阿迪萊·艾合麥提托合提，艾尼娃爾·艾克木，2，3，4，是文輝，方磊，楊濤，伊力亞爾·尼加提3，4，

1 新疆醫(yī)科大學藥學院，烏魯木齊 830011；2 新疆維吾爾醫(yī)學?？茖W校藥學系；3 新疆和田特色中醫(yī)藥研究重點實驗室；4 新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾藥材及制劑質量控制工程研究中心；5 新疆烏魯木齊市軍區(qū)總醫(yī)院重點實驗室；6 新疆醫(yī)科大學中心實驗室；

低壓低氧（HH）是由于暴露于高原環(huán)境所導致的一種應激性環(huán)境條件［1］。心臟作為耗氧量較高的器官，向其提供充足的氧氣對維持心肌細胞活力和功能至關重要［2］。當機體長時間處于HH環(huán)境下，心肌細胞供氧減少，可能加重或誘發(fā)心血管疾?。?］。目前臨床上治療HH 誘發(fā)的心肌損傷的方法有高壓氧、鈣拮抗劑等，然而這些治療效果仍然不十分理想且不良反應較多。為了開發(fā)更有效的治療藥物，進一步提高用藥物安全性，越來越多的研究人員將目光專注于天然中草藥及其單體化合物。沒食子酸（GA）又稱五倍子酸，是一種天然產(chǎn)物化學成分，存在于五倍子、漆樹、茶等植物中，具有抗氧化、抗炎、促進腫瘤細胞凋亡及保護心腦血管的作用［4］。然而，GA對心肌抗氧化損傷的綜合作用機制仍不十分明確。2021 年7 月—2023 年9 月，本研究通過建立大鼠體內(nèi)外低氧損傷模型，觀察GA 對HH 誘發(fā)心肌損傷的改善作用，并探討其相關機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料 雄性無特定病原體SD 大鼠30 只，體質量（200 ± 30）g，由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SYSK（xin）2020-003；大鼠心肌細胞H9C2 購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。GA（純度≥98.0%，上海源葉生物科技有限公司），Hochst33342（北京索萊寶科技有限公司），活性氧（ROS）試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），雙抗/青鏈霉素合劑、0.25%胰酶-EDTA消化液（美國Hyclone 公司），胎牛血清（美國Gbico 公司），二甲基亞砜DMSO（美國MP Biomedicals 公司），MTT（美國Sigma 公司），凋亡試劑盒（美國BD 公司），BCA 蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），β-actin、B 淋巴細胞瘤2（Bcl-2）、Bcl-2 關聯(lián)X 蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）抗體（北京Affinity 公司），丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化氫酶（GSH-Px）、一氧化氮合酶（iNOS）、內(nèi)皮素1（ET-1）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）。BD 流式細胞儀（美國BD公司），蛋白質電泳系統(tǒng)套裝（美國Bio-Rad 公司），正置激光共聚焦顯微鏡（日本Nikon 公司），心臟超聲探頭（美國PHILIPS 公司），多功能酶標儀（北京悅昌行科技有限公司），化學發(fā)光蛋白質印跡成像定量分析儀（美國Protein Simple 公司），高低速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）。

1.2 GA改善HH誘發(fā)心肌損傷的體內(nèi)觀察

1.2.1 大鼠心肌損傷模型建立及分組處理 30 只SD 大鼠隨機分為正常組、HH 模型組、GA 低劑量組、GA 中劑量組、GA 高劑量組，每組6 只。除正常組外，各組均在模擬海拔5 000 m 的HH 艙中暴露30 d建立SD大鼠慢性高原病模型，實驗艙的環(huán)境條件為海拔5 000 m，大氣壓54.1 kPa，氧分壓10.84 kPa，溫度18～26 ℃，濕度40%～60%。將SD大鼠分籠飼養(yǎng)在實驗艙內(nèi)，在造模過程中每日檢查并記錄各組SD 大鼠的毛發(fā)脫落、口腔、鼻腔、眼分泌物等情況。GA 低、中、高劑量組在建模后分別給予12.5、25.0、50.0 mg/kg 的GA 灌胃，每天1 次，正常組及HH 模型組給予等量生理鹽水灌胃，持續(xù)15 d。各組均給予普通飼料喂養(yǎng)，自由取食和飲水。

1.2.2 大鼠心功能觀察 采用心臟超聲檢測。腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，超聲心動圖檢測大鼠的心臟功能，常規(guī)探查大鼠胸骨旁、心尖四腔切面，包括右心室射血期（RVET）、右心室射血前期（RPEP）、射血分數(shù)（EF）、肺動脈壓加速時間（PAAT），檢測由有超聲工作經(jīng)歷的專業(yè)技術人員進行操作。

1.2.3 大鼠血清氧化應激指標檢測 各組均采用腹主動脈取血方式收集血液，室溫下放置30 min，4～5 ℃，3 000 r/min 離心20 min，取上清液，嚴格按照生化試劑盒操作說明書測定氧化應激指標MDA、SOD、GSH-Px。

1.2.4 大鼠心肌組織病理學觀察 采用HE 染色。末次給藥24 h后收集各組大鼠心肌組織，固定48 h，在低熔點石蠟中浸潤并包埋制成蠟塊，將蠟塊里的組織制成切片，使用乙醇展開并放在載玻片上烘干，隨后將蠟塊脫蠟，HE 染色，乙醇脫水，滴加中性樹膠，制作成組織切片，在光學顯微鏡下察看并拍照。

1.2.5 大鼠心肌組織血管內(nèi)皮功能指標檢測 采用ELISA 法。取各組大鼠心肌組織，采用ELISA 試劑盒檢測血管內(nèi)皮功能指標iNOS、ET-1，所有操作嚴格按照相應試劑盒說明書步驟進行。

1.3 GA改善HH誘發(fā)心肌損傷的體外觀察

1.3.1 大鼠心肌細胞分組及模型建立 心肌細胞H9C2 培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基中，待細胞培養(yǎng)至融合度70%～80%，取狀態(tài)良好的細胞，以1 × 105/mL 接種于6孔板內(nèi)培養(yǎng)，細胞貼壁生長至70%時，分為正常組、模型組、GA 低劑量組、GA 中劑量組、GA 高劑量組。根據(jù)前期預實驗結果，在GA 低、中、高劑量組分別加入0.075、0.100、0.125 μmol/L 的GA 處理，正常組不做處理正常培養(yǎng)，其余各組均在三氣培養(yǎng)箱中（1% O2、5% CO2、92% N2）中培養(yǎng)24 h 構建H9C2心肌細胞低氧損傷模型。

1.3.2 大鼠心肌細胞形態(tài)學觀察 各組繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

1.3.3 大鼠心肌細胞凋亡情況觀察 各組繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后取出6 孔板，收集原培養(yǎng)基，預冷PBS 清洗各組細胞并將PBS 與原培養(yǎng)液合并，胰酶消化細胞脫落后，加入收集的原培養(yǎng)基終止消化，收集細胞并以1 000 r/min 離心5 min 棄去上清，2 mL 預冷PBS清洗細胞3 次。清洗完成后棄去上清，每個離心管中加入100 μL 溶液（Buffer∶PBS=1∶9 配制）重懸細胞。準備10 個1.5 mL 的EP 管，3 個正常調劑組，分別為不染色組、5 μL AnnexinV-FITC 單染組、5 μL PI單染組，其余正常組和模型組均加入Annexin VFITC及PI各5 μL混勻后室溫下避光染色15 min，染色完成后每管再補加400 μL Bingding Buffer 混勻細胞，尼龍膜過濾后，流式細胞儀檢測。重復3 次，計算細胞凋亡率。

1.3.4 大鼠心肌細胞ROS水平檢測 采用DCFH-DA熒光探針染色。各組繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，棄去原培養(yǎng)基，PBS清洗3次，每次5 min。入無血清培養(yǎng)基稀釋的活性氧染色（DCFH-DA∶DMEM=1∶1 000）工作液37 ℃避光染色30 min 后，再使用無血清培養(yǎng)基洗滌3次，收集細胞后上流式細胞儀檢測。

1.3.5 大鼠心肌細胞凋亡相關蛋白檢測 采用Western blotting 法。各組細胞蛋白以RIPA 裂解液研磨后進行離心取上清，并采用BCA 法對蛋白進行定量，再經(jīng)電泳、轉膜、封閉，加入細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3、β-actin 一抗封閉過夜；PBST溶液洗膜，加入相應二抗溶液，使用ECL 成像系統(tǒng)采集圖像，并使用Image J 軟件分析條帶的灰度值。以β-actin 作為內(nèi)參，以目的條帶與對照條帶灰度比值作為目的蛋白相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用Graphpad9.0 統(tǒng)計軟件。計量資料正態(tài)性分析采用Kolmogorov-Smirnov檢驗，符合正態(tài)分布的資料以表示，組間比較行LSD檢驗；計數(shù)資料以n（%）表示，組間比較行χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 GA改善HH誘發(fā)心肌損傷的體內(nèi)觀察結果

2.1.1 各組大鼠心功能相關指標比較 與正常組比較，HH 模型組及GA 低、中、高劑量組PAAT 均降低，但HH 模型組降低更明顯；RPEP 均升高，但HH模型組升高更明顯（P均＜0.05）。各組大鼠EF、RVET比較差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 各組心功能相關指標比較（）

表1 各組心功能相關指標比較（）

注：與正常組比較，*P＜0.05。

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2.1.2 各組大鼠血清氧化應激指標比較 與正常組比較，HH模型組及GA低、中、高劑量組血清SOD、GSH-Px均降低，但HH模型組降低更明顯；血清MDA均升高，但HH模型組升高更明顯（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組血清氧化應激指標比較（）

表2 各組血清氧化應激指標比較（）

注：與正常組比較，*P＜0.05。

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2.1.3 各組大鼠心肌組織病理學觀察結果 正常組心肌纖維排列整齊，結構正常，細胞質呈橫紋狀，炎癥細胞較少，少數(shù)心肌細胞水腫，少量紅細胞浸潤，大部分心肌纖維有一個核，核呈卵圓形。HH 模型組心肌纖維排列松散，可見炎癥細胞浸潤，部分心肌細胞水腫并有紅細胞浸潤，高倍顯微鏡下大部分細胞質橫紋不清晰，部分細胞核形態(tài)不規(guī)則，部分細胞核顏色變淺。與HH 模型組比較，GA 低、中、高劑量組病理組織改變均有改善，且隨著藥物劑量的增加，心肌纖維排列越來越整齊，炎癥細胞逐漸減少，紅細胞浸潤逐漸減少，細胞排列逐漸緊密，細胞質橫紋逐漸清晰。見OSID碼圖1。

2.1.4 各組大鼠心肌組織血管內(nèi)皮功能指標比較 與正常組比較，HH 模型組及GA 低、中、高劑量組心肌組織ET-1、iNOS 均升高，但HH 模型組升高更明顯（P均＜0.05）。見表3。

表3 各組心肌組織血管內(nèi)皮功能指標比較（）

表3 各組心肌組織血管內(nèi)皮功能指標比較（）

注：與正常組比較，*P＜0.05。

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2.2 GA改善HH誘發(fā)心肌損傷的體外觀察結果

2.2.1 大鼠心肌細胞形態(tài)學觀察結果 正常組細胞形態(tài)正常，排列整齊，呈梭形，細胞邊界清晰、大小相同。模型組細胞排列紊亂，呈短梭形，稀疏拉絲，死細胞漂浮，細胞間隙變寬。與模型組比較，GA低、中、高劑量組缺氧條件導致的拉絲情況明顯改善，細胞數(shù)增加。見OSID碼圖2。

2.2.2 各組大鼠心肌細胞凋亡率比較 正常組、模型組、GA低劑量組、GA中劑量組、GA高劑量組細胞凋亡率分別為14.08%、53.50%、24.60%、22.85%、19.73%；與正常組比較，模型組及GA低、中、高劑量組心肌細胞凋亡率均升高，但模型組升高更明顯（P均＜0.05）。

2.2.3 各組大鼠心肌細胞ROS 水平比較 正常組、模型組、GA 低劑量組、GA 中劑量組、GA 高劑量組心肌細胞ROS 分別為22.54 ± 2.48、36.37 ±0.45、34.02 ± 1.07、23.58 ± 0.65、23.93 ± 3.07；與正常組比較，模型組及GA 低、中、高劑量組心肌細胞ROS 均升高，但模型組升高更明顯（P均＜0.05）。

2.2.4 各組大鼠心肌細胞凋亡相關蛋白比較 與正常組比較，模型組胞Caspase-3、Bax 蛋白表達升高，Bcl-2 蛋白表達降低；與模型組比較，GA 低、中、高劑量組Caspase-3、Bax 蛋白表達降低，Bcl-2 蛋白表達升高（P均＜0.05）。見表4。

表4 各組心肌細胞凋亡相關蛋白比較（）

表4 各組心肌細胞凋亡相關蛋白比較（）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

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3 討論

高原缺氧與肺動脈高壓密切相關，肺動脈高壓會加重右心室負荷，最終導致右心室擴大和右心功能衰竭［5］。分析其機制可能為長期高原缺氧刺激會對心肌造成損傷，從而導致心肌細胞能量代謝紊亂，線粒體結構和功能受損，最終導致心肌細胞的死亡或凋亡。其中心肌細胞凋亡是缺氧引起的心血管系統(tǒng)的重要反應，心肌細胞異常凋亡影響心臟的正常收縮和泵血功能，促進心臟疾病的發(fā)生發(fā)展［6］。本研究旨在探討GA 對HH 誘發(fā)大鼠心肌損傷的抑制作用及其潛在的治療機制。有研究表明，GA和環(huán)孢素聯(lián)合應用可保護心肌細胞形態(tài)，防止心肌缺血再灌注損傷［7］。GA 還是治療心肌肥大和心力衰竭的一個有潛力的藥物，有研究表明GA 對CaCl2誘發(fā)的心律失常具有抑制作用［8］。在本研究中，HH 建模大鼠PAAT 降低、RPEP 升高，心肌組織中可見心肌細胞排列紊亂、心肌間質血管擴張充血，偶見炎癥細胞浸潤，提示HH 誘發(fā)的心肌損傷模型大鼠構建成功。在給予不同劑量GA 藥物干預后，大鼠PAAT 升高、RPEP 降低，心肌纖維排列整齊，結構正常，炎癥細胞浸潤減少，提示GA 可通過改善組織結構對心肌起到保護作用。同時，體外研究結果表明，給予不同劑量GA 藥物干預后，大鼠H9C2 細胞形態(tài)明顯改善，提示GA 可通過抗炎和抗氧化的作用來改善低氧誘發(fā)的心肌細胞損傷。

細胞凋亡被認為是心肌損傷的重要機制之一［9］。在心肌細胞凋亡過程中，心肌細胞數(shù)量減少，心肌成纖維細胞增生，導致心肌肥厚、收縮力下降，進而發(fā)展為心力衰竭［10］。細胞凋亡是一個通過大量基因表達后嚴格控制的過程，這些基因包括Bcl-2家族、Caspase家族等［11］。作為核心執(zhí)行蛋白，Caspase-3參與線粒體途徑介導的細胞凋亡過程，而裂解的Caspase-3 可以反映其活性。在執(zhí)行凋亡的蛋白質中，Bax 有促進凋亡的作用，而Bcl-2 有抑制凋亡作用［12］。有研究表明，內(nèi)皮細胞功能紊亂與心力衰竭的發(fā)展密切相關，ET-1及iNOS在心力衰竭等病理生理狀態(tài)下發(fā)揮重要作用［13］。內(nèi)毒素等刺激可誘導iNOS 的激活，從而促進NO 合成增加，雖然升高的NO 可以拮抗ET-1的作用，但過多的NO 可導致線粒體呼吸功能受損，增加心肌細胞凋亡［14］。另有研究發(fā)現(xiàn)，在低氧條件下，細胞會產(chǎn)生氧化應激，進而造成氧化損傷，此時細胞會產(chǎn)生免疫應答，分泌大量炎癥因子參與心肌損傷［15］，大量炎癥因子可引起繼發(fā)于細胞凋亡的ROS 激活，釋放大量的氧自由基并加重心肌組織脂質過氧化及增加MDA 水平，進而誘發(fā)細胞死亡［16］。SOD、GSH-Px 等抗氧化酶是抵御氧自由基損傷的第一道防線［17］，SOD、GSH-Px 水平下降及MDA 水平升高是反映心肌缺血缺氧程度的重要標志［18］。本研究結果顯示，HH 誘發(fā)心肌損傷大鼠心肌組織中ET-1、iNOS 水平升高，血清中MDA 水平升高、SOD 及GSH-Px 水平降低，提示HH 所致心肌損傷大鼠發(fā)生了心肌重構和氧化應激。給予不同劑量GA 干預后，HH 心肌損傷大鼠組織中ET-1、iNOS水平降低，血清中MDA 水平降低、SOD 及GSH-Px 水平升高，提示GA 可通過改善HH 心肌損傷大鼠的心肌重構并調節(jié)氧化應激水平來保護心肌組織。同時，體外研究結果表明，模型組心肌細胞Bcl-2 蛋白表達降低，而Caspase-3、Bax 蛋白表達及ROS 水平、細胞凋亡率升高。在給予不同劑量GA 干預后，心肌細胞Bcl-2 蛋白表達升高，而Caspase-3、Bax 蛋白表達及ROS 水平、細胞凋亡率降低。該結果提示，GA 可能通過抑制細胞凋亡改善低氧誘發(fā)的心肌損傷來發(fā)揮對心臟的保護作用。

綜上所述，GA 在體內(nèi)外HH 心肌損傷模型中均可抑制心肌損傷，其機制可能與減輕氧化應激、改善內(nèi)皮功能、減少細胞凋亡有關。GA具有潛在的改善HH 誘發(fā)心肌損傷的作用，有望成為治療心肌疾病的有效方法，但仍需要更多的藥理學研究以完善相關機制。