柯麗娟 ，李小陽(yáng) ，劉駿 ，雷蕾 ，王忠

1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥信息研究所，北京 100700；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100700

清熱藥主要功效為清解里熱，常用于治療里熱證。熱證有衛(wèi)分、氣分、營(yíng)分、血分、實(shí)熱、虛熱等不同證型，臨床應(yīng)用清熱藥既取其共性特征，又根據(jù)證型配伍用藥。本研究探究清熱瀉火藥、清熱燥濕藥、清熱解毒藥、清熱涼血藥和清虛熱藥作用機(jī)制[1]，為清熱功效的現(xiàn)代生物學(xué)機(jī)制研究提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 活性成分篩選及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)獲取

5組清熱類(lèi)中藥見(jiàn)表1。以藥物名稱(chēng)為檢索詞，在TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、TCMID（http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/Login/login.html）、 NPASS （https://ngdc.cncb.ac.cn/databasecommons/database/id/4452）數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索其活性成分。利用微生信在線平臺(tái)（https://www.bioinformatics.com.cn）繪制韋恩圖，得到5組藥物各自特有活性成分集合及共有成分集合。

表1 清熱類(lèi)中藥類(lèi)別及藥物名稱(chēng)

檢索DrugBank（https://go.drugbank.com/legal/terms_of_use）、 NPASS （https://ngdc.cncb.ac.cn/databasecommons/database/id/4452）數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行規(guī)范化處理。

1.2 核心靶點(diǎn)篩選

將5類(lèi)清熱藥活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)及共有成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)分別輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cn.string-db.org），選擇“multiple protein”，物種為“Homo sapiens”，設(shè)置confidence＞0.7，得到蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)；將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件，利用CytoHubba插件獲得各組及共有成分的核心靶點(diǎn)。

1.3 GO功能、KEGG通路及疾病富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov）對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能、KEGG通路及疾病富集分析。GO功能富集結(jié)果通過(guò)基迪奧生物信息云平臺(tái)tu2（https://www.omicshare.com）進(jìn)行可視化展示，KEGG通路通過(guò)微生信在線平臺(tái)進(jìn)行可視化處理。再將5類(lèi)清熱中藥及共有成分核心靶點(diǎn)分別導(dǎo)入 Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://metascape.org）進(jìn)行DisGeNET富集分析。

1.4 分子對(duì)接驗(yàn)證

對(duì)清熱藥共有成分及核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org）獲得靶點(diǎn)的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，使用Discovery Studio 4.5.0軟件“small molecules-prepare ligand”模塊獲得配體分子三維結(jié)構(gòu)，使用small molecules minimize ligands 及CHARMm 力場(chǎng)進(jìn)行能量最小化，保存為配體分子集；蛋白分子去除晶體水分子后，使用“clean protein”模塊加氫、補(bǔ)充不完整氨基酸殘基，導(dǎo)入“CDOCKER”模塊進(jìn)行分子對(duì)接；以原配體對(duì)接的CDOCKER_INTERACTION_ENERGY為參考值，判斷其相互作用情況。

2 結(jié)果

2.1 活性成分與對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)

共獲得清熱類(lèi)中藥活性成分2 715個(gè)，清熱瀉火藥、清熱燥濕藥、清熱解毒藥、清熱涼血藥、清虛熱藥活性成分分別為297、609、1 196、224、389個(gè)，特有活性成分分別為174、412、849、145、205個(gè)。

5組藥物共有活性成分7個(gè)，分別為亞油酸（Linoleic Acid）、棕櫚酸（Palmitic Acid）、槲皮素（Quercetin）、糠醛（Furfural）、2-戊基呋喃（2-Pentylfuran）、香草酸（Vanillic Acid）、壬醛（Nonanal）。清熱藥物活性成分韋恩圖見(jiàn)圖1。清熱瀉火藥、清熱燥濕藥、清熱解毒藥、清熱涼血藥、清虛熱藥及共有活性成分分別獲得靶點(diǎn)117、241、402、87、260、196個(gè)。

圖1 清熱類(lèi)中藥活性成分韋恩圖

2.2 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心靶點(diǎn)

采用Cytoscape3.9.1構(gòu)建清熱類(lèi)中藥PPI網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)本文OSID碼。利用CytoHubba插件，以P值篩選核心靶點(diǎn)，5組藥物及共有成分分別得到10個(gè)核心靶點(diǎn)，見(jiàn)表2。

表2 5組清熱類(lèi)中藥及共有成分核心靶點(diǎn)（前10位）

2.3 GO功能富集分析

使用在線平臺(tái)DAVID對(duì)5類(lèi)清熱藥特有活性成分及共有成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，包括生物過(guò)程（BP）、分子功能（MF）及細(xì)胞組分（CC）。每類(lèi)藥物P值排序前10位BP條目見(jiàn)圖2。其中，清熱瀉火藥參與的BP有外源代謝過(guò)程、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶活性負(fù)調(diào)控、細(xì)胞葡萄糖醛酸化負(fù)調(diào)控、類(lèi)黃酮葡萄糖醛酸化等；MF包括酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄輔激活因子結(jié)合、鋅離子結(jié)合、肽-賴(lài)氨酸-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性、葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶等；CC為核質(zhì)、核、細(xì)胞質(zhì)、膜筏、細(xì)胞外泌體等。清熱燥濕藥參與的BP有外源代謝過(guò)程、類(lèi)固醇代謝過(guò)程、對(duì)外源性刺激的反應(yīng)、單碳代謝過(guò)程、雌激素代謝過(guò)程等；MF包括酶結(jié)合、碳酸鹽脫水酶活性、水解酶活性、鋅離子結(jié)合、芳香化酶活性等；CC為質(zhì)膜的組成部分、質(zhì)膜、突觸前膜的組成部分、突觸后膜、乙酰膽堿門(mén)控通道復(fù)合體等。清熱解毒藥參與的BP有外源代謝過(guò)程、細(xì)胞葡萄糖醛酸化、線粒體電子運(yùn)輸、細(xì)胞色素c到氧、腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素受體信號(hào)通路、對(duì)外源性刺激的反應(yīng)等；MF為酶結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性，配體激活的序列特異性DNA結(jié)合、細(xì)胞色素c氧化酶活性、相同蛋白結(jié)合、延遲整流鉀通道活性等；CC為線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ、線粒體、質(zhì)膜、電壓門(mén)控鉀通道復(fù)合物、質(zhì)膜的組成部分等。清熱涼血藥參與的BP有對(duì)β淀粉樣蛋白的反應(yīng)、單碳代謝過(guò)程、膠原分解代謝過(guò)程、細(xì)胞外基質(zhì)分解、細(xì)胞對(duì)UV-A 的反應(yīng)等；MF為鋅離子結(jié)合、碳酸鹽脫水酶活性、水解酶活性、酶結(jié)合、內(nèi)肽酶活性等；CC為核質(zhì)、胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞質(zhì)、核、細(xì)胞外區(qū)等。清虛熱藥參與的BP有興奮性突觸后電位、神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)程、化學(xué)性突觸傳遞、離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、膜電位的調(diào)節(jié)等；MF為神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、遞質(zhì)門(mén)控離子通道活性參與突觸后膜電位的調(diào)節(jié)、細(xì)胞外配體門(mén)控離子通道活性、鐵離子結(jié)合、L-抗壞血酸結(jié)合等；CC為突觸后膜、突觸、質(zhì)膜的組成部分、神經(jīng)元投射、GABA-A受體復(fù)合物等。共有成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)參與的BP有外源代謝過(guò)程、蛋白質(zhì)磷酸化、蛋白質(zhì)自磷酸化、肽基絲氨酸磷酸化、雌激素代謝過(guò)程等；MF為蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、酶結(jié)合、蛋白激酶活性、ATP結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等；CC為核質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)、胞質(zhì)溶膠、核、大分子復(fù)合物等。

圖2 5類(lèi)清熱類(lèi)中藥GO功能富集分析

2.4 KEGG通路富集分析

P值排序前10位的KEGG通路富集分析結(jié)果見(jiàn)圖3。其中，清熱瀉火藥特有活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)富集通路77條，主要涉及化學(xué)致癌作用-受體激活、化學(xué)致癌作用-DNA加合物、類(lèi)固醇激素生物合成、視黃醇代謝、藥物代謝-細(xì)胞色素P450等；清熱燥濕藥特有活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)富集通路101條，主要涉及類(lèi)固醇激素生物合成、化學(xué)致癌作用-受體激活、藥物代謝-細(xì)胞色素P450、氮代謝、細(xì)胞色素P450等；清熱解毒藥特有活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)富集通路186條，主要涉及代謝途徑、化學(xué)致癌作用-受體激活、膽汁分泌、藥物代謝-細(xì)胞色素P450、血清素能突觸等；清熱涼血藥特有活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)富集通路37條，主要涉及氮代謝、膀胱癌癥、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、內(nèi)分泌抵抗、甲狀腺激素信號(hào)通路等；清虛熱藥特有活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)富集通路96條，主要涉及尼古丁成癮、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、血清素能突觸、逆行內(nèi)源性大麻素信號(hào)傳導(dǎo)、GABA能突觸等；共有成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)富集通路143條，主要涉及內(nèi)分泌抵抗、化學(xué)致癌作用-DNA加合物、氮代謝、細(xì)胞色素P450對(duì)外源性物質(zhì)的代謝、化學(xué)致癌作用-受體激活等。

圖3 5類(lèi)清熱類(lèi)中藥對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

2.5 疾病富集分析

5類(lèi)清熱類(lèi)中藥活性成分及共有成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)疾病富集分析結(jié)果見(jiàn)表3?！凹膊?靶點(diǎn)” Circos圖見(jiàn)圖4。由圖4可知，清熱瀉火藥和清熱燥濕藥、清熱燥濕藥和清熱解毒藥相同核心靶點(diǎn)較多，可能說(shuō)明商戶(hù)類(lèi)別藥物富集的疾病相似度較高。

圖4 5類(lèi)清熱類(lèi)中藥對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)Circos圖

表3 5類(lèi)清熱類(lèi)中藥及共有成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)疾病富集分析

2.6 分子對(duì)接結(jié)果

7個(gè)共有活性成分與其核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果見(jiàn)表4。其中，SRC和棕櫚酸、槲皮素、亞油酸的對(duì)接結(jié)果，MAPK和棕櫚酸、槲皮素的對(duì)接結(jié)果及ESR2和棕櫚酸、槲皮素、亞油酸的對(duì)接結(jié)果均優(yōu)于原配體。SRC-棕櫚酸、MAPK-槲皮素、ESR2-亞油酸的作用模式見(jiàn)圖5。

圖5 SRC-棕櫚酸、MAPK-槲皮素、ESR2-亞油酸作用模式

表4 A6組清熱類(lèi)藥物有效成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果（kcal/mol）

3 討論

由圖2可知，5類(lèi)清熱藥活性成分相應(yīng)靶點(diǎn)GO富集結(jié)果BP條目都包含外源代謝過(guò)程和單碳代謝過(guò)程，說(shuō)明中藥可能通過(guò)以上2個(gè)過(guò)程發(fā)揮功效；其中，清熱瀉火藥、清熱燥濕藥、清熱解毒藥特有靶點(diǎn)BP相似度較高，達(dá)60%，主要富集在外源代謝過(guò)程、單碳代謝過(guò)程、葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶活性的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞葡萄糖醛酸化的負(fù)調(diào)控、雌激素代謝過(guò)程、細(xì)胞葡萄糖醛酸化。清熱涼血藥、清虛熱藥特有靶點(diǎn)BP與其他3類(lèi)中藥BP相似度不高，具有特異性。

由圖3可知，代謝途徑是5類(lèi)清熱藥共有信號(hào)通路，該信號(hào)通路可能在清熱功效中發(fā)揮重要作用。清熱瀉火藥、清熱燥濕藥、清熱解毒藥主要富集在新陳代謝類(lèi)信號(hào)通路，相似度達(dá)60%，包括代謝途徑、化學(xué)致癌作用-受體激活、類(lèi)固醇激素生物合成、視黃醇代謝、藥物代謝-細(xì)胞色素P450、膽汁分泌等通路。清熱涼血藥和清虛熱藥與其他3類(lèi)相似度較低，具有特異性。清熱涼血藥和清虛熱藥主要富集在生物體系統(tǒng)類(lèi)信號(hào)通路，其中，清熱涼血藥富集在內(nèi)分泌系統(tǒng)類(lèi)的信號(hào)通路較多，清虛熱藥富集在神經(jīng)系統(tǒng)類(lèi)的信號(hào)通路較多。

結(jié)合GO功能、KEGG和疾病富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，清熱瀉火藥可治療的優(yōu)勢(shì)疾病為乳腺癌、腫瘤，其功效可能與生物過(guò)程對(duì)脂多糖的反應(yīng)、脂肪酸代謝過(guò)程的負(fù)調(diào)節(jié)、外源性葡萄糖醛酸化和信號(hào)通路癌癥途徑有關(guān)；清熱燥濕藥可治療的優(yōu)勢(shì)疾病為抑郁癥、乳腺癌、肥胖，可能與類(lèi)固醇代謝過(guò)程、對(duì)尼古丁的反應(yīng)有關(guān)；清熱解毒藥可治療的優(yōu)勢(shì)疾病為抑郁癥、乳腺癌、肥胖，可能與生物學(xué)過(guò)程線粒體電子運(yùn)輸、腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素受體信號(hào)通路、蛋白質(zhì)均低聚、藥物代謝-其他酶、化學(xué)致癌作用-活性氧等有關(guān)；清熱涼血藥可治療的優(yōu)勢(shì)疾病為乳腺癌、炎癥反應(yīng)、肺氣腫，可能與生物過(guò)程對(duì)β淀粉樣蛋白的反應(yīng)、膠原分解代謝過(guò)程、細(xì)胞外基質(zhì)分解、膀胱癌癥、甲狀腺激素信號(hào)通路、松弛素信號(hào)通路等有關(guān)；清虛熱藥可治療的優(yōu)勢(shì)疾病為慢性酒精中毒、抑郁癥，可能與生物過(guò)程興奮性突觸后電位、神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)程、化學(xué)性突觸傳遞、尼古丁成癮、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、逆行內(nèi)源性大麻素信號(hào)傳導(dǎo)等有關(guān)。5種藥物發(fā)揮清熱功效可能與生物學(xué)過(guò)程中外源代謝過(guò)程、單碳代謝過(guò)程以及信號(hào)通路中代謝途徑有關(guān)，可治療的疾病為腫瘤、乳腺癌。

清熱藥抗乳腺癌的核心活性成分可能是棕櫚酸、槲皮素、香草酸、亞油酸。付紅萍等[2]研究發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸水平可反映乳腺癌發(fā)展過(guò)程潛在代謝變化，可能成為潛在的乳腺癌標(biāo)志物；Abramczyk等[3]研究表明，棕櫚酸可作為乳腺癌的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)。清熱藥知母、紫草、蒲公英、魚(yú)腥草、牛黃、穿心蓮、青蒿、金銀花、梔子、地骨皮、連翹、大青葉、板藍(lán)根、黃柏、黃芩均含有棕櫚酸。研究表明，槲皮素可下調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1表達(dá)，減少乳腺癌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，增加乳腺癌細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷水平，對(duì)乳腺癌細(xì)胞能量代謝具有調(diào)控作用，可作為潛在的抗癌劑或抗癌輔助劑[4]；同時(shí)，槲皮素可激活PTEN蛋白表達(dá)，抑制PI3K/AKT和JNK信號(hào)通路，誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡[5]。清熱藥苦參、金銀花、蒲公英、青蒿、黃連、梔子、黃柏、山豆根、牡丹皮、連翹、魚(yú)腥草均含有槲皮素。三葉青三氯甲烷部位的體外抗腫瘤活性由多種成分共同作用產(chǎn)生，包含連翹、梔子、地骨皮、黃連、牡丹皮、山豆根、金銀花中的香草酸[6]。此外，清熱藥紫草、蒲公英、金銀花、魚(yú)腥草、梔子、地骨皮、板藍(lán)根、連翹、黃芩中均含有亞油酸，亞油酸可通過(guò)調(diào)節(jié)microRNA表達(dá)水平抑制乳腺癌的發(fā)生[7]。

既往研究中，清熱藥相關(guān)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究多關(guān)注單味中藥或處方，如陳光輝等[8]發(fā)現(xiàn)梔子苷具有抗抑郁作用、楊思慧等[9]發(fā)現(xiàn)黃芩湯可減輕子宮內(nèi)膜癌化療不良反應(yīng)等。但相同功效藥物之間分子機(jī)制對(duì)比研究較少，本文為中藥功效分子機(jī)制研究提供新的思路。

綜上所述，本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接方法探討5類(lèi)清熱類(lèi)中藥各自功效與共同功效的作用機(jī)制，篩選藥物中可能具有抗乳腺癌活性的活性成分，為新藥研發(fā)提供思路，但本研究結(jié)論仍需實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。