。

1.2 川崎病和過敏性紫癜靶點(diǎn)收集

通過GeneCards[14]（http://swisstargetprediction.ch/）、DrugBank[15]（https://go.drugbank.com/） 和OMIM[16]數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.omim.org/）， 以“kawasaki disease” “Henoch-Schonlein purpura”“anaphylactoid purpura”“IgA vasculitis”為檢索詞檢索疾病靶點(diǎn)，篩選得出基因靶點(diǎn)。

1.3 犀角地黃湯活性成分-川崎病和過敏性紫癜靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過Venny2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）獲取藥物活性成分作用靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)，并構(gòu)建韋恩圖，交集靶點(diǎn)通過STRING平臺(tái)[17]（https://cn.string-db.org）構(gòu)建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，最小相互作用閾值設(shè)定為＞0.9，得到PPI網(wǎng)絡(luò)。將PPI網(wǎng)絡(luò)信息導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件中的MCODE 插件，對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步分析，得到核心蛋白質(zhì)功能模塊，并對(duì)其分析總結(jié)。

1.4 靶點(diǎn)富集分析

將交集靶點(diǎn)錄入Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)[18]（http://metascape.org/gp/），將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，分析方法選擇“Custom Analysis”進(jìn)行富集分析，如生物過程、細(xì)胞組分、分子功能及信號(hào)通路，總結(jié)與藥物、疾病相關(guān)的核心分析結(jié)果，將數(shù)據(jù)通過微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）進(jìn)行可視化展示。

1.5 活性成分-交集靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將活性成分、交集靶點(diǎn)、通路共同建立網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)，導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建活性成分-交集靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，利用Network Analyzer對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)連接度、介度、緊密度綜合分析網(wǎng)絡(luò)核心成分、主要靶點(diǎn)及核心通路。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

將活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)度值排名較前的核心靶點(diǎn)通過PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)[19]采集其結(jié)構(gòu)然后利用PyMOL進(jìn)行去水分子、去配體處理，AutoDock Tool進(jìn)行加氫等處理，得到受體結(jié)構(gòu)。網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)度值排名較前的活性成分結(jié)構(gòu)通過PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)收集，AutoDock Tool處理活性成分結(jié)構(gòu)，得到配體。隨后利用Autodock Tool實(shí)現(xiàn)分子對(duì)接，并將對(duì)接結(jié)果可視化及記錄對(duì)接能量。

2 結(jié)果

2.1 犀角地黃湯活性成分及成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

通過TCMSP平臺(tái)將篩選條件定為OB≥30%，DL≥0.18，檢索牡丹皮、赤芍的活性成分，通過已發(fā)表的文獻(xiàn)搜索生地黃、水牛角的活性成分，經(jīng)篩選后收集到相應(yīng)成分共19個(gè)，其中牡丹皮5個(gè)、赤芍10個(gè)、生地黃2個(gè)、水牛角2個(gè)，有3個(gè)為共有活性成分，見表1。

表1 犀角地黃湯主要活性成分

經(jīng)活性成分配對(duì)靶點(diǎn)，其中牡丹皮靶點(diǎn)226個(gè)、赤芍靶點(diǎn)147個(gè)、生地黃靶點(diǎn)34個(gè)、水牛角靶點(diǎn)136個(gè)，經(jīng)去除重復(fù)值，共獲取306個(gè)靶點(diǎn)基因。

2.2 川崎病和過敏性紫癜靶點(diǎn)結(jié)果

通過GeneCards、DrugBank、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)篩選去除重復(fù)值，獲得川崎病潛在靶點(diǎn)1 416個(gè)，過敏性紫癜靶點(diǎn)1 093個(gè)。

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選的犀角地黃湯活性成分靶點(diǎn)與川崎病和過敏性紫癜疾病靶點(diǎn)通過Venny2.1.0取交集靶點(diǎn)，并構(gòu)建韋恩圖，得到犀角地黃湯活性成分-川崎病和過敏性紫癜共同靶點(diǎn)71個(gè)，見圖1。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，最小相互作用閾值設(shè)定為＞0.9，得到PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖2。其中核心靶點(diǎn)共66 個(gè)，網(wǎng)絡(luò)平均連接度為7.333，介度0.023，緊密度0.431。

圖1 犀角地黃湯活性成分-川崎病-過敏性紫癜交集靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 犀角地黃湯治療川崎病和過敏性紫癜靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

得到PPI 網(wǎng)絡(luò)后，運(yùn)用Cytoscape3.7.2 中的MCODE插件，通過分子復(fù)合物檢測(cè)算法對(duì)相互作用關(guān)系進(jìn)行分析，根據(jù)P值，保留PPI網(wǎng)絡(luò)與模塊中3個(gè)最佳評(píng)分的生物學(xué)進(jìn)程對(duì)其進(jìn)行功能描述，其中主要生物學(xué)功能為細(xì)胞因子受體結(jié)合，見表2。

表2 犀角地黃湯-川崎病-過敏性紫癜靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)功能描述

2.4 GO和KEGG通路富集分析結(jié)果

借助Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)71 個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，GO 和KEGG 通路富集分析結(jié)果見圖3。

圖3 犀角地黃湯治療川崎病和過敏性紫癜靶點(diǎn)富集分析

由結(jié)果可見，多個(gè)靶點(diǎn)的功能與川崎病和過敏性紫癜的發(fā)生密不可分。犀角地黃湯參與的生物學(xué)過程（BP） 有1 365 條，包括對(duì)脂多糖的反應(yīng)（response to lipopolysaccharide）、對(duì)細(xì)菌來(lái)源分子的反應(yīng)（response to molecule of bacterial origin）、炎癥反應(yīng)（inflammatory response）。細(xì)胞組分（CC）有51 條，分子功能（MF）有86 條。參與信號(hào)通路共161條，包括血管病變通路如流體剪切力；炎癥通路如TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路；補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)等。相關(guān)靶點(diǎn)調(diào)節(jié)川崎病和過敏性紫癜的功能主要富集于細(xì)胞因子相關(guān)活性、細(xì)胞信號(hào)傳遞功能，受體配體活性等。

2.5 活性成分-交集靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

運(yùn)用Cytoscape3.7.2構(gòu)建犀角地黃湯活性成分-交集靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，節(jié)點(diǎn)106個(gè)，連接線525條，見圖4。活性成分-交集靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果：槲皮素連接度為60，介度為0.349 3，緊密度為0.633 5，預(yù)測(cè)槲皮素為犀角地黃湯治療療川崎病和過敏性紫癜的主要成分，其次為山柰酚（連接度為23，介度為0.048 9，緊密度為0.430 4）、黃芩素（連接度為13，介度為0.010 3，緊密度為0.396 9）。IL6在網(wǎng)絡(luò)中的連接度為18，介度為0.037 6，緊密度為0.505 0，AKT1在網(wǎng)絡(luò)中的連接度為18，介度為0.024 9，緊密度為0.500 0，預(yù)測(cè)IL6、AKT1為犀角地黃湯治療川崎病和過敏性紫癜的主要靶點(diǎn)。根據(jù)2種疾病發(fā)病機(jī)制為炎癥及免疫反應(yīng)，病理變化為血管內(nèi)皮損傷，TNF信號(hào)通路在網(wǎng)絡(luò)中的連接度為20，介度為0.015 6，緊密度為0.423 2，流體剪切力在網(wǎng)絡(luò)中的連接度為25，介度為0.034 9，緊密度為0.434 0，推斷TNF信號(hào)通路及流體剪切力為核心信號(hào)通路。

圖4 犀角地黃湯治療川崎病和過敏性紫癜活性成分-交集靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

根據(jù)活性成分-交集靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，槲皮素、山柰酚、黃芩素等為主要活性成分，IL6、AKT1等為核心靶點(diǎn)，通過分子對(duì)接，可得出槲皮素、山柰酚、黃芩素與IL6對(duì)接能量分別為-6.4、-6.3、-6.6 kcal/mol，槲皮素、山柰酚、黃芩素與AKT1 對(duì)接能量為-9.2、-9.2、-9.4 kcal/mol，說(shuō)明活性成分與核心靶點(diǎn)結(jié)合活性較好，見表3，將對(duì)接能量以熱圖形式展示（見圖5）。將槲皮素等配體與AKT1對(duì)接得到結(jié)構(gòu)圖，見圖6。圖中可以清晰顯示氫鍵連接緊密。

圖5 犀角地黃湯主要活性成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接熱圖

圖6 犀角地黃湯主要活性成分與AKT1對(duì)接模式

表3 犀角地黃湯主要活性成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果（kcal/mol）

3 討論

川崎病和過敏性紫癜均是與免疫反應(yīng)相關(guān)的血管炎，可導(dǎo)致動(dòng)脈瘤形成和腎臟損傷等[20]。研究表明，炎癥介質(zhì)、靶向黏膜屏障功能及IgA沉積引起的血管內(nèi)皮因子病變與血管炎發(fā)生有關(guān)[21-24]。其治療藥物多為激素、免疫球蛋白等，可調(diào)節(jié)免疫、延緩疾病進(jìn)展、降低復(fù)發(fā)率，但長(zhǎng)期用藥可能出現(xiàn)耐藥，且存在藥物不良反應(yīng)，可能增加感染及腫瘤風(fēng)險(xiǎn)。

中醫(yī)藥治川崎病和過敏性紫癜均具有顯著療效。葉國(guó)華等[25]發(fā)現(xiàn)，犀角地黃湯可改善患者凝血指標(biāo)和炎癥反應(yīng)，降低患者出血傾向。宋珂等[26-27]發(fā)現(xiàn)，犀角地黃湯可有效減輕過敏性紫癜患者臨床癥狀及降低腎損傷的比例。劉旭和等[28]發(fā)現(xiàn)，犀角地黃湯加味可有效降低過敏性紫癜患兒復(fù)發(fā)率。基礎(chǔ)研究表明，犀角地黃湯可減少促炎因子分泌、抑制炎癥反應(yīng)[29-30]。

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接結(jié)果可知，槲皮素、山柰酚、黃芩素是犀角地黃湯的主要活性成分，核心靶點(diǎn)主要是IL6、AKT1，信號(hào)通路主要有TNF信號(hào)通路、流體剪切力。川崎病及過敏性紫癜發(fā)病時(shí)會(huì)激活免疫細(xì)胞，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子如IL6，而IL6又為核因子（NF）-κB靶點(diǎn)，可誘導(dǎo)其過度活化，進(jìn)而產(chǎn)生多種炎癥因子[31]，而TNF信號(hào)通路激活又會(huì)釋放NF-κB，與IL6結(jié)合引發(fā)炎癥反應(yīng)，出現(xiàn)關(guān)節(jié)痛、紅腫、腎損害等。AKT1激活增強(qiáng)血管內(nèi)皮因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮屏障破壞[32]。同時(shí)，TNF信號(hào)通路激活產(chǎn)生炎癥因子損傷血管內(nèi)皮，從而發(fā)生血管炎。研究發(fā)現(xiàn)，流體剪切力是維持血管穩(wěn)態(tài)的重要因素，流體剪切力譜改變是多種血管疾病的病理特征[33]，其機(jī)制是流體剪切力可抑制炎癥介質(zhì)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞Smad2/3 的激活和EndMT 反應(yīng)[34]，而2種疾病均可產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)，可破壞流體剪切力譜，從而產(chǎn)生血管病變，臨床表現(xiàn)為紫癜、紅斑等。槲皮素可抑制炎癥小體分泌[35]，并可改變炎癥代謝產(chǎn)物平衡、減輕炎癥，克服炎癥對(duì)血管內(nèi)皮的有害影響[36]。山柰酚可起到保護(hù)血管免受氧化應(yīng)激和炎癥引起的損傷的作用[37]。黃芩素可預(yù)防血管的氧化應(yīng)激和炎癥損傷[38]。因此，犀角地黃湯可能通過減少IL6、AKT1生成及分泌，抑制TNF信號(hào)通路產(chǎn)生炎癥因子，減輕內(nèi)皮損傷，保護(hù)流體剪切力譜，防止血管病變，發(fā)揮治療作用。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法展示犀角地黃湯“異病同治”川崎病和過敏性紫癜內(nèi)在機(jī)制，闡釋犀角地黃湯具有保護(hù)血管內(nèi)皮、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用，進(jìn)一步探究中藥治療這2種疾病的生物學(xué)功能及作用通路。