陳俊峰，王明剛，桂雄斌

廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科，南寧 530000

變應(yīng)性鼻炎（AR）是一種常見(jiàn)變態(tài)反應(yīng)性疾病，是由特異性免疫球蛋白E（IgE）介導(dǎo)的鼻黏膜慢性炎癥反應(yīng)，以發(fā)作性噴嚏、鼻溢、鼻塞、鼻癢等為典型臨床癥狀［1-2］。目前AR 的常規(guī)治療方法包括藥物治療、免疫治療及手術(shù)治療［3］，在此基礎(chǔ)上還有單克隆抗體治療及間充劑干細(xì)胞等新興療法［4］，但一線用藥無(wú)法有效降低復(fù)發(fā)率，免疫治療依從性較差，手術(shù)治療接受率低，新興療法運(yùn)用到臨床還需較長(zhǎng)時(shí)間。深入認(rèn)識(shí)AR 的相關(guān)機(jī)制，從而形成有效的防治策略具有重要意義。腸道微生態(tài)是以腸道菌群為主要成分的自平衡系統(tǒng)，與多種免疫損傷性疾病密切相關(guān)。多項(xiàng)研究表明，AR的發(fā)生發(fā)展與胃腸道微生態(tài)的改變有關(guān)［5-9］。AR 在中醫(yī)學(xué)上被稱為鼻鼽或齁嚏［10］。本課題組認(rèn)為，體質(zhì)差異導(dǎo)致的肺脾氣虛，易受外邪侵?jǐn)_，邪氣淤積終至氣機(jī)受阻于鼻竅是AR的病因機(jī)制。根據(jù)氣竅一體理論，結(jié)合脾主運(yùn)化中醫(yī)基礎(chǔ)，課題組提出健脾中藥補(bǔ)氣通竅方。通過(guò)前期研究觀察發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)氣通竅方能有效緩解AR 患者鼻炎癥狀，且總有效率高于對(duì)照組［11］。腸道微生態(tài)是中藥復(fù)方發(fā)揮療效作用的主要途徑之一，因此課題組推測(cè)補(bǔ)氣通竅方可能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)進(jìn)而改善AR。2022 年11 月—2023 年7 月，本研究通過(guò)構(gòu)建大鼠AR 模型，探討補(bǔ)氣通竅方對(duì)大鼠AR 癥狀的改善作用以及對(duì)腸道微生態(tài)的潛在調(diào)節(jié)作用。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料 SPF 級(jí)健康Wistar大鼠40只，6～8周齡，體質(zhì)量約250 g，購(gòu)于湖南省長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0014。補(bǔ)氣通竅方中藥配方顆粒劑（黃芪20 g、黨參12 g、甘草12 g、蒼耳子20 g、辛夷花10 g、細(xì)辛3 g、荊芥15 g、桔梗10 g、升麻10 g、柴胡10 g）由江陰天江（廣州）藥業(yè)有限公司提供，鼻炎康片（德眾）購(gòu)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。卵清蛋白購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，β-actin、NF-κB p65抗體購(gòu)于美國(guó)Affinity公司。生物顯微鏡購(gòu)于日本奧林巴斯，測(cè)序儀、建庫(kù)試劑盒NEB Next?Ultra DNA Library Prep Kit 購(gòu)于美國(guó)Illumina 公司，PCR 產(chǎn)物純化Universal DNA 純化回收試劑盒購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 動(dòng)物分組建模與藥物干預(yù) 40 只Wistar 大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、補(bǔ)氣通竅方組及鼻炎康組，每組10 只。除對(duì)照組外，各組均根據(jù)前期造模方式［12］建立大鼠AR 模型。將卵清蛋白、氫氧化鋁、生理鹽水按照0.3 mg、30 mg、1 mL 的比例充分混勻，腹腔注射，2 天1 次，共注射14 d、7 次；第15 天起，大鼠兩側(cè)鼻孔各滴50 μL 10%卵清蛋白溶液（生理鹽水配置），1天1次，共滴7 d、7次［13］。自第22 天起，模型組給予4 mL/d 純凈水灌胃，補(bǔ)氣通竅方組給予補(bǔ)氣通竅方57.55 g/（kg·d）灌胃［14］，鼻炎康組給予鼻炎康462.5 mg/（kg·d）灌胃，共灌胃7 d、7次；對(duì)照組常規(guī)喂養(yǎng)不灌胃。

1.3 動(dòng)物行為學(xué)積分評(píng)價(jià) 各組每次灌胃結(jié)束后觀察記錄大鼠30 min 內(nèi)抓鼻、噴嚏及流涕的癥狀發(fā)生情況并進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：30 min 內(nèi)噴嚏1～3 次計(jì)1 分、4～10 次計(jì)2 分、≥11 次計(jì)3 分；抓鼻1～5 次計(jì)1 分、6～15 次計(jì)2 分、＞15 次計(jì)3 分；流涕流至鼻孔前計(jì)1 分、流出鼻孔前計(jì)2 分、涕流滿面計(jì)3 分。以疊加法統(tǒng)計(jì)動(dòng)物行為學(xué)積分，總分越高代表鼻炎癥狀越重。

1.4 脾臟、結(jié)腸及鼻黏膜組織樣本采集 各組末次灌胃結(jié)束后禁食不禁水12 h，采用10%水合氯醛按3 mL/kg 劑量麻醉，以腹中線為切口暴露腹腔，腹主動(dòng)脈采血，分離脾臟于凍存管中置于-80 ℃冰箱備檢。剪取近直腸端結(jié)腸組織約2 cm（包含至少2 粒糞便顆粒），保存于-80 ℃冰箱備檢。沿大鼠雙眼眶剪下鼻骨，鉗出鼻中隔，剝離鼻中隔兩側(cè)鼻黏膜組織，40 g/L多聚甲醛固定。

1.5 鼻黏膜組織病理學(xué)觀察 各組鼻黏膜組織采用多聚甲醛固定12 h以上，以50%、75%、95%、100%梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋后切片，厚度約5 μm。常規(guī)HE 染色，顯微鏡下觀察鼻黏膜纖毛狀態(tài)、腺體的病理改變及嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)程度。

1.6 脾臟組織NF-κB p65 蛋白檢測(cè) 采用Western blotting 法。各組剪取少許脾臟組織并碾碎，加入蛋白裂解液充分裂解后于4 ℃離心機(jī)12 000 r/min 離心15 min 取上清液，配置BSA 標(biāo)準(zhǔn)品及BCA 工作液測(cè)定蛋白濃度。將所取蛋白變性后依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、一抗、二抗、顯色。采用BandScan 軟件分析條帶灰度值。

1.7 腸道菌群多樣性及豐度檢測(cè) 按照DNA 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行腸道內(nèi)容物的細(xì)菌微生物基因組DNA 提取，將16 S rRNA 的V3～V4 區(qū)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后使用高通量測(cè)序儀Miseq 對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。統(tǒng)計(jì)各組包含的腸道菌群種類(lèi)，采用偏最小二乘法判別分析法（PLS-DA）對(duì)各組腸道菌群進(jìn)行判別分析；通過(guò)Beta 多樣性指數(shù)基于Bray Curtis距離、Weighted Unifrac 距離及Unweighted Unifrac距離，采用無(wú)度量多維標(biāo)定法（NMDS）比較各組大鼠菌群結(jié)構(gòu)差異。采用線性判別分析（LEfSe）法分析比較各組腸道微生態(tài)特定菌屬相對(duì)豐度的差異，設(shè)計(jì)LDA 效應(yīng)值＞4 為豐度顯著差異物種。去掉極端值后，統(tǒng)計(jì)各組乳桿菌科相對(duì)豐度并進(jìn)行比較。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0 軟件統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料采用Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素ANOVA 檢驗(yàn)，重檢驗(yàn)復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組動(dòng)物行為學(xué)積分比較 模型組、補(bǔ)氣通竅方組及鼻炎康組各時(shí)點(diǎn)動(dòng)物行為學(xué)積分均高于對(duì)照組；灌胃2 d 后，補(bǔ)氣通竅方組動(dòng)物行為學(xué)積分均低于模型組；灌胃3 d 后，鼻炎康組動(dòng)物行為學(xué)積分均低于模型組（P均＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組動(dòng)物行為學(xué)積分比較（分，）

表1 各組動(dòng)物行為學(xué)積分比較（分，）

注：與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，*P＜0.05；與模型組同時(shí)點(diǎn)比較，#P＜0.05。

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2.2 各組鼻黏膜組織病理學(xué)觀察結(jié)果 對(duì)照組鼻黏膜假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮清晰可見(jiàn)，固有層無(wú)水腫、充血等病理改變；模型組鼻黏膜纖毛排列雜亂，可見(jiàn)纖毛脫落及倒伏現(xiàn)象，可見(jiàn)較多嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，小血管明顯增生擴(kuò)張，腺體數(shù)量明顯增加；補(bǔ)氣通竅方組及鼻炎康組固有層黏膜較為完整，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度較模型組減少，無(wú)明顯腺體增生，鼻黏膜病理情況好轉(zhuǎn)。見(jiàn)OSID碼圖1。

2.3 各組脾臟組織NF-κB p65 蛋白表達(dá)比較 對(duì)照組、模型組、補(bǔ)氣通竅方組及鼻炎康組脾臟組織NF-κB p65 蛋白表達(dá)分別為1.00 ± 0.03、1.79 ±0.10、1.24 ± 0.11、1.33 ± 0.07，脾臟組織NF-κB p65 蛋白表達(dá)模型組＞補(bǔ)氣通竅方組、鼻炎康組，模型組＞對(duì)照組（P均＜0.05）。

2.4 各組腸道菌群多樣性及豐度比較 16 S rRNA 基因測(cè)序顯示，對(duì)照組、模型組、補(bǔ)氣通竅方組及鼻炎康組分別包含3 687、1 641、1 222、891 種菌群（OSID 碼圖2）。PLS-DA 分析顯示，各組大鼠腸道菌群分離，存在各自獨(dú)特的腸道菌群（OSID碼圖3）；NMDS 分析顯示，各組大鼠兩兩比較，組間菌群結(jié)構(gòu)存在差異（P均＜0.05，OSID 碼圖4）。LEfSe 分析結(jié)果顯示，對(duì)照組中厚壁菌門(mén)及其分類(lèi)下的乳桿菌目、乳桿菌科、乳桿菌屬、芽孢桿菌綱富集；模型組中梭菌綱、瘤胃球菌屬以及梭菌目富集；補(bǔ)氣通竅方組中擬桿菌目、擬桿菌綱、擬桿菌門(mén)富集；鼻炎康組中密螺旋體屬、螺旋體門(mén)、螺旋體綱、螺旋體目、螺旋體科以及普雷沃菌科富集；在菌屬水平上，各組大鼠的腸道菌群特定菌屬具有顯著差異（LDA＞4，OSID 碼圖5）。在科水平上，對(duì)照組、模型組、補(bǔ)氣通竅方組及鼻炎康組乳桿菌科相對(duì)豐度分別為58.35% ± 5.21%、36.57% ± 6.98%、50.76% ± 9.81%、47.06% ± 6.24%，乳桿菌科相對(duì)豐度對(duì)照組＞補(bǔ)氣通竅方組、鼻炎康組＞模型組（P均＜0.05）。

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，鼻與脾臟關(guān)系密切，鼻病的發(fā)生發(fā)展與脾臟功能改變有關(guān)。在中醫(yī)古籍中就有“鼻準(zhǔn)屬脾土”“脾熱病者，鼻先赤”等記載，中醫(yī)對(duì)AR的治療常采用健脾益肺療法［15］。本課題組創(chuàng)新性提出氣虛竅阻的AR 病因機(jī)制，根據(jù)氣竅一體、脾主運(yùn)化的治療思路創(chuàng)制中藥補(bǔ)氣通竅方。方中黃芪、甘草有益于脾肺之氣；辛夷花、蒼耳子在現(xiàn)代中醫(yī)常用作治療鼻疾病的藥物，有通鼻竅之妙用；細(xì)辛、荊芥、桔梗、升麻、柴胡具有驅(qū)寒升陽(yáng)的作用；加之黨參、甘草的調(diào)和作用可健脾益氣。鼻炎康是治療AR 的常用藥物，其治療作用已被臨床證實(shí)，因此本研究選擇鼻炎康作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。本研究發(fā)現(xiàn)，灌胃治療過(guò)程中補(bǔ)氣通竅組及鼻炎康組大鼠動(dòng)物行為學(xué)評(píng)分總體呈下降趨勢(shì)，兩組大鼠由于AR 所導(dǎo)致的抓鼻、噴嚏等行為均得到緩解。經(jīng)補(bǔ)氣通竅方治療的AR 大鼠鼻黏膜病理?yè)p傷優(yōu)于模型組，其黏膜完整性及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度等病理情況明顯改善，改善效果與鼻炎康組基本一致，提示補(bǔ)氣通竅方可有效減輕大鼠AR 鼻黏膜病理改變，從而改善大鼠AR 癥狀。

AR 是由輔助型T 淋巴細(xì)胞1（Th1）/Th2 免疫應(yīng)答失衡而引發(fā)的以鼻腔黏膜Th2 免疫反應(yīng)為主的變應(yīng)性炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為大量表達(dá)Th2 細(xì)胞因子的Th 細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)引發(fā)炎癥反應(yīng)過(guò)程。有研究表明，TLR4/NF-κB 信號(hào)通路在AR 的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用［16］。作為一種轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB 幾乎存在于所有細(xì)胞類(lèi)型中，能與細(xì)胞核內(nèi)的多種基因位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)該基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，參與炎癥、免疫等生物學(xué)過(guò)程，是變態(tài)反應(yīng)性疾病發(fā)生發(fā)展復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的中心環(huán)節(jié)。NF-κB活化后，可從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)一系列免疫相關(guān)反應(yīng)，產(chǎn)生大量TNF-α、IL-4 等促炎因子，導(dǎo)致Th2 細(xì)胞增多并促進(jìn)B 淋巴細(xì)胞的增殖分化，從而介導(dǎo)AR 的發(fā)生發(fā)展。NF-κB p65 是NF-κB 家族的重要成員之一，可以形成二聚體參與NF-κB 誘導(dǎo)過(guò)程，產(chǎn)生相應(yīng)炎癥反應(yīng)，與AR 的發(fā)病聯(lián)系緊密。本研究結(jié)果顯示，模型組脾臟組織NF-κB p65 蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，而經(jīng)過(guò)補(bǔ)氣通竅方治療后，補(bǔ)氣通竅方組脾臟組織NF-κB p65 蛋白表達(dá)較模型組降低，提示補(bǔ)氣通竅方可能通過(guò)抑制NF-κB p65 發(fā)揮對(duì)AR 的治療作用。

腸道菌群是定植在消化道中數(shù)以億計(jì)的微生物，包括細(xì)菌、真菌、古菌和病毒。腸道微生態(tài)暫未被明確定義，但其具備相對(duì)量較大的生物多樣性以及在某種水平上具有特定菌群的相對(duì)豐度。中醫(yī)學(xué)提出脾主運(yùn)化及脾胃學(xué)說(shuō)，與腸道微生態(tài)聯(lián)系緊密，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)是健脾中藥的治療本質(zhì)之一，具有調(diào)節(jié)脾胃功能的中藥方可糾正腸道微生態(tài)［17］。NIEWIEM 等［18］發(fā)現(xiàn)腸道通透性增加與包括AR 在內(nèi)的過(guò)敏性疾病密切相關(guān)，適當(dāng)補(bǔ)充益生菌改善腸道屏障功能可以降低過(guò)敏性疾病的發(fā)生率。乳桿菌是一種公認(rèn)的益生菌，研究發(fā)現(xiàn)其具備治療AR 的潛力，且對(duì)NF-κB p65 具有調(diào)節(jié)作用。多項(xiàng)研究表明，給予乳桿菌菌株可以對(duì)AR患者產(chǎn)生積極的影響，且尚未出現(xiàn)負(fù)面報(bào)道［19］。TRAPECAR 等［20］研究發(fā)現(xiàn)，部分乳桿菌成員可誘導(dǎo)觸發(fā)腸上皮細(xì)胞中NF-κB p65 易位，將該信號(hào)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為吞噬細(xì)胞來(lái)促進(jìn)免疫應(yīng)答。KIM等［21］發(fā)現(xiàn)乳桿菌發(fā)酵甜菜根汁提取物可抑制脂多糖誘導(dǎo)的NF-κB p65 核易位，抑制NF-κB 信號(hào)通路中促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生。本研究通過(guò)16 S rRNA 基因測(cè)序及PLS-DA 分析發(fā)現(xiàn)，各組大鼠均有各自獨(dú)特的腸道菌種；NMDS 分析結(jié)果顯示，各組大鼠兩兩相比較，組間菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異；LEfse 分析結(jié)果顯示，各組大鼠的腸道菌群特定菌屬具有顯著差異。進(jìn)一步比較各組乳桿菌科相對(duì)豐度發(fā)現(xiàn)，模型組乳桿菌科相對(duì)豐度較對(duì)照組降低，而經(jīng)過(guò)補(bǔ)氣通竅方治療后乳桿菌科相對(duì)豐度較模型組上升，且補(bǔ)氣通竅方組略高于鼻炎康組，但兩者比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

綜上所述，補(bǔ)氣通竅方可改善大鼠AR 的鼻炎癥狀，修復(fù)鼻黏膜組織病理?yè)p傷，其機(jī)制可能與提高乳桿菌相對(duì)豐度調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)，下調(diào)脾臟組織NF-κB p65 蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究同時(shí)觀察到，各組NF-κB p65 蛋白表達(dá)與乳桿菌科的相對(duì)豐度總體呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，但其關(guān)聯(lián)程度及影響機(jī)制仍需后續(xù)進(jìn)一步研究。