閆會(huì)君 齊雙玉 賀紅晶 崔琳琳 許丙輝

1.衡水市人民醫(yī)院肝膽胰外科 (河北 衡水,053000) 2.衡水市第四人民醫(yī)院 腦電圖科

肝纖維化是一種慢性肝損傷,主要由乙型和丙型肝炎病毒慢性感染、過量飲酒、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、自身免疫性肝病和遺傳性疾病引起,以肝彌漫性纖維化、彌漫性炎癥、再生結(jié)節(jié)、假小葉等是其主要特征[1]。流行病學(xué)研究表明,肝纖維化是發(fā)生肝細(xì)胞癌(HCC)的最大危險(xiǎn)因素,80%～90% HCC患者確診時(shí)具有肝纖維化[2],對(duì)肝纖維化向HCC進(jìn)展進(jìn)行干預(yù)可有效降低HCC發(fā)生率[3],因此尋找與肝纖維化進(jìn)展為HCC具有密切相關(guān)性的生物標(biāo)志物是研究重點(diǎn)。Munc18-1相互作用蛋白3(Mint3)是廣泛存在于全身各種組織中的一種參與膜蛋白信號(hào)傳導(dǎo)與運(yùn)輸?shù)亩嘟Y(jié)構(gòu)域蛋白,被稱為缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)的激活劑[4],其可通過激活癌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的HIF-1,促進(jìn)糖酵解產(chǎn)生ATP[5],且研究證實(shí)Mint3可在體外實(shí)驗(yàn)中通過細(xì)胞-細(xì)胞接觸依賴的方式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)[6]。但Mint3在肝纖維化向HCC的進(jìn)展過程中的作用尚未見相關(guān)報(bào)道。因此本研究通過對(duì)肝纖維化患者進(jìn)行穿刺活檢定期監(jiān)測(cè)其肝組織內(nèi)Mint3表達(dá),長(zhǎng)期隨訪肝纖維化患者HCC發(fā)病率與死亡率,旨在為肝纖維化進(jìn)展為肝癌找到新的阻斷方法。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 以2018年1月至2019年1月因肝纖維化住院需行肝穿刺活檢的230例患者為研究對(duì)象,男性149例,女性81例;年齡45～70歲,平均(46.72±11.30)歲。纖維化分期S0、S1、S2、S3、S4期分別有5、30、98、79、18例。對(duì)研究對(duì)象定期監(jiān)測(cè)Mint3表達(dá)情況,以病理診斷或者兩種增強(qiáng)影像學(xué)提示為肝癌,截至2022年12月以是否發(fā)生肝癌分為兩組:發(fā)生肝癌組(82例)、未發(fā)生肝癌組(148例)。其中發(fā)生肝癌組根據(jù)患者是否死亡分為肝癌死亡組(47例)肝癌存活組(35例)。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):①符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015 年版)》[7]中肝纖維化診斷標(biāo)準(zhǔn),包括慢性病毒性肝炎、自身免疫性肝病、酒精性肝病等所致的肝纖維化患者;②入院需進(jìn)行肝穿刺確定病情進(jìn)展的患者;③臨床資料完整;④依從性較好;⑤無其他惡性腫瘤;⑥隨訪滿3年。排除標(biāo)準(zhǔn):①既往診斷為肝癌、肝衰竭或肝移植者;②合并血液系統(tǒng)疾病患者;③合并肝臟血管畸形患者;④合并精神疾病患者;⑤合并自身免疫疾病患者;⑥中途退出研究者及臨床資料不全者。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批號(hào):201802025),研究對(duì)象及家屬簽署知情同意書。

1.3 研究方法

1.3.1 隨訪方法 基線日期為患者入院診斷為肝纖維化的時(shí)間,隨訪3年,觀察終點(diǎn)為確診為肝癌或隨訪時(shí)間滿3年及隨訪期間死亡,以患者隨訪結(jié)束前或死亡前最后一次血液檢測(cè)為截至日期。每6～12個(gè)月抽取患者靜脈監(jiān)測(cè)Mint3水平,常規(guī)進(jìn)行肝功能檢查和甲胎蛋白(AFP)檢查。HCC診斷主要依據(jù)為活檢病理學(xué)檢查,若組織學(xué)檢查不具有診斷性,根據(jù)AFP>20 μg/L聯(lián)合影像學(xué)特征進(jìn)行診斷。

1.3.2 肝組織活檢 檢測(cè)患者血小板計(jì)數(shù)、凝血酶原活動(dòng)度、凝血酶原時(shí)間、血小板計(jì)數(shù)等指標(biāo),確定患者符合肝穿刺活檢適應(yīng)證后,在超聲定位下通過穿刺槍行肝臟組織穿刺術(shù),取肝組織10 mm×1 mm,10%福爾馬林固定后送病理檢查,確定患者是否發(fā)生肝癌。

1.3.3 免疫組化檢測(cè)組織內(nèi)Mint3 肝組織常規(guī)脫水處理,石蠟包埋后切片,后進(jìn)行Mint3免疫組化染色,PBS代替一抗染色作為陰性對(duì)照組。免疫組化通過Leica Bond Max自動(dòng)免疫組化儀完成,多聚賴氨酸處理玻片,步驟如下:二甲苯進(jìn)行切片脫石蠟處理,梯度乙醇進(jìn)行脫水處理;0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液修復(fù)Mint3,時(shí)長(zhǎng)為20 min,后Water buffer進(jìn)行3次洗滌;切片內(nèi)加入30 g/L過氧化氫甲醇溶液,避光15 min后用PBS洗滌3次,每次時(shí)長(zhǎng)為5 min;加入山羊血清工作液(在37℃條件下);添加一抗后孵育過夜,PBS沖洗3次,每次時(shí)長(zhǎng)為10 min;后加入二抗,孵育30 min(在37℃條件下)。PBS沖洗3次,每次時(shí)長(zhǎng)為5 min;辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素滴加,孵育30 min(在37℃條件下),PBS沖洗3次,每次時(shí)長(zhǎng)為5 min;顯色處理后用蒸餾水沖洗停止染色;蘇木精復(fù)染后樹膠密封。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野,通過TPP彩色圖像分析軟件測(cè)定每一視野中Mint3含量,取10個(gè)視野平均值作為本切片陽性染色含量。面密度為彩色圖像分析軟件測(cè)定單位。

1.3.4 血清指標(biāo)檢測(cè) 清晨抽取患者空腹血標(biāo)本5 ml外周靜脈血,3 000 r/min離心處理,時(shí)長(zhǎng)為10 min,取上清,冰箱保存待測(cè),通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)血清中Mint3水平。磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)肝纖維化4項(xiàng):透明質(zhì)酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原N端肽(PC Ⅲ)和Ⅳ型膠原(Ⅳ-C),通過化學(xué)發(fā)光儀Autolumo A2000 Plus(鄭州安圖生物工程股份有限公司)以及其配套試劑檢測(cè)完成?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)AFP,通過DXI800全自動(dòng)免疫分析系統(tǒng)及其配套試劑完成。

1.4 觀察指標(biāo) ①定期監(jiān)測(cè)比較兩組患者3年內(nèi)血清Mint3表達(dá)水平;②比較發(fā)生肝癌組患者死亡與未死亡Mint3相關(guān)性;③比較兩組患者肝纖維化4項(xiàng)、AFP等;④分析Mint3表達(dá)與肝功能、AFP相關(guān)性;⑤分析肝纖維化發(fā)生肝癌的影響因素;⑥ROC曲線評(píng)價(jià)Mint3對(duì)肝纖維化發(fā)生肝癌的預(yù)測(cè)價(jià)值;⑦Kaplan-Meier曲線比較不同Mint3表達(dá)水平肝癌患者生存情況。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)生肝癌組與未發(fā)生肝癌組患者血清Mint3含量比較 隨訪期內(nèi)兩組患者血清Mint3含量比較見表1。將發(fā)生肝癌組根據(jù)是否死亡分為發(fā)生肝癌死亡亞組與肝癌存活亞組,各隨訪節(jié)點(diǎn)患者血清Mint3含量比較見表2。

表1 發(fā)生肝癌組與未發(fā)生肝癌組患者隨訪期內(nèi)血清Mint3含量比較

表2 肝癌死亡組與肝癌存活組患者隨訪期內(nèi)血清Mint3含量比較

2.2 免疫組化檢測(cè) 對(duì)患者肝組織進(jìn)行免疫組化結(jié)果顯示,發(fā)生肝癌患者肝組織中Mint3表達(dá)顯著高于未發(fā)生肝癌患者(P<0.05)。見圖1。

圖1 免疫組化檢測(cè)結(jié)果(HE染色×200)

2.3 兩組患者入院時(shí)肝纖維化4項(xiàng)與AFP比較 見表3。

表3 發(fā)生肝癌組與未發(fā)生肝癌組入院肝纖維化4項(xiàng)與AFP比較

2.4 入院時(shí)Mint3與是否發(fā)生肝癌、發(fā)生肝癌是否死亡以及臨床指標(biāo)相關(guān)性 見表4。

表4 Mint3與肝癌發(fā)生、肝癌死亡、肝纖維化4項(xiàng)、AFP相關(guān)性

2.5 肝纖維化發(fā)生肝癌多因素分析 以肝纖維化患者最終是否發(fā)生肝癌為因變量,以入院時(shí)Mint3以及表3中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量為自變量進(jìn)行多因素分析,結(jié)果顯示Mint3、HA、LN、PC-Ⅲ、Ⅳ-C以及AFP是肝纖維化患者發(fā)生肝癌的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表5。

表5 肝纖維化發(fā)生肝癌多因素分析

2.6 Mint3預(yù)測(cè)肝纖維化發(fā)生肝癌ROC曲線 ROC曲線得出入院Mint3值預(yù)測(cè)肝纖維化發(fā)生肝癌的AUC值為0.828,95%CI=0.720～0.951,P<0.001,靈敏度為0.762,特異度為0.898;預(yù)測(cè)肝纖維化發(fā)生肝癌死亡的AUC值為0.750,95%CI=0.578～0.830,P<0.001,靈敏度為0.693,特異度為0.798。見圖2,3。

圖2 Mint3預(yù)測(cè)肝纖維化發(fā)生肝癌的ROC曲線

2.7 肝纖維化患者發(fā)生肝癌后生存曲線 每位患者監(jiān)測(cè)5次Mint3值,取均值計(jì)算本研究總Mint3平均值,以≤平均值為低水平,>平均值為高水平,肝纖維化患者發(fā)生肝癌后Mint3低水平患者生存率高于高水平患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.272,P<0.001)。見圖4。

圖4 Mint3表達(dá)相關(guān)生存曲線

3 討論

多項(xiàng)研究表明Mint3在病理?xiàng)l件下可作為癌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞中的HIF-1的激活劑[8],而HIF-1在各種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭袑?duì)癌癥發(fā)生發(fā)展以及治療均具有重要作用[9,10]。同時(shí)有研究證實(shí)敲除Mint3的小鼠表現(xiàn)出對(duì)癌癥的抑制轉(zhuǎn)移,且Mint3缺失可抑制乳腺癌、肺癌、胰腺癌以及纖維肉瘤等各類型癌癥的腫瘤生長(zhǎng),增強(qiáng)癌細(xì)胞的化學(xué)敏感性[11-13],但是Mint3在肝癌發(fā)生發(fā)展中的相關(guān)研究目前較少。而本研究通過對(duì)肝纖維化患者進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血清內(nèi)Mint3含量,發(fā)現(xiàn)以發(fā)生肝癌為結(jié)局的患者隨訪3年內(nèi)Mint3含量顯著高于未發(fā)生肝癌的患者,且發(fā)生肝癌組患者隨著肝纖維化的加重Mint3含量隨之增加。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)發(fā)生肝癌患者中死亡患者血清中Mint3含量顯著高于存活患者。提示Mint3可能與肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),監(jiān)測(cè)Mint3可能對(duì)肝纖維化的治療和疾病進(jìn)展具有重大意義,Mint3有希望作為肝纖維化進(jìn)展為肝癌的標(biāo)記物。

肝纖維化是慢性乙型肝炎病變的基礎(chǔ),肝內(nèi)炎癥活動(dòng)造成肝細(xì)胞持續(xù)損傷以及肝結(jié)構(gòu)遭到破壞,進(jìn)而進(jìn)展為肝癌[14]。研究發(fā)現(xiàn)Mint3在病毒感染巨噬細(xì)胞時(shí)被顯著誘導(dǎo)[15]。而Mint3可通過促進(jìn)K63鏈接的TNF受體相關(guān)因子3多泛素化進(jìn)一步增強(qiáng)使乙型肝炎病毒感染巨噬細(xì)胞加重,而Mint3也會(huì)被進(jìn)一步增強(qiáng)誘導(dǎo),表達(dá)率增加[16,17]。也有研究發(fā)現(xiàn)Mint3在不同肝纖維化患者中差異化表達(dá)的原因可能與其通過與FIH-1結(jié)合激活HIF-1,進(jìn)而干擾FIH-1與HIF-1之間相關(guān)作用有關(guān)[18]。且已有研究證實(shí)Mint3可在某些類型的癌細(xì)胞中與FIH-A相互作用[19]。本研究患者穿刺肝組織進(jìn)行免疫組化結(jié)果顯示,Mint3在未發(fā)生肝癌患者肝組織中表達(dá)顯著高于發(fā)生肝癌患者,這說明高M(jìn)int3水平肝纖維化患者發(fā)生肝癌的概率更高,且高M(jìn)int3水平發(fā)生死亡的風(fēng)險(xiǎn)也更高。提示Mint3可能對(duì)肝纖維化進(jìn)展為肝癌和肝癌加重死亡具有重要預(yù)示意義。另外本研究通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)Mint3含量與肝纖維化患者是否發(fā)生肝癌、發(fā)生肝癌患者是否死亡、LN、HA、PC-Ⅲ、Ⅳ-C、AFP具有顯著正相關(guān)性,進(jìn)一步證實(shí)了Mint3在肝纖維化進(jìn)展為肝癌過程中發(fā)揮重要作用。并且我們通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)Mint3和HA、LN、PC-Ⅳ、Ⅴ-C以及AFP都是肝纖維化患者發(fā)生肝癌的危險(xiǎn)因素。因此我們推測(cè)Mint3有可能是肝纖維化發(fā)生肝癌及肝癌死亡的監(jiān)測(cè)標(biāo)志物,另外本研究ROC曲線結(jié)果顯示,Mint3值預(yù)測(cè)肝纖維化發(fā)生肝癌的AUC值、靈敏度和特異度均較高,預(yù)測(cè)肝纖維化發(fā)生肝癌死亡的AUC值、靈敏度和特異度也較高。這進(jìn)一步提示Mint3對(duì)肝纖維化進(jìn)展為肝癌的潛在診斷價(jià)值。最后我們通過生存曲線證實(shí)肝纖維化患者發(fā)生肝癌后Mint3低水平患者生存率高于高水平患者。提示肝纖維化患者肝組織Mint3水平可能與肝纖維化進(jìn)展為肝癌以及肝癌患者生存情況有關(guān),但由于本研究樣本量較少,此結(jié)果具有一定局限性,有待臨床做進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述,在肝纖維化患者病情進(jìn)展過程中,Mint3水平與肝纖維化進(jìn)展密切相關(guān),Mint3升高可能能促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展為肝癌,監(jiān)測(cè)Mint3值有助于肝纖維化進(jìn)展為肝癌的早期診斷以及預(yù)后。