張璐懿 石春霞 張丹眉 龔作炯

武漢大學(xué)人民醫(yī)院感染科 (湖北 武漢,430061)

急性肝衰竭(ALF)是一種死亡率很高的罕見的臨床疾病[1],其病理變化常表現(xiàn)為廣泛的肝臟壞死和細(xì)胞凋亡。在過去的40年里,由于重癥醫(yī)學(xué)專家醫(yī)療管理的改進(jìn)和緊急肝移植技術(shù)的進(jìn)步,ALF患者的發(fā)病率和死亡率都有所下降。此外,人工肝治療可以為自發(fā)性肝臟再生或緊急肝移植爭取時間[2]。然而,人工肝治療技術(shù)仍待優(yōu)化,其是否能提高ALF患者的長期生存率仍需進(jìn)一步驗(yàn)證[3]。另外,肝移植高額費(fèi)用和缺乏供體等一系列問題仍然存在。因此,ALF的治療仍然是一個嚴(yán)峻的臨床問題。

自噬過程在維持人類健康方面至關(guān)重要,最基本作用就是適應(yīng)新陳代謝的需要。肝臟是人體的一個重要代謝器官,新陳代謝和能量供應(yīng)在肝臟疾病期間對肝細(xì)胞的生存起著重要作用。UNC-51樣激酶1(ULK1)是一種重要的自噬分子,與肝病密切相關(guān)。ULK1的磷酸化可以保護(hù)細(xì)胞免受脂肪毒性的影響[4]。自噬和肝臟疾病的代謝之間存在著密切的聯(lián)系。

組蛋白去乙酰化酶(HDACs)是表觀遺傳酶,在基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用[5]。細(xì)胞代謝和HDACs之間的相互作用可以影響許多生物過程。組蛋白去乙?；?(HDAC1)和組蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)屬于Ⅰ類[6,7]。HDAC1可以對AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)進(jìn)行去乙酰化和乙?；{(diào)節(jié),AMPK調(diào)節(jié)人肝細(xì)胞的脂質(zhì)代謝和能量代謝[8]。HDAC2抑制劑CAY10683可以通過線粒體凋亡途徑在ALF中保護(hù)肝臟;抑制HDAC1/2的活性可以誘導(dǎo)自噬,自噬蛋白的功能喪失使HDAC抑制劑失去了其保護(hù)作用[9,10]。因此,HDAC2與代謝和自噬之間都有一定的聯(lián)系。本研究探討HDAC2抑制劑CAY10683在ALF小鼠模型中對小鼠肝臟自噬和代謝的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 C57BL/6小鼠購自湖南斯萊克景達(dá)公司,飼養(yǎng)于武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心的無特定病原體級(SPF)環(huán)境中。選取6～8周齡且體重20～25 g的雄性小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有動物操作程序均已獲得武漢大學(xué)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物福利倫理審查委員會的批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑 D-氨基半乳糖(D-Gal)和脂多糖(LPS)購于Sigma公司,CAY10683和MRT68921購于Selleck公司,抗ULK1抗體和抗β-actin抗體購于Cell Signaling Technology公司,抗蘋果酸脫氫酶1(MDH1)購于Proteintech公司,葡萄糖試劑盒購于索萊寶公司,丙酮酸試劑盒和乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒購于Elabscience公司,乳酸試劑盒購于南京建成公司。

1.3 動物模型建立及處理 將C57BL/6小鼠飼養(yǎng)在溫度和濕度適應(yīng)的SPF環(huán)境下,自由飲食,待小鼠適應(yīng)環(huán)境后,選取40只小鼠隨機(jī)分為5組,每組8只:正常組、模型組、CAY10683組、MRT68921組和CAY10683/MRT68921聯(lián)合組。CAY10683組腹腔注射CAY10683 (3 mg/kg),MRT68921組腹腔注射MRT68921(5 mg/kg),CAY10683/MRT68921聯(lián)合組腹腔注射CAY10683(3 mg/kg)和MRT68921(5 mg/kg),2 h后模型組、CAY10683組、MRT68921組和CAY10683/MRT68921聯(lián)合組均腹腔注射D-Gal(400 mg/kg)和LPS(100 μg/kg)。24 h后氣體麻醉小鼠,摘除眼球取血,取血后頸椎脫臼法處死小鼠,快速分離肝組織,取一部分肝組織于多聚甲醛和電鏡固定液中固定,另一部分于液氮速凍30～60 s后放入凍存管中立即置于深低溫冰箱保存,用于后續(xù)檢測。

1.4 小鼠血清肝功能指標(biāo)檢測 采用全自動生化分析儀檢測小鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的水平。

1.5 小鼠肝組織蘇木精-伊紅染色(HE)觀察 肝組織固定完成后,包埋于石蠟中,切片,HE染色后封片,于正置顯微鏡下觀察,進(jìn)行圖像采集。

1.6 小鼠肝組織透射電子顯微鏡觀察 用手術(shù)刀將浸在電鏡固定液中的組織切割成1 mm3的小組織塊,再將其轉(zhuǎn)移至裝有新的電鏡固定液的離心管繼續(xù)固定,4%保存,完成電鏡前染色和處理后,于透射電子顯微鏡下觀察,進(jìn)行圖像采集。

1.7 小鼠肝組織蛋白與生化檢測 清洗并稱重肝組織,充分研磨裂解后4℃離心取上清液,部分用于蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測組織中ULK1和MDH1的相對含量,加蛋白上樣緩沖液后混勻煮沸;另一部分用于生化檢測,按照試劑盒說明書檢測其中的葡萄糖、丙酮酸、乳酸和LDH的含量。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肝組織形態(tài)及肝功能情況 正常組小鼠肝組織中的細(xì)胞排列整齊,無炎細(xì)胞浸潤,而模型組小鼠肝組織中無炎細(xì)胞浸潤與淤血,CAY10683降低了肝組織損傷的程度,而MRT68921加重了肝臟損傷,CAY10683對MRT68921有一定的拮抗作用,見圖1A。各組小鼠ALT、AST水平見圖1B、C。與正常組相比,模型組小鼠血清中ALT和AST水平大幅度增加(P<0.05);與模型組相比,CAY10683組小鼠ALT和AST水平較低(P<0.05),MRT68921組小鼠ALT和AST水平較高(P<0.05);CAY10683/MRT68921聯(lián)合組小鼠ALT和AST水平低于CAY10683組(P<0.05),高于MRT68921組(P<0.05)。

與正常組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05;與模型組、CAY10683組和MRT68921組比較,&P<0.05

2.2 各組小鼠肝細(xì)胞自噬情況 正常組小鼠細(xì)胞器清晰,線粒體無腫脹,模型組小鼠線粒體腫脹明顯。在相同視野大小下,正常組小鼠的自噬小體數(shù)目較多,模型組的自噬小體數(shù)目較少。見圖2。

圖2 小鼠肝組織電鏡下形態(tài)(黑色箭頭指向自噬小體)

2.3 各組小鼠肝組織ULK1和MDH1相對表達(dá)量及糖代謝相關(guān)指標(biāo)含量 與正常組相比,模型組小鼠肝組織中ULK1和MDH1的蛋白表達(dá)水平降低;與模型組相比,CAY10683組和CAY10683/MRT6892組小鼠肝組織ULK1和MDH1的蛋白表達(dá)水平升高,MRT68921組小鼠ULK1和MDH1的蛋白表達(dá)水平降低,見圖3A。與正常組相比,模型組小鼠肝組織中葡萄糖、丙酮酸、乳酸和LDH的水平升高;與模型組相比,CAY10683組和CAY10683/MRT6892組小鼠葡萄糖、丙酮酸、乳酸和LDH達(dá)水平降低,MRT68921組小鼠葡萄糖、丙酮酸、乳酸和LDH的水平升高,見圖3B。

與正常組比較,# P<0.05;與D-Gal/LPS模型組比較,* P<0.05)

3 討論

ALF發(fā)病迅速,死亡率高。D-Gal/LPS處理小鼠是一種經(jīng)典的ALF造模方法。之前的研究發(fā)現(xiàn),HDAC2抑制劑CAY10683對ALF小鼠具有保護(hù)作用[11]。在本研究中,HE病理和ALT、AST結(jié)果證實(shí)了其保護(hù)作用。

HDAC2與各種肝臟疾病有關(guān)。抑制HDAC2有助于預(yù)防非酒精性脂肪性肝炎[12]。HDACs過量表達(dá)可導(dǎo)致組蛋白乙?；牟黄胶夂娃D(zhuǎn)錄因子的改變,導(dǎo)致特定基因的異常抑制,從而參與疾病的發(fā)生和發(fā)展[13]。HDACs與自噬也有聯(lián)系,HDACs抑制劑通過增加組蛋白乙酰化和乙酰-CoA的表達(dá)來增加機(jī)體壽命,細(xì)胞質(zhì)乙酰CoA合成酶2核轉(zhuǎn)位可最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子EB的表達(dá),導(dǎo)致溶酶體生物生成和自噬增加[14]。HDACs抑制劑可抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路,導(dǎo)致自噬激活[15]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),ULK1基因表達(dá)與HDAC2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[11]。本研究也證明了HDAC2抑制劑CAY10683在ALF小鼠模型中對自噬的激活。

自噬是一個進(jìn)化上保守的應(yīng)激反應(yīng)過程,它將多余的或有潛在危險的細(xì)胞內(nèi)容物,如受損的線粒體或者入侵的病原體運(yùn)送到自噬體中,并最終將他們送到溶酶體中降解[16]。自噬體可以通過電子顯微鏡進(jìn)行成像,不同組的肝臟樣本中自噬水平可以通過相同大小視野內(nèi)的自噬小體數(shù)目進(jìn)行估計(jì)。圖2在一定程度上說明了各組小鼠肝臟內(nèi)的自噬水平情況。ULK1是自噬的起始,其蛋白含量可以說明自噬水平的高低。CAY10683可以提高ALF小鼠中的自噬水平,CAY10683/MRT68921聯(lián)合使用也在一定程度上提高了ALF小鼠的自噬水平,但是MRT68921降低了其自噬水平,因此,CAY10683可能可以拮抗MRT68921的作用,提高ALF小鼠中的自噬水平。

自噬最基本的作用是適應(yīng)代謝的需要,葡萄糖代謝是人體內(nèi)重要的能量供應(yīng)途徑。糖酵解和氧化磷酸化(OXPHOS)是葡萄糖代謝的兩個重要過程。糖酵解產(chǎn)生丙酮酸,丙酮酸可被LDH轉(zhuǎn)化為乳酸,該過程在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)生,僅能產(chǎn)生少量能量;而當(dāng)丙酮酸氧化生成乙酰CoA,參與三羧酸循環(huán)時,就能在線粒體中產(chǎn)生大量的能量[17]。OXPHOS的功能是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的能量轉(zhuǎn)換,OXPHOS的過程是在各種酶的幫助下,從營養(yǎng)物質(zhì)代謝過程中產(chǎn)生的NADH或FADH2中獲取還原當(dāng)量,并將其轉(zhuǎn)移到O2中產(chǎn)生水[18]。MDH1是一種細(xì)胞質(zhì)的蘋果酸脫氫酶,主要催化草酰乙酸鹽氫化還原為蘋果酸鹽,MDH1對OXPHOS是必不可少的,其表達(dá)水平與組織中的OXPHOS水平密切相關(guān)[19]。之前肝細(xì)胞損傷研究中發(fā)現(xiàn),自噬水平的增加可以提高肝細(xì)胞內(nèi)的MDH1水平[20]。本研究中,CAY10683處理后,可能由于自噬水平的提高,ALF小鼠肝組織中MDH1的含量增加,而MRT68921組小鼠MDH1含量則有所下降。一項(xiàng)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究指出,當(dāng)OXPHOS不足以為神經(jīng)元提供所需的ATP時,增加糖酵解將有助于緩解能量不足,維持神經(jīng)元的緊急能量需求[21]。在本研究中,ALF模型小鼠中的OXPHOS效率下降,導(dǎo)致糖酵解的能量需求更大。與D-Gal/LPS組相比,用MRT68921處理的小鼠肝組織內(nèi)有更高的葡萄糖含量,產(chǎn)生更多的丙酮酸,并且由于氧化能力不足,產(chǎn)生更多的乳酸,LDH的活性增加。

雖然糖酵解可以暫時提供一些能量,但最好的解決辦法是恢復(fù)細(xì)胞的OXPHOS。OXPHOS系統(tǒng)位于線粒體中,線粒體被稱為細(xì)胞的動力室,產(chǎn)生細(xì)胞所需的大部分能量和ATP[22]。線粒體自噬是保證線粒體質(zhì)量的一個重要途徑,其本質(zhì)是一種選擇性的自噬降解,可以清除功能失調(diào)和多余的線粒體以維持能量平衡[23]。當(dāng)自噬水平提高時,線粒體的質(zhì)量在一定意義上得到改善。線粒體的質(zhì)量提升一定程度上可恢復(fù)OXPHOS,改善能量供應(yīng),實(shí)現(xiàn)了對受損肝臟的保護(hù)作用。在本研究中,與D-Gal/LPS組相比,用CAY10683處理增加了肝組織自噬水平,其葡萄糖含量更低,產(chǎn)生的丙酮酸更少,而且由于氧化效率更高,產(chǎn)生的乳酸更少,LDH的活性也下降了,而用自噬抑制劑MRT68921處理的組則相反,CAY10683拮抗了MRT68921的作用。

在本研究ALF小鼠模型中,HDAC2抑制劑CAY10683提高了肝組織內(nèi)自噬蛋白ULK1水平和代謝酶MDH1水平,拮抗自噬抑制劑MRT68921的作用,改善了代謝環(huán)境,對肝臟起到了一定的保護(hù)作用。HDAC2抑制劑CAY10683可能可以通過增強(qiáng)組織內(nèi)自噬水平,改善組織內(nèi)代謝環(huán)境以提供更好的能量供應(yīng),從而對小鼠肝臟起到保護(hù)作用。HDAC2抑制劑的作用對ALF的治療提供了一個可行的方向。