蔡小英，汪水塘，李英杰，卜云芳，謝藝璇，賈少馳

中國(guó)人民解放軍海軍第九〇五醫(yī)院呼吸科，上海 200052

肺癌可分為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）和小細(xì)胞肺癌，其中NSCLC 約占85%，由于早期癥狀不明顯，多數(shù)NSCLC 患者初次就診時(shí)已為中晚期［1-2］。目前，含鉑雙藥化療是晚期NSCLC 患者的一線首選治療方案，但由于腫瘤異質(zhì)性，相同治療方案在不同晚期NSCLC 患者中的治療療效及預(yù)后存在顯著差異［3］。尋找能夠有效評(píng)估晚期NSCLC 化療療效及預(yù)后的標(biāo)志物，對(duì)于個(gè)體化治療具有重要意義。環(huán)狀RNA（Circ RNA）是一種非編碼RNA，其特征是具有首尾相連的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，具有高度穩(wěn)定性、保守性及特異性，是理想的血清腫瘤標(biāo)志物［4］。近年來(lái)有學(xué)者對(duì)NSCLC 患者血清中差異性表達(dá)的環(huán)狀RNA 進(jìn)行高通量的測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)Circ RNA VMP1、PIP5K1A 水平均異常上調(diào)，是NSCLC 潛在的早期診斷及治療靶點(diǎn)［5-6］。目前，血清VMP1、PIP5K1A 在晚期NSCLC 患者中的水平及臨床意義尚不明確。本研究通過(guò)檢測(cè)晚期NSCLC 患者血清VMP1、PIP5K1A 水平，分析兩者在評(píng)估晚期NSCLC 患者化療療效及預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值，旨在為晚期NSCLC 患者化療療效及預(yù)后的早期預(yù)測(cè)提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 經(jīng)中國(guó)人民解放軍海軍第九〇五醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2017-0121），選取2017 年2 月—2022年2月本院收治的晚期NSCLC 患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理組織學(xué)明確診斷為NSCLC；②為初次診治的原發(fā)性NSCLC；③腫瘤TNM分期為Ⅲb～Ⅳ期，有可測(cè)量的肺部腫瘤病灶；④一線治療方案為含鉑雙藥化療；⑤患者及家屬均簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴其他系統(tǒng)惡性腫瘤；②伴血液系統(tǒng)疾病、精神系統(tǒng)疾病等；③臨床資料不完整。共收集符合上述標(biāo)準(zhǔn)的晚期NSCLC 患者118 例作為NSCLC組，另選取同期健康體檢者60 例作為對(duì)照組。NSCLC 組男70 例、女48 例，年齡（65.74 ± 10.25）歲，有吸煙史45例，病理類(lèi)型腺癌81例、鱗癌37例，腫瘤直徑＜3 cm 44 例、≥3 cm 74 例，腫瘤分化程度高中分化79例、低分化39例，腫瘤TNM分期Ⅲb期39例、Ⅳ期79 例；對(duì)照組男35 例、女25 例，年齡（64.95 ±9.87）歲。兩組組性別、年齡具有可比性。

1.2 血清VMP1、PIP5K1A 檢測(cè)方法 采集NSCLC組入院后次日、對(duì)照組體檢時(shí)清晨空腹靜脈血約5 mL，3 000 r/min離心10 min，取上層血清。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)血清VMP1，Circ_PIP5K1A。采用HiPure Liquid RNA Mini Kit試劑盒（上海邁跟生物科技公司）提取血清中總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系：2×qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA 1 μL，無(wú)酶水8 μL。反應(yīng)條件：熱變性95 ℃ 2 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，變性退火，40 個(gè)循環(huán)。引物序列：VMP1 上游引物5′-AGTCTGCACAACTCCTCAAGA-3′，下游引物5′-AAGGTAATGAGCGGCTGTC-3′；PIP5K1A 上游引物5′-TTGTCTCCAACCTTCCGTAGT-3′，下游引物5′-CCAGATCAGAGAGGTGGTGTAG-3′；U6 上游引物5′-CTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物5′-AAAATATGGAACGCTTCACG-3′。引物由上海生工公司設(shè)計(jì)合成。以U6 為內(nèi)參，以2-ΔΔCt法計(jì)算VMP1、PIP5K1A相對(duì)表達(dá)量。

1.3 化療及療效評(píng)價(jià)方法 所有NSCLC 患者均接受含鉑一線化療方案，即順鉑/卡鉑+培美曲塞/紫杉醇類(lèi)。21 d為1個(gè)化療周期，共治療4個(gè)周期。于化療前及化療結(jié)束后行胸部CT檢查，記錄肺部腫瘤的靶病灶直徑之和。根據(jù)WHO 實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［7］，目標(biāo)病灶消失為完全緩解（CR），目標(biāo)病灶直徑之和縮小≥30%為部分緩解（PR），目標(biāo)病灶直徑之和增加≥20%或出現(xiàn)新病灶為疾病進(jìn)展（PD），目標(biāo)病灶縮小未達(dá)PR 或增大未達(dá)PD 為疾病穩(wěn)定（SD）。將CR+PR 者定義為化療有效者，SD+PD 者定義為化療無(wú)效者。

1.4 預(yù)后隨訪方法 采用電話和門(mén)診相結(jié)合的方式進(jìn)行隨訪，每月1次，隨訪1年，隨訪終點(diǎn)為患者死亡或隨訪結(jié)束，記錄患者生存情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用Shapiro-Wilk 進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以表示，組間兩兩比較行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)；根據(jù)晚期NSCLC 患者血清VMP1、PIP5K1A 水平的平均值將NSCLC 患者分為VMP1 高水平者及低水平者、PIP5K1A 高水平及低水平者，繪制Kaplan-Meier生存曲線并比較VMP1、PIP5K1A 高低水平者的1 年生存率。以晚期NSCLC 患者預(yù)后（賦值：1=死亡，0=生存，t=生存時(shí)間）為因變量，以患者臨床特征為自變量，采用多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析晚期NSCLC 患者血清VMP1、PIP5K1A 水平對(duì)預(yù)后的影響。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清VMP1、PIP5K1A 水平比較 對(duì)照組、NSCLC 組血清VMP1 水平分別為0.96 ± 0.41、3.04 ± 0.74，血清PIP5K1A 水平分別為0.86 ±0.34、2.76 ± 0.72；NSCLC 組血清VMP1、PIP5K1A水平均高于對(duì)照組（P均＜0.01）。

2.2 不同臨床特征的晚期NSCLC 患者血清VMP1、PIP5K1A水平比較 TNM分期為Ⅳ期、低分化的晚期NSCLC患者血清VMP1、PIP5K1A水平分別高于TNM分期為Ⅲb期、高中分化者（P均＜0.05）。不同性別、年齡、吸煙史、腫瘤直徑及病理類(lèi)型患者間血清VMP1、PIP5K1A水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 不同臨床特征的晚期NSCLC患者血清VMP1、PIP5K1A水平比較（）

表1 不同臨床特征的晚期NSCLC患者血清VMP1、PIP5K1A水平比較（）

注：與相同臨床特征比較，*P＜0.05。

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2.3 血清VMP1、PIP5K1A 與晚期NSCLC 患者化療療效的關(guān)系 118例晚期NSCLC患者化療后CR 0例、PR 41例、SD 45例、PD 32例；化療有效者共41例、無(wú)效者77 例。化療有效者、化療無(wú)效者血清VMP1 水平分別為1.18 ± 0.70、4.03 ± 0.98，血清PIP5K1A水平分別為1.59 ± 0.66、3.81 ± 0.92；化療有效者血清VMP1、PIP5K1A 水平均低于化療無(wú)效者（P均＜0.01）。

2.4 血清VMP1、PIP5K1A 與晚期NSCLC 患者預(yù)后的關(guān)系 118 晚期NSCLC 患者隨訪1 年共生存50 例，1 年生存率為39.83%。根據(jù)晚期NSCLC患者血清VMP1、PIP5K1A 水平的平均值將患者分為VMP1 高水平者58 例、低水平者60 例，PIP5K1A 高水平者57 例、低水平者61 例。VMP1高、低水平者1 年生存率分別為25.86%（15/58）、58.33%（35/60），PIP5K1A 高、低水平者1 年生存率分別為24.56%（14/57）、59.02%（36/61）。VMP1、PIP5K1A 高水平患者1 年生存率分別低于VMP1、PIP5K1A 低水平患者（P均＜0.01）。多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析結(jié)果顯示，腫瘤TNM 分期Ⅳ期、低分化程度、VMP1 高水平、PIP5K1A 高水平是晚期NSCLC 患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表2。

表2 影響晚期NSCLC患者預(yù)后的多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析結(jié)果

3 討論

NSCLC 是最常見(jiàn)的肺癌類(lèi)型，腫瘤惡性程度高、侵襲轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，特別是晚期NSCLC，即使經(jīng)積極綜合治療后腫瘤仍可復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后較差［8-9］。目前，晚期NSCLC 患者的預(yù)后評(píng)估主要依據(jù)腫瘤TNM 分期、腫瘤分化程度等因素，但對(duì)于具有相同臨床病理特征及接受相同治療的患者，預(yù)后也存在較大差異［10］。因此，尋找能夠評(píng)估晚期NSCLC患者化療療效及預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物具有重要意義。

Circ RNA 是具有共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA 分子，廣泛表達(dá)于真核細(xì)胞中，具有良好的穩(wěn)定性和特異性，參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、蛋白質(zhì)翻譯及組織發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程［11］。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，在肺癌、腎癌等多種人類(lèi)惡性腫瘤中存在大量異常Circ RNA 表達(dá)的現(xiàn)象，Circ RNA 可通過(guò)激活下游表皮生長(zhǎng)因子等多條信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤的惡性增殖及轉(zhuǎn)移［12-13］。VMP1是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新的Circ RNA 分子，研究表明，肺腺癌患者血漿外泌體及癌組織中VMP1表達(dá)均異常上調(diào)，VMP1是潛在的肺腺癌早期診斷腫瘤標(biāo)志物［6］。本研究結(jié)果顯示，晚期NSCLC患者血清VMP1升高，且與腫瘤TNM分期及腫瘤分化程度有關(guān)，提示VMP1 參與促進(jìn)NSCLC腫瘤的惡性進(jìn)展。分析其機(jī)制可能為，VMP1具有微小RNA 反應(yīng)元件，可以作為miR-524-5p的分子海綿，抑制miR-524-5p活性，增強(qiáng)N6甲基腺苷甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物中催化亞基甲基轉(zhuǎn)移樣酶3 mRNA的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)SRY-Box轉(zhuǎn)錄因子2的表達(dá)，導(dǎo)致肺癌腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，化療無(wú)效的晚期NSCLC患者血清VMP1水平高于化療有效患者，提示血清VMP1水平有助于反映晚期NSCLC患者化療療效。有學(xué)者在順鉑耐藥的肺癌腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299中發(fā)現(xiàn)VMP1水平異常上調(diào)，順鉑耐藥的肺癌腫瘤細(xì)胞能夠以外泌體的形式，將VMP1傳遞到其他腫瘤細(xì)胞，VMP1不僅促進(jìn)受體腫瘤細(xì)胞的惡性侵襲和轉(zhuǎn)移能力，還能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑等化療藥物的耐藥性［14］。本研究結(jié)果顯示，血清VMP1高水平的晚期NSCLC 患者生存預(yù)后較差。分析其原因，一方面VMP1高水平的NSCLC腫瘤細(xì)胞TNM分期較高、腫瘤分化程度較差；另一方面VMP1高水平能夠降低鉑類(lèi)等化療藥物治療的敏感性，這些因素均會(huì)導(dǎo)致晚期NSCLC患者預(yù)后不良。因此，VMP1可能是評(píng)估晚期NSCLC化療療效及預(yù)后的血清標(biāo)志物。

PIP5K1A是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的具有腫瘤促進(jìn)作用的Circ RNA 分子［15］。有研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌中PIP5K1A表達(dá)升高，其能夠作為分子海綿結(jié)合并抑制miR-942-5p，上調(diào)核因子I/B 的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖及耐藥性形成［16］。本研究結(jié)果顯示，晚期NSCLC 患者血清PIP5K1A 水平升高，這與既往在NSCLC 組織中的研究結(jié)果一致［17］；且PIP5K1A 與患者不良臨床病理特征有關(guān)，提示PIP5K1A 可能參與促進(jìn)NSCLC 的惡性進(jìn)展。有研究報(bào)道，PIP5K1A 能夠結(jié)合并抑制miR-101，增加其靶基因ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體亞家族C 成員1 mRNA 的穩(wěn)定性及蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞的遷移、侵襲及增殖，抑制NSCLC 細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，血清PIP5K1A 高水平的晚期NSCLC 患者化療療效較差，提示血清PIP5K1A 可能是評(píng)估晚期NSCLC 患者化療療效的腫瘤標(biāo)志物。分析其原因可能為PIP5K1A 能夠增強(qiáng)NSCLC 腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類(lèi)化療藥物耐藥性，降低化療療效。研究發(fā)現(xiàn)，在順鉑耐藥的NSCLC 組織和細(xì)胞中，PIP5K1A 水平均異常上調(diào)，PIP5K1A 能夠通過(guò)結(jié)合miR-493-5p，上調(diào)Rho 相關(guān)卷曲蛋白激酶1 的表達(dá)，促進(jìn)NSCLC 的惡性增殖及對(duì)順鉑耐藥性形成［18］。本研究結(jié)果顯示，PIP5K1A高水平是晚期NSCLC 患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示血清PIP5K1A 可能是評(píng)估晚期NSCLC 患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。分析其原因，PIP5K1A 能夠通過(guò)激活多條miRNA/mRNA 軸，包括miR-600/缺氧誘導(dǎo)因子1α、miR-142-5p/胰島素樣生長(zhǎng)因子1 及miR-136-5p/B 細(xì)胞淋巴瘤2 通路，促進(jìn)腫瘤的惡性生物學(xué)行為及化療耐藥性形成，導(dǎo)致患者預(yù)后不良［19-20］。

綜上所述，晚期NSCLC 患者血清VMP1、PIP5K1A 水平升高，兩者與患者化療效果及預(yù)后有關(guān)，可能作為評(píng)估晚期NSCLC 患者化療療效及生存預(yù)后的血清標(biāo)志物，有利于輔助臨床醫(yī)生選擇合適的治療方案進(jìn)行臨床診治。本研究樣本量有限，納入病例可能存在一定的偏倚。此外，本研究未對(duì)化療后血清VMP1、PIP5K1A 水平變化進(jìn)行檢測(cè)，有待今后設(shè)計(jì)多中心大樣本臨床實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究血清VMP1、PIP5K1A水平的臨床意義。