周 玲 唐梅文 劉文健 鄒起平

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃肝病科 (廣西 南寧,530000) 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院

肝細胞癌(HCC)是全球第五大常見惡性腫瘤,死亡率居第2位。且發(fā)病率正在持續(xù)增長,無論男性還是女性,發(fā)病率都比任何其他癌癥上升得更快。全球疾病負擔研究的一項系統(tǒng)分析表明,HCC的發(fā)病率和死亡率均居前10位癌癥之列,成人肝硬化死亡是HCC死亡的主要原因。肝癌的發(fā)生是一個多步驟且復(fù)雜的生物學(xué)過程,其中許多信號級聯(lián)發(fā)生改變,導(dǎo)致分子譜異質(zhì)化,并最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、進展和轉(zhuǎn)移[1]。且超過一半的肝癌患者在確診時已處于晚期,只有15%的患者適合根治性治療,由于缺乏診斷的生物標志物,患者5年生存率仍然很低,不超過20%[2]。近年來,許多研究表明,多種基因和細胞通路參與了HCC的發(fā)生和發(fā)展[3]。為更好地揭示HCC與銅死亡之間的聯(lián)系,本研究旨在對多組數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)研究,通過生物信息學(xué)分析確定其對HCC的預(yù)后價值和治療意義。HCC數(shù)據(jù)和臨床信息來自癌癥基因組圖譜(TCGA),我們在癌變樣本和正常樣本之間鑒定HCC相關(guān)的差異表達基因(DEG),并先后進行GO富集分析、KEGG通路分析、生存分析和免疫功能相關(guān)分析,以探索與HCC密切相關(guān)的關(guān)鍵基因和通路。為探究HCC發(fā)生、發(fā)展過程中的分子機制及可用于臨床診療的分子生物學(xué)靶點提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)的獲取與處理 數(shù)據(jù)來源從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)下載HCC的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及相應(yīng)的患者臨床信息,其中患者的臨床信息主要包括生存時間、生存狀態(tài)、年齡、性別、等級、階段、T階段、N階段和M階段。我們初步篩選了424例患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),其中正常50例,腫瘤374例。

1.2 銅死亡相關(guān)的LncRNAs的篩選 本文通過R軟件構(gòu)建LncRNAs和銅死亡相關(guān)基因之間的共表達,即為銅死亡相關(guān)的LncRNAs。其篩選標準為:相關(guān)系數(shù)r≥0.4,P<0.001,篩選出的結(jié)果用桑基圖進行可視化。

1.3 銅死亡預(yù)后相關(guān)LncRNA模型的構(gòu)建 首先通過單因素Cox回歸分析、Kaplan-Meier生存分析和無進展生存期得到與HCC預(yù)后相關(guān)的銅死亡LncRNA(篩選的標準為P<0.05)。初步篩選與HCC患者預(yù)后有關(guān)的LncRNA;再次進行LASSO回歸,進一步篩選分析以減少數(shù)據(jù)的過度擬合,篩選關(guān)鍵且與銅死亡相關(guān)的LncRNA,LASSO回歸使用交叉驗證進行參數(shù)的選擇,并繪制LASSO回歸系數(shù)譜,最后進行多因素Cox回歸分析建立對HCC預(yù)后有價值的銅死亡相關(guān)LncRNA模型并以列線圖形式展示。根據(jù)多因素Cox回歸分析構(gòu)建LncRNA的風險評分公式為:風險評分=∑ (相應(yīng)系數(shù)×LncRNA的表達量)。

1.4 預(yù)后模型的驗證 通過Kaplan-Meier分析收集多個數(shù)據(jù)集中高低分線組之間的生存曲線,并繪制Kaplan-Meier曲線1、3、5 年的受試者操作特征(ROC)曲線、風險熱圖以及風險打分等評估該模型預(yù)測患者生存的能力,然后將風險文件與臨床數(shù)據(jù)合并后進行獨立預(yù)后分析,證明該模型是否可以獨立于其他臨床性狀,作為HCC患者的獨立預(yù)后因子,最后通過臨床因素的風險評分對臨床數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.5 GO和KEGG富集分析 GO富集分析涵蓋生物學(xué)的三個方面:生物過程(BP)、分子功能(MF)和細胞成分(CC)。使用KEGG對交集基因進行信號通路富集分析。在本研究中通過org.Hs.eg.db R語言包獲得每個DEG的Entrez-ID后,進行GO和KEGG分析,并使用clusterprofiler、enrichment plot、ggplot2和circize R語言包對富集結(jié)果進行可視化。

1.6 腫瘤突變負荷(TMB)差異分析和生存分析 我們計算了每位患者的TMB,并將總患者按TMB閾值中值分為低TMB組和高TMB組,我們發(fā)現(xiàn)低TMB組腫瘤突變負荷高于高TMB組,隨后用R語言包分析HCC患者TMB差異和生存相關(guān)在高低風險組之間是否具有差異,進行可視化。

1.7 篩選疾病的潛在藥物 通過“pRRophetic”R語言包計算藥物的敏感性,可以將藥物的敏感性分為高低風險兩組,然后將風險文件與藥物敏感性的結(jié)果合并進行藥物敏感性分析,進行可視化。

2 結(jié)果

2.1 銅死亡預(yù)后相關(guān)LncRNA模型的構(gòu)建 通過基因共表達分析,共得到375個銅死亡相關(guān)LncRNA,并以?；鶊D展示(圖1A)。單因素Cox回歸分析(過濾標準P<0.05)初步篩選出50個HCC患者預(yù)后相關(guān)的LncRNA,并森林圖形式展示(圖1B)。再將初篩變量進行LASSO回歸進一步篩選分析以減少數(shù)據(jù)的過度擬合,篩選出對預(yù)后更有價值的銅死亡相關(guān)的LncRNA,并繪制LASSO回歸(圖2C)及交叉驗證(圖2D)。然后進行多因素Cox回歸分析篩選出4個與HCC患者有預(yù)后價值的銅死亡相關(guān)LncRNA(MKLN1-AS、AC073254.1、WAC-AS1、KDM4A-AS1)。繪制4個與銅死亡相關(guān)的LncRNA相關(guān)性熱圖(圖2E) 用4個銅死亡相關(guān) LncRNA構(gòu)建HCC預(yù)后預(yù)測模型。風險評分方程:風險評分=(MKLN1-AS×1.287 682 473 548 62)+(AC073254.1×1.515 551 816 468 45)+(WAC-AS1×0.482 971 564 313 088)+(KDM4A-AS1×1.300 495 879 398 59)。

圖1 HCC中銅死亡相關(guān)LncRNA

圖2 對HCC預(yù)后更有價值的銅死亡相關(guān)LncRNA

2.2 預(yù)后模型的驗證 首先對模型中的50個LncRNA進行單因素回歸分析并繪制生存曲線,其次對高低風險兩組進行生存差異分析。同時為驗證我們構(gòu)建的模型是否適用于不同臨床分組的患者,我們將患者分為早期(圖3A)和晚期(圖3B),說明我們構(gòu)建的模型不但適用于早期的患者也適用于晚期的患者。通過Kaplan-Meier生存曲線(圖4A)、風險評分圖(圖4B～D)、生存狀態(tài)圖(圖5A～C)、風險熱圖(圖6A～C)結(jié)果顯示隨著風險評分的增加,患者的死亡率逐步上升,低風險組的總生存期明顯優(yōu)于高風險組,高低風險兩組明顯存在生存差異(P<0.001),風險評分對HCC患者的預(yù)后有顯著影響。然后患者1、3、5年ROC曲線下面積分別為0.738、0.684、0.640(圖7A、B)。說明該模型具有較好的預(yù)測生存能力。為了更好探究預(yù)后模型的臨床價值,對風險評分與患者的臨床數(shù)據(jù)(年齡、性別、分級、分期)進行單因素和多因素獨立預(yù)后分析,單因素Cox回歸顯示年齡、性別、分級、分期及總風險評分是獨立預(yù)后指標,而多因素獨立預(yù)后分析顯示年齡、性別、分級、分期及風險評分以獨立于其他臨床因素,作為HCC患者的獨立預(yù)后因子。并且將風險評分納入臨床因素,繪制HCC患者的生存列線圖,綜合評分為527。1、3、5年的校準曲線分別是0.946、0.867、0.794,構(gòu)建的模型的C-index是最大的(圖9A～C)。最后,使用預(yù)后模型LncRNA、銅死亡LncRNA及 銅死亡基因構(gòu)建的PCA分析表明:參與模型構(gòu)建的LncRNA可以區(qū)分高低風險組的患者(圖10A～D)。

圖3 不同分期HCC患者生存差異分析

圖4 高低風險組HCC患者生存曲線及風險評分分析

圖5 高低風險組HCC患者生存狀態(tài)分析

圖6 銅死亡分型患者風險熱圖

圖7 風險評分對HCC患者預(yù)后的影響

2.3 GO和KEGG富集分析 為了進一步分析與風險評分相關(guān)的生物學(xué)功能和途徑,對高低風險兩組間的DEGs進行GO和KEGG分析。GO富集分析結(jié)果顯示銅死亡相關(guān)基因參與BP中細胞化學(xué)應(yīng)激和氧化應(yīng)激反應(yīng),在CC方面主要參與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶復(fù)合體和次級溶酶體的構(gòu)成,在MF方面與NADPH氧化酶活性有關(guān)(圖8A、B)。KEGG分析顯示高表達基因主要涉及銅死亡、癌細胞碳代謝、5-羥色胺能突觸和VEGF信號通路等(圖9A、B)。

圖8 HCC患者銅死亡相關(guān)基因GO富集分析

圖9 HCC患者銅死亡相關(guān)基因KEGG分析

2.4 TMB差異分析和生存分析 為了進一步驗證高低風險組患者的生存是否具有差異,將患者分為高風險組和低風險組,對兩組進行生存差異分析,同時我們可以看到低風險組患者TMB更高(圖10A)。通過TMB生存分析比較高低突變負荷組之間患者的生存是否具有差異就可以得到這樣的生存曲線,將TMB與患者的風險進行聯(lián)合的生存分析,我們就可以得到聯(lián)合的生存曲線(圖10B、C),可以說明高低風險組患者的生存具有差異及TMB與患者的預(yù)后相關(guān)。

圖10 高低風險組HCC患者TMB差異和生存分析

2.5 篩選疾病的潛在藥物 為驗證高低風險兩組患者之間藥物敏感性是否具有差異及篩選治療HCC的潛在藥物,將患者分為高低風險兩組,通過pRRophetic R語言包對藥物敏感性進行循環(huán),得到藥物的敏感性,結(jié)果表明高風險組患者對藥物更敏感,并從93個藥物中篩選出4個最敏感藥物作為潛在治療藥物的選擇(圖11A～D)。

圖11 高低風險組HCC患者藥物敏感性差異分析

3 討論

HCC是目前我國第4位常見惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因,嚴重威脅我國人民的生命和健康。原發(fā)性肝癌(PLC)主要包括HCC、肝內(nèi)膽管癌(ICC)和混合型肝細胞癌-膽管癌(cHCC-CCA)3種不同病理學(xué)類型,三者在發(fā)病機制、生物學(xué)行為、病理組織學(xué)、治療方法以及預(yù)后等方面差異較大,其中HCC占75%～85%、ICC占10%～15%[4]。HCC是一個重大的全球健康挑戰(zhàn),全球發(fā)病率穩(wěn)步上升[5],最常見的原因是慢性感染乙型肝炎病毒,世界上超過一半的HCC是由慢性乙型肝炎引起的[6]。HBV與HCC形成的關(guān)系很復(fù)雜。到目前為止HBV導(dǎo)致HCC的發(fā)病機制包括:HBV DNA整合到宿主基因組[7]、HBV編碼蛋白對癌基因的反式激活、HBV誘導(dǎo)的慢性炎癥和肝細胞再生等[8]。而且,每年仍然有都有大量肝硬化患者感染肝炎病毒進展為HCC,這大大縮短了這些患者的壽命。雖然已經(jīng)進行了許多關(guān)于HCC的研究,然而,HCC的早期診斷和及時治療仍然具有挑戰(zhàn)性[9]。所以,仍然需要探索肝癌早期篩查方法和治療的靶點,為HCC治療提供了新的治療方案。

銅死亡的提出,為我們探索銅死亡相關(guān)基因?qū)CC患者的治療增添一種新的治療手段方案。銅死亡是近期新發(fā)現(xiàn)的一種細胞死亡形式,其特征是細胞內(nèi)游離銅積累,蛋白質(zhì)脂化導(dǎo)致細胞毒性應(yīng)激,從而誘導(dǎo)細胞死亡[10]。銅穩(wěn)態(tài)的遺傳變異導(dǎo)致危及生命的疾病[11],并且銅離子載體[12]和銅螯合劑[13-15]都被認為是抗癌劑。此外,銅誘導(dǎo)的細胞死亡也可能被天然合成銅離子載體的微生物利用,并且表現(xiàn)出抗菌活性,是銅通過靶向脂?；h(huán)蛋白誘導(dǎo)細胞死亡[10]。研究表明,與健康人相比,癌癥患者的血清和腫瘤組織中的銅含量都明顯升高[16,17]。雖然銅平衡失調(diào)可能引發(fā)細胞毒性,但細胞內(nèi)銅水平的改變可能影響癌癥的發(fā)展和惡化。我們的研究具有多重優(yōu)勢。首先,這項研究是第一個在銅死亡相關(guān)基因的基礎(chǔ)上開發(fā)預(yù)后模型的研究,細胞死亡是腫瘤研究的一個密集領(lǐng)域,已被證明是癌癥起源和發(fā)展的基礎(chǔ)。銅死亡是一種新型的細胞死亡,與任何已知的細胞死亡機制不同,并且依賴于線粒體呼吸。這種不同尋常的機制可能會為癌癥的治療帶來新的解決方案。此外,與大多數(shù)主要關(guān)注總生存期的預(yù)后模型相比,我們的研究還考慮了無進展生存期。無進展生存期增益可能表明腫瘤負荷減輕和癥狀緩解,特別是對于晚期癌癥患者[18,19]。因此,本文針對銅死亡與HCC患者預(yù)后相關(guān)發(fā)病機制的研究進展,并確定更多的預(yù)后相關(guān)藥物治療。

本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫中得到375個與銅死亡相關(guān)LncRNA,根據(jù)相關(guān)分析結(jié)果和獨立預(yù)后分析結(jié)果進一步篩選出了4個與HCC預(yù)后相關(guān)的銅死亡LncRNA。通過生存分析將所有患者分為高風險組和低風險組,采用Kaplan-Meier生存曲線分析兩組的生存情況,結(jié)果顯示患者的死亡率逐步上升,低風險組的總生存期明顯優(yōu)于高風險組(P<0.001),風險評分對HCC患者的預(yù)后有顯著影響。本文通過ROC曲線分析結(jié)果顯示,預(yù)后風險模型判斷HCC患者1、3和5年ROC曲線下的面積分別為0.738、0.684、0.640;C-index曲線分析結(jié)果顯示,預(yù)后風險模型判斷HCC患者1、3和5年校準曲線分別為0.946、0.867、0.794。這表明本研究構(gòu)建的銅死亡相關(guān)LncRNA預(yù)后風險模型可較準確地評估HCC患者的預(yù)后情況。本研究列線圖分析結(jié)果顯示,通過患者臨床特征和風險進行評分,可準確評估患者的總體生存率,這些差異基因在高低風險組的生存期,無進展生存期、免疫相關(guān)功能分析、TMB生存率及藥物敏感性是否是有差異的,對HCC患者的臨床管理有一定的參考價值。根據(jù)我們的進一步分析,我們發(fā)現(xiàn)這4個基因與HCC預(yù)后密切相關(guān)。關(guān)于這4個基因,我們發(fā)現(xiàn)它們或多或少與病毒感染、細胞增殖和腫瘤發(fā)生有關(guān)。MKLN1-AS極大地抑制了HCC細胞在體外和體內(nèi)的轉(zhuǎn)移和生長[20]。它通過促進細胞增殖、遷移和侵襲,在體外抑制細胞凋亡,在HCC進展中發(fā)揮著致癌作用。此外,MKLN1-AS下調(diào)導(dǎo)致體內(nèi)HCC腫瘤生長減少?？偟膩碚f,目前結(jié)果表明,MKLN1-AS作為癌基因在HCC中起著刺激作用[21]。WAC-AS1可以通過在缺氧條件下抑制糖酵解來抑制HCC細胞增殖[22]。它的下調(diào)抑制了HBV復(fù)制和自噬。它參與其他癌癥的發(fā)生,其中包括卵巢癌[23]。KDM4A-AS1通過miR-411-5p/KPNA2/AKT軸促進了肝細胞癌的生長和轉(zhuǎn)移[24]。AC073254.1目前尚未被研究發(fā)現(xiàn),這將為我們進一步研究提供了新的治療靶點,需要進一步研究證明及其潛在的臨床價值,為HCC患者提供新的治療思路以及有待進一步需要更多研究人員對其進一步探索。這些基因?qū)BV感染和HCC形成的機制還需要進一步探索。

這項科學(xué)研究探索了可以預(yù)測和分析HCC的銅死亡生物標志物,有助于癌癥治療探索。首先,我們證明了該特征在癌細胞突變、潛在藥物治療的選擇和預(yù)測患者生存時間方面的潛在臨床價值。其次,該特征也可能在其他癌癥中具有良好的預(yù)測價值,需要進一步驗證。此外,這項研究有幾個局限性。該預(yù)后模型采用了TCGA數(shù)據(jù)庫的回顧性數(shù)據(jù),需要進一步的前瞻性研究來證明其臨床價值。更多的基因表達及其與HCC患者臨床特征的關(guān)系有待研究。未來應(yīng)該揭示銅死亡的潛在機制。通過TCGA數(shù)據(jù)庫挖掘到與HCC預(yù)后相關(guān)的4個銅死亡基因并構(gòu)建了銅死亡相關(guān)LncRNA的預(yù)后風險模型,可對HCC患者的預(yù)后進行準確評估,該模型中的銅死亡基因為HCC靶向治療策略提供了新的治療靶點,這將為HCC患者的治療和預(yù)后風險評估提供新的治療思路。