湯笑語,張麗燕,邱文英,陳奕帆,馬明昊

(華派生物技術(shù)(集團(tuán))股份有限公司,成都 641423)

A型塞內(nèi)卡病毒(Senecavirus A,SVA)是一種小RNA病毒科(Picornaviridae),塞內(nèi)卡病毒屬(Senecavirus)的單股正鏈RNA病毒[1]。SVA能夠感染不同年齡段豬,引起豬的原發(fā)性水皰病,SVA感染的臨床癥狀與口蹄疫、水皰性口炎、豬水泡病相似,主要表現(xiàn)為豬鼻部、口唇部、蹄部出現(xiàn)水泡病變甚至潰爛,新生仔豬感染SVA還可能會(huì)導(dǎo)致死亡[2-3]。2015年廣東省首次報(bào)道豬感染SVA后,直至今日,SVA已在我國廣泛流行,但目前還沒有商品化疫苗用于該病的防控[4-7]。豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)又稱藍(lán)耳病,是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染引起的一種免疫抑制性疾病,該病傳染性強(qiáng),發(fā)病率高,嚴(yán)重危害了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[8-10]。藍(lán)耳病的免疫抑制作用不僅會(huì)導(dǎo)致感染豬繼發(fā)其他細(xì)菌性疾病,加重病程,還會(huì)致使其它疫苗的免疫反應(yīng)降低,導(dǎo)致免疫效果降低或免疫失敗[11-13]。已有研究表明多種疾病疫苗的免疫效果都會(huì)受到藍(lán)耳病的影響,如豬瘟、豬口蹄疫等[14-15]。本研究通過同時(shí)對(duì)PRRS陽性豬和PRRS陰性豬免疫塞內(nèi)卡滅活苗,檢測其中和抗體效價(jià)及攻毒保護(hù)情況,探究PRRS是否會(huì)影響SVA滅活苗的免疫效果,為SVA和PRRSV的防控以及疫苗研發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與病毒 豬塞內(nèi)卡病毒(A/ZJ/2015株),由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所分離、鑒定,由華派生物技術(shù)(集團(tuán))股份有限公司鑒定、保管及供應(yīng)。倉鼠腎細(xì)胞(BHK-21),由華派生物技術(shù)(集團(tuán))股份有限公司質(zhì)管部保存。

1.1.2 主要試劑 SVA滅活疫苗由華派生物技術(shù)(集團(tuán))股份有限公司制備,MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自GIBCO;新生牛血清購自內(nèi)蒙古金源康生物工程材料有限公司;高效率逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自東洋紡(上海)生物科技有限公司;2×Taq PCR預(yù)混試劑購自天根生化科技(北京)有限公司;PBS緩沖液由華派生物技術(shù)(集團(tuán))股份有限公司實(shí)驗(yàn)室配制。

1.1.3 引物 PRRSV鑒定引物PRRSV-F/PRRSV-R及SVA鑒定引物SVA-F/SVA-R序列如表1所示,所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限合成,由華派生物技術(shù)(集團(tuán))股份有限公司保存。

表1 引物的序列Tab 1 Sequence of primers

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物的篩選 35～42日齡仔豬5頭,SVA抗原陰性、PRRSV抗原陽性,SVA抗體陰性(中和抗體效價(jià)小于1∶4);豬場半年內(nèi)未免疫PRRSV活疫苗。35～42日齡仔豬10頭,SVA、PRRSV抗原陰性,SVA抗體陰性(中和抗體效價(jià)小于1∶4)。

1.2.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組及免疫方案 如表2所示,A組為PRRS陽性組,B、C組為PRRS陰性組;A、B組免疫SVA滅活疫苗,每頭2.0 mL,C組為對(duì)照組,免疫相同體積生理鹽水,間隔2周后以同樣劑量加強(qiáng)免疫一次。

表2 動(dòng)物分組及免疫方案Tab 2 Animal grouping and immunization program

1.2.3 SVA中和抗體效價(jià)檢測 采集試驗(yàn)仔豬免疫后7 d、14 d、21 d、28 d的血液并分離血清,血清經(jīng)56 ℃、30 min滅活后進(jìn)行中和抗體效價(jià)測定。

將2倍系列稀釋的待檢血清加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每個(gè)血清樣品平行做4孔,50 μL/孔,之后每孔加50 μL含200 TCID50的SVA病毒液,置于37 ℃中和1 h;每孔加100 μL BHK-21細(xì)胞懸液(2×105/mL～3×105/mL),置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),72～96 h判定結(jié)果。同時(shí)設(shè)陰、陽性血清對(duì)照,病毒對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照;陰性血清與待檢血清同倍稀釋,陽性血清稀釋至32倍中和抗體效價(jià)。當(dāng)病毒對(duì)照組及陰性血清對(duì)照組均出現(xiàn)細(xì)胞病變4/4孔,細(xì)胞對(duì)照組及陽性血清對(duì)照組均出現(xiàn)細(xì)胞病變0/4孔時(shí),試驗(yàn)成立。以能抑制50%以上細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變的血清最高稀釋度的倒數(shù)判定為該血清抗體效價(jià)的滴度。

1.2.4 攻毒保護(hù)試驗(yàn) 免疫后28 d,用SVA病毒液(A/ZJ/2015株,F10代)進(jìn)行攻毒,頸部肌肉注射,4.0 mL/頭(108.8TCID50/mL)。試驗(yàn)豬攻毒后10 d內(nèi)四蹄中任一蹄或鼻鏡出現(xiàn)水皰或者潰瘍均判為發(fā)病,部分試驗(yàn)豬可能伴有精神沉郁、食欲差等癥狀。試驗(yàn)豬攻毒后10 d內(nèi)四蹄、鼻鏡均未出現(xiàn)水皰或者潰瘍,精神、食欲正常,如出現(xiàn)精神沉郁、食欲差等臨床癥狀,應(yīng)持續(xù)不超過2 d,即判為保護(hù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)動(dòng)物的篩選 將初步篩選的仔豬采集全血,提核酸并反轉(zhuǎn)錄后采用SVA鑒定引物SVA-F/SVA-R及PRRS鑒定引物PRRSV-F/PRRSV-R對(duì)仔豬進(jìn)行抗原檢測。如圖1所示,所有試驗(yàn)豬SVA陰性,A組5頭試驗(yàn)豬(泳道19-23)PRRSV全部陽性,其余全部PRRSV陰性,符合試驗(yàn)要求。將A組陽性血清樣本PCR擴(kuò)增測序后進(jìn)行同源性分析,結(jié)果顯示A組試驗(yàn)豬感染的PRRSV(將其命名為SC-PRRSV)與高致病性毒株GXNN1409、JXA1等親緣關(guān)系較近(圖2),判定A組PRRSV陽性豬為高致病性野毒感染。

M:Marker;1:SVA陰性對(duì)照;2-16:15頭試驗(yàn)豬樣品SVA檢測;17:SVA陽性對(duì)照;18:PRRSV陰性對(duì)照;19-33:15頭試驗(yàn)豬樣品PRRSV檢測;34:PRRSV陽性對(duì)照圖1 試驗(yàn)動(dòng)物篩選PCR鑒定結(jié)果Fig 1 PCR test result of experimental animal screening

圖2 SC-PRRSV系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析Fig 2 Phylogenetic tree analysis of SC-PRRSV

2.2 血清中和抗體效價(jià) 檢測所有試驗(yàn)豬免疫后7 d、14 d、21 d、28 d的血清中和抗體效價(jià),結(jié)果如表3所示,PRRS陽性組(A組)及對(duì)照組(C組)仔豬免疫后血清中和抗體效價(jià)均<1∶4,而PRRS陰性組(B組)仔豬免疫后21 d開始出現(xiàn)較高效價(jià),最高可達(dá)1∶512,免疫后28 d抗體水平較免疫后21 d開始下降,但大多數(shù)也維持在較高水平(1∶64～1∶256)。

表3 試驗(yàn)豬血清中和抗體效價(jià)結(jié)果Tab 3 Result of pig serum neutralizing antibody titer

2.3 攻毒保護(hù)情況 免疫后28 d對(duì)所有試驗(yàn)豬進(jìn)行攻毒,連續(xù)10 d觀察試驗(yàn)豬臨床癥狀。攻毒保護(hù)結(jié)果如表4所示,PRRS陽性組(A組)1頭仔豬攻毒后4 d蹄部開始出現(xiàn)水皰癥狀(圖3A),攻毒后6 d所有仔豬均發(fā)病;PRRS陰性組仔豬攻毒后連續(xù)10 d都未出現(xiàn)臨床癥狀(圖3B);對(duì)照組2頭仔豬攻毒后4 d蹄部開始出現(xiàn)水皰(圖3C),攻毒后6 d全部發(fā)病。

A:PRRS陽性組(A組);B:PRRS陰性組(B組);C:對(duì)照組(C組)圖3 SVA攻毒后蹄部病變圖Fig 3 Hoof lesion after SVA challenge

表4 試驗(yàn)豬攻毒保護(hù)結(jié)果Tab 4 Result of protection against virus challenge

3 討 論

疫苗免疫作為豬場防控各種病毒感染的有效手段之一備受重視,然而免疫失敗的案例仍屢見不鮮。豬疫苗免疫失敗的原因除了一些常見因素如疫苗本身免疫原性差、免疫方式錯(cuò)誤、母源抗體影響、飼養(yǎng)管理不科學(xué)外,PRRS等免疫抑制性疾病也是重要因素[16-17]。本試驗(yàn)對(duì)PRRS陽性豬和PRRS陰性豬免疫了相同劑量的SVA滅活苗,分別于首次免疫后7 d、14 d及加強(qiáng)免疫后7 d、14 d采集血清檢測中和抗體效價(jià),結(jié)果顯示免疫組5頭PRRS陽性豬所有血清均無中和抗體效價(jià),而5頭PRRS陰性豬中有1頭在首次免后14 d就開始出現(xiàn)效價(jià),加強(qiáng)免疫后所有健康豬抗體效價(jià)上升到較高水平,最高可達(dá)1∶512。攻毒保護(hù)結(jié)果與中和抗體效價(jià)結(jié)果呈正相關(guān),PRRS陽性組及對(duì)照組5頭試驗(yàn)豬全部發(fā)病,而PRRS陰性組試驗(yàn)豬達(dá)到5/5保護(hù)。PRRS陰性組仔豬的中和抗體效價(jià)結(jié)果及攻毒保護(hù)結(jié)果表明了該SVA滅活苗有良好的免疫原性,能夠?qū)VA感染提供免疫保護(hù)。PRRS陽性組免疫與PRRS陰性組相同批次,相同劑量的塞內(nèi)卡滅活苗時(shí),所有試驗(yàn)豬中和抗體效價(jià)均小于1∶4,并且不能產(chǎn)生免疫保護(hù),表明PRRS影響了SVA的抗體應(yīng)答。

本研究首次證明了PRRS會(huì)影響SVA滅活疫苗的免疫效果,有研究表明PRRS也會(huì)導(dǎo)致其它疫苗免疫效果的下降,如在陳鵬[14]等人2018年的研究中,證明了PRRS會(huì)導(dǎo)致商品化豬O型口蹄疫濃縮苗免疫合格率下降;在張艷娜[15]等人的研究中發(fā)現(xiàn)PRRS野毒感染會(huì)顯著降低豬瘟兔化弱毒疫苗的免疫效果。PRRS會(huì)降低其它疫苗的免疫效果對(duì)我們有很多啟示。首先,我們對(duì)于PRRS的日常監(jiān)控不可松懈,當(dāng)豬場存在病情或監(jiān)測到抗原時(shí),應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理,采取藥物等手段提高豬的免疫力后再進(jìn)行疫苗免疫。其次,制定合理的免疫程序也至關(guān)重要,雖然有部分實(shí)驗(yàn)表明同時(shí)免疫豬瘟疫苗與PRRSV活疫苗時(shí),免疫效力不會(huì)產(chǎn)生影響,甚至還具有誘導(dǎo)快速、增強(qiáng)和持久免疫反應(yīng)的優(yōu)勢,但PRRSV活疫苗是否會(huì)對(duì)其他疫苗的免疫反應(yīng)造成影響還不清楚[18-19]。最后,從疫苗的研發(fā)來看,這也對(duì)研制出安全有效、不影響其它疫苗免疫效果的PRRSV活疫苗提出了挑戰(zhàn)。