陳河山，許榮譽(yù)，陳劭賡，傅景梁，陳泓波，杜祥昆，何榮琦

1 福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院胸外科，福建泉州 362000；2 福建醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院

食管鱗癌（ESCC）是臨床較常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展與遺傳、環(huán)境、生物等多種因素有關(guān)。因其早期癌細(xì)胞主要存在于食管黏膜層，病情較隱匿，癥狀也較輕微，故患者難以察覺，一般需行胃鏡檢查才能發(fā)現(xiàn)［1］。然而，臨床大部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)，病情多處于中晚期，已錯(cuò)過最佳手術(shù)治療時(shí)機(jī)，需采取同步放化療治療。雖然同步放化療可控制腫瘤發(fā)展，有效延長患者生存時(shí)間，但腫瘤容易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后效果多不理想［2］。因此，對(duì)ESCC 侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制進(jìn)行研究具有重要臨床意義。研究表明，各種微小核糖核酸（miRNA）與ESCC 細(xì)胞的增殖、分化與凋亡有關(guān)。miR-296-5p 作為一種多功能miRNA 在不同腫瘤中發(fā)揮著不同的作用，其在肺癌、鼻咽癌、結(jié)直腸癌、肝癌中的致癌作用已被證實(shí)［3-4］，但在ESCC 轉(zhuǎn)移中的作用尚不清楚。外泌體是miRNA 的重要載體之一，是一種由多種細(xì)胞分泌的納米級(jí)囊泡，可在體液中穩(wěn)定存在。腫瘤細(xì)胞來源的外泌體（TDEs）與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)。前期我們通過TargetSan 和DAVID 靶向基因預(yù)測表明，重組人細(xì)胞黏附分子3（CADM3）是miR-296-5p 的下游靶向因子。2020 年1 月—2022 年12 月，本研究提取攜運(yùn)miR-296-5p 的ESCC 細(xì)胞外泌體，觀察其對(duì)ESCC 細(xì)胞活力及侵襲遷移能力影響并探討其機(jī)制，以期為ESCC 轉(zhuǎn)移的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 ESCC 細(xì)胞系Eca109 購自中科院上海細(xì)胞庫；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；miRNA cDNA 合成試劑盒、EvaGreen miRNA qPCR MasterMix 購自加拿大ABM 公司；Matrigel 基底膠購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；Transwell 小室購自上海諾娃醫(yī)藥科技有限公司；外泌體標(biāo)志蛋白TSG101、CD81、CD9 抗體，CADM 蛋白家族CADM3、CADM1、CADM4，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）標(biāo)志蛋白鈣黏蛋白E（E-cadherin），血管內(nèi)皮細(xì)胞生成浸潤相關(guān)蛋白CD31、CD44 抗體及山羊抗兔二抗均購自美國Abcam 公司；miR-296-5p mimic、miR-296-5p inhibitor 以及陰性對(duì)照物（NC）購自漢恒生物科技有限公司。

1.2 腫瘤細(xì)胞外泌體的提取與鑒定 常規(guī)培養(yǎng)Eca109 細(xì)胞，將對(duì)數(shù)生長的細(xì)胞接種于24 孔板（1.6 × 105/孔）；按照反轉(zhuǎn)錄說明書操作步驟分別轉(zhuǎn)染miR-296-5p mimic、miR-296-5p inhibitor 及NC，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將轉(zhuǎn)染后的Eca109 細(xì)胞分別接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h，再用10%外泌體胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，差速離心提取外泌體-80℃冰箱保存。用透射電鏡觀察外泌體形態(tài)，Western blotting 法檢測細(xì)胞外泌體標(biāo)志蛋白TSG101、CD81、CD9。透射電鏡下，ESCC 細(xì)胞外泌體均具有雙層膜結(jié)構(gòu)，呈“杯托”狀，粒徑50 ～100 nm，符合外泌體結(jié)構(gòu)特征；Western blotting 法均檢測到TSG101、CD81、CD9 蛋白，符合外泌體生物學(xué)特征。

1.3 細(xì)胞分組與外泌體干預(yù) 將Eca109 細(xì)胞分為干擾組、過表達(dá)組和NC 組，分別以10 ng/mL 上述轉(zhuǎn)染miR-296-5p mimic、miR-296-5p inhibitor、NC 細(xì)胞的外泌體培養(yǎng)48 h。

1.4 細(xì)胞活力觀察 采用MTT 法。收集各組細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為1 × 105/mL，接種于96 孔板中培養(yǎng)24 h；每孔分別加入0.55% MTT 20 μL，37 ℃反應(yīng)4 h；去MTT 液后每孔加二甲基亞砜（DMSO）200 μL，充分震蕩10 min 至結(jié)晶溶解；使用酶標(biāo)儀在波長570 nm 處檢測各孔OD 值。細(xì)胞存活率=（A干預(yù)孔-A空白對(duì)照孔）/（A細(xì)胞對(duì)照孔-A空白對(duì)照孔）×100%。

1.5 細(xì)胞侵襲遷移能力觀察 采用Transwell 法。收集各組細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為1 × 105/mL，將普通與含Matrigel 的Transwell 下室中加入培養(yǎng)基，上室加入細(xì)胞混懸液，培養(yǎng)12 ～ 24 h；取出小室并吸干上室液體，加入多聚甲醛固定液固定30 min，棄去固定液，用結(jié)晶紫染液染色15 ～ 30 min；擦去上室底部膜表面的細(xì)胞，使用顯微鏡觀察。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，記錄并計(jì)算侵襲遷移細(xì)胞細(xì)胞個(gè)數(shù)，取平均值。

1.6 細(xì)胞中CADM3、CADM1、CADM4、E-cadherin、CD31、CD44 基因檢測 采用RT-PCR 法。收集各組細(xì)胞，使用TRIzol 試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒構(gòu)建CADM3、CADM1、CADM4、E-cadherin、CD31、CD44 的cDNA；依據(jù)Genbank 數(shù)據(jù)庫的基因序列，應(yīng)用Primer Express 軟件設(shè)計(jì)內(nèi)參與上述蛋白的引物及熒光探針，以β-actin 作為基因內(nèi)參。在PCR 反應(yīng)中加入引物和探針，PCR 在條件為95 ℃ 15 s、51 ℃ 15 s、72 ℃ 45 s 擴(kuò)增40 循環(huán)，以2-ΔΔCt計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。各目標(biāo)基因及內(nèi)參基因引物序列見表1。

表1 CADM3、CADM1、CADM4、E-cadherin、CD31、CD44及內(nèi)參基因的引物序列

1.7 細(xì) 胞 中 CADM3、 CADM1、 CADM4、CD31、CD44、E-cadherin 蛋白檢測 采用Western blotting 法。收集各組細(xì)胞，使用蛋白裂解液進(jìn)行裂解并冷凍離心；收集蛋白質(zhì)，加入上樣緩沖液，95 ℃水浴5 min；蛋白質(zhì)充分變性后，用BCA 蛋白試劑盒定量。用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后，封閉；加入CADM3、CADM1、CADM4、CD31、CD44、E-cadherin、一抗4 ℃過夜，TBST 緩沖液洗膜3 次；加入二抗，再洗膜3 次；ECL 顯影成像，采用TANON GIS讀取條帶的灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，以目的蛋白與內(nèi)參灰度值比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。采用S-W 法對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以表示；多組數(shù)據(jù)比較行方差分析，進(jìn)一步兩兩比較SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞活力、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)比較 細(xì)胞活力、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)過表達(dá)組＞NC 組＞干擾組（F=27.839、54.988、41.819），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組細(xì)胞活力、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)比較（）

表2 各組細(xì)胞活力、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)比較（）

注：與NC組比較，aP＜0.05；與過表達(dá)組比較，bP＜0.05。

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2.2 各組細(xì)胞CADM3、CADM1、CADM4、CD31、CD44、E-cadherin mRNA 表達(dá)比較 細(xì)胞CADM1、CADM4、E-cadherin 表達(dá)水平干擾組＞NC 組＞過表達(dá)組（F=22.259、52.784、56.213），CADM3、CD31、CD44 表達(dá)水平過表達(dá)組＞NC 組＞干擾組（F=18.000、36.650、24.455），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表3。

表3 各組細(xì)胞CADM3、CADM1、CADM4、E-cadherin、CD31、CD44 mRNA表達(dá)比較（）

表3 各組細(xì)胞CADM3、CADM1、CADM4、E-cadherin、CD31、CD44 mRNA表達(dá)比較（）

注：與NC組比較，aP＜0.05；與過表達(dá)組比較，bP＜0.05。

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2.3 各組CADM3、CADM1、CADM4、E-cadherin、CD31、CD44 蛋白表達(dá)比較 細(xì)胞CADM1、CADM4、E-cadherin 蛋白表達(dá)水平干擾組＞NC 組＞過表達(dá)組（F=24.637、14.097、1 268.263），CADM3、CD31、CD44 蛋白表達(dá)水平過表達(dá)組＞NC 組＞干擾組（F=65.901、10.410、41.381），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表4。

表4 各組CADM3、CADM1、CADM4、E-cadherin、CD31、CD44蛋白表達(dá)水平比較（））

表4 各組CADM3、CADM1、CADM4、E-cadherin、CD31、CD44蛋白表達(dá)水平比較（））

注：與NC組比較，aP＜0.05；與過表達(dá)組比較，bP＜0.05。

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3 討論

食管癌是惡性腫瘤相關(guān)死亡的第六大主要原因，也是全球第八大常見惡性腫瘤，在特定地理位置和某些種族中患病率較高。ESCC 占食管癌病例的近80%，其5 年生存率在10% ～ 41%［5］。ESCC患者通常無癥狀，導(dǎo)致診斷延遲。因此，了解ESCC 細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的機(jī)制，將在改善患者預(yù)后方面具有重要作用。miRNA 屬于一種小的非編碼RNA，是基因表達(dá)的主要調(diào)節(jié)因子之一。它們可參與正常細(xì)胞中多種生物學(xué)過程的平衡維持，包括細(xì)胞分化、增殖和死亡；也可以通過調(diào)節(jié)癌基因或抑癌基因的表達(dá)，從而影響腫瘤生物學(xué)特性［6］。因此，目前基于miRNA 抗癌療法的開發(fā)成為研究的熱點(diǎn)。研究表明，miR-296-5p 在多種腫瘤中均存在異常表達(dá)，但其在ESCC 中的研究較少［7］。

外泌體中富含多種信息物質(zhì)，如其所攜運(yùn)的miRNA 等可參與人體重要的生理與病理過程，在免疫與炎癥等反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。TDEs 能通過在腫瘤環(huán)境中所提供的自分泌、旁分泌信號(hào)激活腫瘤細(xì)胞的EMT，從而使腫瘤細(xì)胞能侵入周圍組織或進(jìn)入外周循環(huán)，隨后TDEs可被其他器官組織吸收形成癌前病變并在此定植。TDEs 還可通過調(diào)整宿主免疫并進(jìn)一步激活炎癥反應(yīng)通路而欺騙免疫細(xì)胞因子等物質(zhì)，以進(jìn)行轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的培育，為腫瘤轉(zhuǎn)移打下基礎(chǔ)［8］?；诖?，本研究培養(yǎng)干擾與過表達(dá)miR-296-5p 轉(zhuǎn)染的ESCC 細(xì)胞，提取其外泌體，比較各組細(xì)胞活力、轉(zhuǎn)移及侵襲情況。結(jié)果表明，高表達(dá)miR-296-5p 的腫瘤細(xì)胞外泌體可提高ESCC 細(xì)胞活力，增強(qiáng)ESCC 細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力，提示了腫瘤細(xì)胞外泌體攜運(yùn)miR-296-5p 可促進(jìn)ESCC 轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展。

本研究還通過檢測細(xì)胞CADM3、CADM1、CADM4、E-cadherin、CD31、CD44 表達(dá)變化，分析了腫瘤細(xì)胞外泌體攜運(yùn)miR-296-5p 促進(jìn)ESCC 轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展可能的機(jī)制。CADM 蛋白可介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附［9］，其家族成員包括CADM1、CADM2、CADM3、CADM4；但CADM2 在多種惡性腫瘤中缺乏或低表達(dá)，研究幾乎難以檢測到。本課題組前期預(yù)測發(fā)現(xiàn)，CADM3 為miR-296-5p 下游靶向因子。CADM3 可介導(dǎo)鈣離子非依賴性的細(xì)胞間黏附，在維護(hù)細(xì)胞極性中具有積極作用，可參與腫瘤細(xì)胞的增殖遷移過程［10］。然而，CADM 蛋白家族中的CADM1 可抑制EMT 和致癌信號(hào)，CADM4 涉及細(xì)胞間粘連，二者對(duì)延緩腫瘤轉(zhuǎn)移起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，CADM1 與CADM4 表達(dá)缺失可促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移［11］，因此CADM1、CADM4 與CADM3 存在相互制約平衡的作用。E-cadherin 是鈣黏蛋白家族的成員之一，主要存在于上皮組織中，可維持細(xì)胞的極性，能介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附，對(duì)細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)之間的黏附作用具有重要調(diào)節(jié)作用，該蛋白表達(dá)下調(diào)或缺失是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的第一步［12］。CD31 是一種跨膜蛋白，參與血管內(nèi)皮細(xì)胞的生成，而新生血管可為腫瘤組織細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移提供營養(yǎng)支持［13］。因此，CD31 表達(dá)升高可促進(jìn)ESCC 向遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移。CD44 是一種在許多生物學(xué)過程中起作用的細(xì)胞表面蛋白，可在腫瘤干細(xì)胞中過表達(dá)，參與細(xì)胞黏附、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，其陽性表達(dá)者較易發(fā)生血管浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［14-16］。本研究結(jié)果顯示，隨著miR-296-5p 在腫瘤外泌體中表達(dá)的增加，ESCC 細(xì)胞中CADM3、CD31、CD44 表達(dá)升高，而CADM1、CADM4、E-cadherin 表達(dá)降低，提示腫瘤細(xì)胞外泌體攜運(yùn)miR-296-5p 可通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)水平以促進(jìn)ESCC 轉(zhuǎn)移。

綜上所述，高表達(dá)miR-296-5p 的腫瘤細(xì)胞外泌體可能通過調(diào)控CADM、E-cadherin、CD31、CD44 等腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)ESCC 轉(zhuǎn)移，可為ESCC 轉(zhuǎn)移的防治提供新的路徑。但本文僅進(jìn)行了細(xì)胞體外研究，還需后續(xù)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床應(yīng)用進(jìn)一步驗(yàn)證。