圖拉妮薩·喀迪爾，張貽幗，景祎馨，廖師師，羅杰，丁可，陳榕，孟慶濤

武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科，武漢 430060

缺血再灌注損傷是由于組織長(zhǎng)時(shí)間缺血后血流灌注恢復(fù)所致，當(dāng)缺血組織恢復(fù)血流時(shí)，會(huì)加重缺血的有害影響，增強(qiáng)組織缺氧，激活先天免疫，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)及細(xì)胞死亡［1］。腸缺血再灌注損傷是外科手術(shù)導(dǎo)致腸組織損害的重要原因，與腸扭轉(zhuǎn)、腸移植、重度燒傷、創(chuàng)傷及休克等許多病理生理過(guò)程有關(guān)［2］。腸缺血再灌注損傷可導(dǎo)致腸黏膜屏障缺失，使內(nèi)毒素及有害物質(zhì)釋放入血，嚴(yán)重時(shí)可引起多器官功能障礙綜合征［3］。目前腸缺血再灌注損傷的具體病理生理機(jī)制仍未明確，線粒體功能障礙被認(rèn)為是導(dǎo)致腸缺血再灌注損傷的關(guān)鍵因素。線粒體是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器，能夠不斷進(jìn)行裂變和融合，以保持其形狀、分布及大小，從而應(yīng)對(duì)細(xì)胞的生理需求及外部環(huán)境的變化［4］。越來(lái)越多的研究表明，有效抑制線粒體裂變可以保護(hù)各種組織免受缺血再灌注損傷等應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷［5］。動(dòng)力蛋白相關(guān)蛋白1（Drp1）是線粒體裂變的主要介質(zhì)，可以加速線粒體分裂，產(chǎn)生大量片段化的線粒體，在線粒體裂變的調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用。然而，Drp1 是否能通過(guò)介導(dǎo)線粒體裂變?cè)谀c缺血再灌注損傷中發(fā)揮作用尚不可知。2022 年5 月—2023 年8 月，本研究通過(guò)對(duì)人大腸黏膜上皮細(xì)胞Caco-2進(jìn)行缺氧復(fù)氧（H/R）處理建立體外腸缺血再灌注損傷模型，觀察在體外模型中抑制Drp1 對(duì)腸缺血再灌注損傷的影響，探討線粒體動(dòng)力學(xué)在腸缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制，以期為腸缺血再灌注損傷的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人大腸黏膜上皮細(xì)胞系Caco-2 購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司，線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒、CCK-8 試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，線粒體超氧化物試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，Annexin V-EGFP/PI 凋亡試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，Drp1抗體購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司，線粒體融合蛋白2（Mfn2）抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2 細(xì)胞分組及H/R 模型建立 Caco-2 細(xì)胞使用含20%胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合至80%時(shí)消化傳代。將Caco-2 細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組、Drp1 抑制劑組，每組6個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組正常培養(yǎng)細(xì)胞，模型組、Drp1抑制劑組均采用缺氧12 h 后復(fù)氧2 h 的方法構(gòu)建H/R模型，Drp1 抑制劑組在H/R 前給予Drp1 抑制劑Mdivi-1干預(yù)1 h。

1.3 細(xì)胞活力觀察 采用CCK-8 法。各組進(jìn)行不同處理之后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入含10% CCK-8的培養(yǎng)基100 μL，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中孵育2 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處各孔光密度（OD）值。

1.4 細(xì)胞線粒體功能觀察 ①線粒體活性氧（ROS）含量：采用線粒體超氧化物指示劑法。各組進(jìn)行不同處理之后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使用線粒體超氧化物指示劑檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體ROS 含量，按照線粒體超氧化物試劑盒說(shuō)明書配置工作液，每孔加入2 mL 工作液覆蓋細(xì)胞，于37 ℃避光孵育10 min，用預(yù)熱的緩沖液洗滌3次，熒光顯微鏡下觀察，采集相應(yīng)的圖像，Image J 軟件分析ROS 平均熒光強(qiáng)度。②線粒體膜電位：采用JC-1 法。取分組處理后的各組細(xì)胞，用PBS 緩沖液洗滌2 次，配置JC-1 染色工作液和緩沖液，加入1 mL JC-1 染色緩沖液洗滌2 次。熒光顯微鏡下觀察并拍照，采用Image J 軟件分析各組平均熒光強(qiáng)度，表示線粒體膜電位大小。

1.5 細(xì)胞凋亡率測(cè)算 采用流式細(xì)胞術(shù)。取各組分組處理后培養(yǎng)24 h 的細(xì)胞，用不含EDTA 的胰酶消化，離心收集細(xì)胞，PBS 緩沖液洗滌2 次，加入100 μL結(jié)合液重懸，分別加入 2.5 μL FITC Annexin V及2.5 μL PI 染色液輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，加入400 μL 結(jié)合液重懸，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，嚴(yán)格參照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.6 細(xì)胞Drp1、Mfn2 蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。取各組分組處理后培養(yǎng)24 h的細(xì)胞，PBS緩沖液清洗，加入細(xì)胞裂解液，超聲、低溫12 000 r/min離心，收集蛋白上清液，使用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。100 ℃變性10 min，使用SDS-PAG 凝膠快速試劑盒制膠，電泳，轉(zhuǎn)至PVDP膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入Drp1（1∶1 000）、Mfn2（1∶1 000），β-actin（1∶1 000）一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌，室溫孵育相應(yīng)二抗，TBST 洗滌，加入ECL 化學(xué)發(fā)光液，上機(jī)顯影。采用Image J 軟件分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用K-S正態(tài)性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布時(shí)以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量的方差分析；非正態(tài)分布時(shí)以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞活力比較 對(duì)照組、模型組、Drp1 抑制劑組細(xì)胞活力分別為98.47 ± 1.60、41.90 ±3.30、78.80 ± 2.75，細(xì)胞活力對(duì)照組＞Drp1 抑制劑組＞模型組（P均＜0.05）。

2.2 各組細(xì)胞內(nèi)線粒體ROS 含量及線粒體膜電位比較 細(xì)胞內(nèi)線粒體ROS 含量模型組＞Drp1 抑制劑組＞對(duì)照組，線粒體膜電位對(duì)照組＞Drp1 抑制劑組＞模型組（P均＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞內(nèi)線粒體ROS含量及線粒體膜電位比較（）

表1 各組細(xì)胞內(nèi)線粒體ROS含量及線粒體膜電位比較（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

?

2.3 各組細(xì)胞凋亡率比較 對(duì)照組、模型組、Drp1抑制劑組細(xì)胞凋亡率分別為7.38% ± 0.68%、19.63% ± 1.31%、14.22% ± 0.89%，細(xì)胞凋亡率模型組＞Drp1抑制劑組＞對(duì)照組（P均＜0.05）。

2.4 各組細(xì)胞Drp1、Mfn2 蛋白表達(dá)比較 細(xì)胞Drp1蛋白表達(dá)模型組＞Drp1抑制劑組＞對(duì)照組，Mfn2蛋白表達(dá)對(duì)照組＞Drp1 抑制劑組＞模型組（P均＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞Drp1、Mfn2蛋白表達(dá)比較（）

表2 各組細(xì)胞Drp1、Mfn2蛋白表達(dá)比較（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

?

3 討論

腸缺血再灌注損傷是臨床常見(jiàn)的組織器官損傷之一，往往導(dǎo)致腸道損傷及多個(gè)器官功能障礙，甚至危及生命［6-7］。腸缺血階段發(fā)生線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激及代謝紊亂，可誘發(fā)腸細(xì)胞損傷，血供恢復(fù)后大量炎癥因子和氧自由基釋放，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，引起廣泛的腸上皮細(xì)胞死亡，導(dǎo)致腸黏膜屏障功能受損，細(xì)菌、炎癥因子及內(nèi)毒素釋放進(jìn)入循環(huán)，引起全身炎癥反應(yīng)綜合征，進(jìn)而導(dǎo)致多器官功能障礙［8］。腸缺血再灌注損傷機(jī)制復(fù)雜，因而目前相關(guān)機(jī)制研究尚不完善。本研究使用人大腸黏膜上皮細(xì)胞Caco-2進(jìn)行H/R，體外模擬腸缺血再灌注損傷，探討維持線粒體功能在腸缺血再灌注損傷中的作用，為腸缺血再灌注損傷的治療提供理論依據(jù)。

線粒體質(zhì)量控制對(duì)于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。過(guò)度的細(xì)胞外應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致線粒體穩(wěn)態(tài)失衡，從而引起能量代謝紊亂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［9］。線粒體動(dòng)力學(xué)是線粒體裂變與融合的動(dòng)態(tài)平衡，保持裂變與融合的穩(wěn)態(tài)是維持線粒體質(zhì)量最重要的環(huán)節(jié)［10］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，線粒體動(dòng)力學(xué)在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用［4，11］。Drp1 主要介導(dǎo)線粒體分裂，而Mfn2主要介導(dǎo)線粒體融合，Drp1、Mfn2參與調(diào)控線粒體內(nèi)膜及外膜的融合與分裂過(guò)程［12］。本研究中使用Drp1 抑制劑Mdivi-1 對(duì)Caco-2 細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，觀察了H/R 刺激下線粒體功能及線粒體分裂與融合的變化。

線粒體是細(xì)胞能量轉(zhuǎn)換和新陳代謝的重要細(xì)胞器，也是氧化磷酸化合成ATP 的主要場(chǎng)所。線粒體膜電位是三羧酸循環(huán)相關(guān)氧化還原過(guò)程中產(chǎn)生的電化學(xué)勢(shì)能，正常的線粒體膜電位是維持線粒體進(jìn)行氧化磷酸化產(chǎn)生ATP 的先決條件。線粒體膜電位不僅反映了線粒體功能的完整性，同時(shí)也反映了細(xì)胞的健康狀況，對(duì)細(xì)胞的生存和發(fā)展至關(guān)重要。因此，線粒體膜電位是評(píng)價(jià)線粒體功能的重要指標(biāo)之一。線粒體是細(xì)胞產(chǎn)生ROS 的主要場(chǎng)所，ROS 是細(xì)胞氧化呼吸的正常代謝產(chǎn)物，可作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子參與調(diào)節(jié)機(jī)體正常生理功能。當(dāng)組織受損時(shí)，線粒體內(nèi)ROS 產(chǎn)生大量增加，過(guò)多的ROS 會(huì)損害線粒體，導(dǎo)致線粒體功能異常。因此，ROS含量可在一定程度上反映線粒體功能。本研究結(jié)果顯示，使用H/R刺激Caco-2 細(xì)胞可引起細(xì)胞活性降低，出現(xiàn)線粒體膜電位下降，ROS生成增多的線粒體功能障礙表現(xiàn)。而經(jīng)Drp1抑制劑干預(yù)的H/R模型細(xì)胞，細(xì)胞活性升高，線粒體膜電位升高，細(xì)胞ROS 生成減少，線粒體功能明顯改善。以上結(jié)果提示，抑制線粒體分裂可能通過(guò)減輕線粒體功能障礙來(lái)抑制H/R 引起的腸細(xì)胞損傷。

Drp1 不僅是線粒體分裂的重要參與者，還參與了程序性細(xì)胞死亡途徑。缺血誘導(dǎo)激活的Drp1 可導(dǎo)致線粒體過(guò)度分裂，線粒體膜通透性增加，并通過(guò)誘導(dǎo)線粒體BAX 易位增加細(xì)胞色素C 從線粒體向細(xì)胞質(zhì)的釋放，并激活Caspase-3 及Caspase-9 信號(hào)通路，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞凋亡［13-14］。本研究發(fā)現(xiàn)，Caco-2細(xì)胞在H/R 刺激下細(xì)胞凋亡率增加，選擇性抑制Drp1 后Caco-2 細(xì)胞凋亡率少于模型組，這可能與直接抑制Drp1減弱了程序性細(xì)胞凋亡有關(guān)。

有研究顯示，Drp1或Mfn2基因的調(diào)控在小鼠線粒體衰老及線粒體功能障礙中起著至關(guān)重要的作用，敲除小鼠Drp1 可加速線粒體衰老及功能障礙［15］。另有研究表明，Drp1 參與急性腎損傷、膿毒癥心肌細(xì)胞損傷、缺血再灌注損傷，阿爾茲海默癥等多種疾病的發(fā)生發(fā)展，在以上疾病模型中敲除Drp1或者使用Drp1 抑制劑之后均能起到保護(hù)線粒體功能、減輕損傷的治療作用［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，Caco-2細(xì)胞在H/R刺激下Drp1蛋白表達(dá)上調(diào)，呈過(guò)度分裂狀態(tài)；而Mfn2蛋白表達(dá)下調(diào)，線粒體融合受到抑制，細(xì)胞處于線粒體動(dòng)力學(xué)失衡狀態(tài)，提示H/R 損傷的發(fā)病機(jī)制可能與細(xì)胞的線粒體動(dòng)力學(xué)穩(wěn)態(tài)失衡有關(guān)。而Drp1 抑制劑預(yù)干預(yù)H/R 模型細(xì)胞后，Drp1 蛋白表達(dá)降低，Mfn2 蛋白表達(dá)升高，提示H/R 刺激引起的線粒體過(guò)度分裂現(xiàn)象得到緩解，線粒體融合增加，線粒體分裂與融合趨于平衡。這提示在腸缺血再灌注損傷中抑制Drp1 有助于維持線粒體動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定，減輕細(xì)胞線粒體功能障礙，從而減輕細(xì)胞損傷。

綜上所述，Drp1 抑制劑可減輕腸黏膜上皮細(xì)胞缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與改善線粒體功能障礙，減少細(xì)胞凋亡有關(guān)。然而，Drp1 調(diào)控線粒體功能的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究，后續(xù)仍需要進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證以上結(jié)論。