趙治國， 楊富剛， 王雯諺， 劉夢瑜， 李湧， 譚煥*

（1.陜西冶金設(shè)計研究院有限公司， 西安 710018； 2.中國重型機(jī)械研究院股份公司， 西安 710018；3.中國市政工程華北設(shè)計研究總院有限公司 西安分公司， 西安 710018；4.西安文理學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院， 西安 710065）

我國生活污水、 工業(yè)廢水和農(nóng)業(yè)面源污染攜帶大量含氮物質(zhì)排入水體， 造成水體污染嚴(yán)重［1－2］。此類廢水中有機(jī)物含量低， 氮素含量高， 依靠傳統(tǒng)異養(yǎng)反硝化技術(shù)難以去除此類污染物。 水體氮素的完全去除還需額外投加有機(jī)物， 而投加有機(jī)物極易造成二次污染［3－4］。 因此， 基于Fe2＋的自養(yǎng)反硝化技術(shù)應(yīng)運而生［5－6］。 1996 年， Straub 等［7－8］在城市下水道管網(wǎng)中分離獲得了3 株可利用亞鐵鹽作為電子供體的反硝化菌株， 從此拉開鐵鹽脫氮研究序幕。目前Wang 等［9］已將該技術(shù)的脫氮效能提升到0.22 kg［N］／（m3·d）。 然而亞鐵鹽作為反硝化電子供體時， 二價鐵氧化產(chǎn)物三價鐵堆積在細(xì)胞表面形成鐵殼， 進(jìn)而影響微生物脫氮效能， 微生物的最佳脫氮效能僅維持14 ～20 d［10－11］。

目前針對解決“結(jié)殼”的方法多采用優(yōu)化菌源、添加有機(jī)物、 使用螯合鐵等方法［12］。 Zhang 等［13］發(fā)現(xiàn)低濃度有機(jī)物條件下EDTA－Fe 基質(zhì)使細(xì)菌結(jié)殼方式改變。 Kumaraswamy 等［14］以乙醇和EDTA－Fe為電子供體研究了反應(yīng)器的脫氮效能， 研究表明螯合鐵更有助于反應(yīng)器脫氮。 考慮到有機(jī)物可作為反硝化電子供體且EDTA 有生物毒性， 故而本研究選用六偏磷酸鈉作為自養(yǎng)條件下Fe2＋的螯合劑。

研究采用實驗室穩(wěn)定運行的反應(yīng)器中的反硝化污泥為接種污泥， 以六偏磷酸鈉－Fe2＋為進(jìn)水基質(zhì)，在反應(yīng)器層面、 顆粒污泥層面、 細(xì)胞個體層面及酶活性層面檢測了基于鐵鹽的自養(yǎng)脫氮活性和微生物鐵殼情況， 探究了基于六偏磷酸鈉－Fe2＋的鐵鹽脫氮微生物特性， 闡述了鐵鹽脫氮工藝的優(yōu)勢， 為鐵鹽脫氮工藝的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑： NaHCO3， MgSO4·7H2O， CaCl2·2H2O， （NH4）2SO4， KH2PO4， NaNO3， FeSO4·7H2O，六偏磷酸鈉， 以上試劑均為分析純； 活／死細(xì)胞熒光鑒定試劑盒。

主要儀器： 分析天平（224S）， 紫外分光光度計（F－7000）， 熒光分光光度計（F－7000）， 透射電子顯微鏡（JEOL JEM－2100Plus）。

1.2 模擬廢水

試驗采用模擬廢水， 具體成分如下： NaHCO32.50 g／L， MgSO4·7H2O 0.50 g／L， CaCl2·2H2O 0.01 g／L， （NH4）2SO40.28 g／L； KH2PO40.25 g／L， 六偏磷酸鈉5.50 g／L； NaNO30.51 g／L； FeSO4·7H2O 4.1 g／L；氮源和能源以NaNO3和六偏磷酸鈉－Fe2＋的形式按需添加， 并控制進(jìn)水中Fe2＋與總氮的物質(zhì)的量比為2.5 左右。 為保證Fe2＋不快速沉淀， 配水時先溶解六偏磷酸鈉再加入FeSO4， 使得FeSO4與六偏磷酸鈉充分螯合， 最后調(diào)節(jié)pH 值使之穩(wěn)定。

1.3 接種污泥和反應(yīng)裝置

接種污泥為實驗室高效反硝化反應(yīng)器中的反硝化污泥［14］。 此反硝化污泥的MLSS 為27.82 g／L，MLVSS 為16.40 g／L。

反應(yīng)裝置采用上流式顆粒污泥床（UASB）（以下稱鐵鹽脫氮反應(yīng)器）， 反應(yīng)器內(nèi)徑為65 mm（排氣區(qū)內(nèi)徑為85 mm）， 反應(yīng)區(qū)高380 mm（排氣區(qū)高320 mm）， 總體積為3 L（為保證裝置排氣上方為放大圓柱體［9］）， 有效體積為1.2 L， 污泥接種量為800 mL。 反應(yīng)器每日進(jìn)水量為12 L， HRT 為6 h， 進(jìn)水pH 值設(shè)定為6.4 ±0.1。 初始進(jìn)水硝態(tài)氮質(zhì)量濃度設(shè)定為84 mg／L， 進(jìn)水Fe2＋質(zhì)量濃度設(shè)定為826 mg／L； 硝態(tài)氮容積負(fù)荷為0.84 kg／（m3·d）； Fe2＋容積負(fù)荷為8.26 kg／（m3·d）。

1.4 試驗方法

不同運行階段的反應(yīng)器的進(jìn)水水質(zhì)條件不同，具體情況如表1 所示。

表1 反應(yīng)器進(jìn)水水質(zhì)條件Tab.1 Influent and effluent water quality of reactor

反應(yīng)器正式運行（第0 天起）期間通過不間斷的測定反應(yīng)器每天進(jìn)出水Fe2＋濃度及硝態(tài)氮濃度來考察反應(yīng)器脫氮性能； 同時由于微生物是廢水處理的關(guān)鍵所在， 因此在反應(yīng)器運行過程中選取第1、15、 30、 57、 82 天的5 組污泥， 分別編號為T1、T2、 T3、 T4、 T5， 對各組污泥進(jìn)行形貌觀察、 活／死細(xì)胞檢測、 堿性磷酸酯酶活性測定、 比活性測定。

（1） 污泥形貌觀察。 利用相機(jī)對接種污泥和鐵鹽脫氮顆粒污泥進(jìn)行觀察并拍照， 記錄污泥外部形貌， 如污泥密實度、 顆粒污泥粒徑、 污泥色澤等。樣品制備完成后在透射電鏡下觀察細(xì)菌形貌［15］。

（2） 活／死細(xì)胞檢測。 取適量顆粒污泥溶于0.85% NaCl 溶液中， 利用細(xì)胞超聲破碎儀破碎顆粒污泥以獲得懸浮菌液， 將染色后的細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀察活死狀態(tài)， 利用Image－pro Plus 6.0軟件對視野中活／死細(xì)胞個數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計并計算得出不同時間段活細(xì)胞占總細(xì)胞個數(shù)的比例［19］。

（3） 堿性磷酸酯酶活性測定。 ?。?.05±0.01）g顆粒污泥， 懸浮于1 mL pH 值為8.0 的PBS 溶液中， 超聲破碎1.5 min。 取超聲產(chǎn)物， 測定對硝基鄰苯酸二鈉（pNPP）轉(zhuǎn)化量并計算顆粒污泥的堿性磷酸酯酶（ALP）活性［20］。 pNPP 轉(zhuǎn)化量越多則說明酶活性越強(qiáng)。

（4） 比活性測定。 采用批次試驗測定顆粒污泥的比反硝化活性和比鐵氧化活性， 取50 mL 模擬廢水于65 mL 血清瓶中， 加入一定質(zhì)量瀝干顆粒污泥， 以氬氣驅(qū)氧5 min， 按需投加六偏磷酸鈉－Fe2＋，用丁基橡膠塞密封血清瓶并用鋁蓋加固。 血清瓶置于搖床上（180 r／min、 32 ℃）培養(yǎng)， 每組試驗設(shè)置2個平行， 定時取上清液測定硝態(tài)氮、 Fe2＋含量［21］。比活性計算公式如下：

式中： RA為比活性， mg／（g［VSS］·L·h）； Ct為t 時刻指標(biāo)質(zhì)量濃度， mg／L； C0為0 時刻指標(biāo)質(zhì)量濃度， mg／L； m 為添加顆粒污泥質(zhì)量， g； S為揮發(fā)性固體顆粒物占總顆粒污泥（濕基）的質(zhì)量百分比， %； t 為培養(yǎng)時間， h。

1.5 分析方法

硝態(tài)氮濃度采用紫外分光光度法， Fe2＋濃度采用1，10－啉菲啰啉分光光度法， pH 值采用pHS－9V型酸度計測定， TS 和VSS 濃度采用重量法。

2 結(jié)果與討論

2.1 鐵鹽脫氮反應(yīng)器運行性能

鐵鹽脫氮反應(yīng)器容積負(fù)荷和去除負(fù)荷隨時間的變化情況如圖1 所示。 根據(jù)反應(yīng)器的操作條件及脫氮效能， 其運行過程分為以下4 個階段：

圖1 鐵鹽脫氮反應(yīng)器性能Fig.1 Performance of ferrous ion－dependent nitrate removal reactor

階段1（第0 ～20 天）： 該階段硝態(tài)氮去除負(fù)荷逐漸下降， 這是由于六偏磷酸鈉濃度過高， 導(dǎo)致反應(yīng)器鹽度上升， 高鹽度通常會抑制酶的活性， 還會引起細(xì)胞質(zhì)溶解［16－17］。

階段2（第21 ～29 天）： 該階段中， 最高硝態(tài)氮去除負(fù)荷為0.41 kg／（m3·d）， 最大鐵去除負(fù)荷為2.15 kg／（m3·d）， 平均硝態(tài)氮去除率達(dá)57.6%； 該階段反應(yīng)器運行穩(wěn)定但硝態(tài)氮去除率較低。 Straub等［18］的研究結(jié)果表明， 鐵型反硝化的最適pH 值介于6.4 ～6.7。 傳統(tǒng)異養(yǎng)反硝化最適pH 值介于7.0 ～8.0， 反應(yīng)器調(diào)試階段的進(jìn)水pH 值維持在6.4 ±0.1， 出水pH 值維持在6.8±0.1， 分析其原因為接種污泥為傳統(tǒng)異養(yǎng)反硝化污泥， 該接種污泥不能適應(yīng)此時過低的進(jìn)水pH 值， 從而導(dǎo)致此階段反應(yīng)器脫氮效能不佳。

階段3（第30 ～64 天）： 自第30 天起改變反應(yīng)器進(jìn)水pH 值為6.8±0.1， 硝態(tài)氮及Fe2＋的容積負(fù)荷與階段2 保持一致。 該階段反應(yīng)器運行穩(wěn)定， 出水pH 值為7.2±0.1， 硝態(tài)氮去除負(fù)荷為0.41 kg／（m3·d）， 平均去除率高達(dá)97.6%， 高脫氮效能維持了28 d； 最大鐵去除負(fù)荷為2.77 kg／（m3·d）， 平均去除率為52.5%， 鐵去除負(fù)荷相對穩(wěn)定。

階段4（第65 ～88 天）： 第65 天后反應(yīng)器脫氮效能經(jīng)歷波動， 硝態(tài)氮去除率最終穩(wěn)定在45.7%。隨著運行時間延長， 細(xì)菌表面不斷生成鐵殼， 引起細(xì)菌死亡， 但部分表面未結(jié)殼的細(xì)菌仍發(fā)揮著較好的脫氮效能。 因此， 經(jīng)高效運行后反應(yīng)器最終穩(wěn)定在階段4， 運行過程中未檢測到亞硝酸鹽積累。

2.2 鐵鹽脫氮微生物特征

2.2.1 結(jié)構(gòu)特征

5 組污泥的形貌觀察結(jié)果及生物活性測定結(jié)果如圖2 所示。

圖2 顆粒污泥形貌特征Fig.2 Morphology features of granule sludge

接種污泥為橢球形、 黃色、 表面光滑、 內(nèi)部緊實。 隨著反應(yīng)器運行， 污泥表面從最開始的土黃色逐漸變?yōu)樯罨液稚?反應(yīng)器進(jìn)水不含有機(jī)物， 僅含有Fe2＋并作為電子供體， 碳酸氫鹽作為碳源， 反應(yīng)器內(nèi)污泥生長緩慢， 細(xì)胞幾乎不產(chǎn)生胞外多聚物，使得細(xì)胞相互之間的粘附性差。 反應(yīng)器運行后期顆粒污泥解體， 反應(yīng)器內(nèi)部多為碎片狀絮體污泥（后期反應(yīng)器內(nèi)很難找到顆粒污泥， T4、 T5樣品為解體污泥堆積而成）。

為探究六偏磷酸鈉螯合模式下的鐵鹽脫氮反應(yīng)器高效能的原因， 進(jìn)一步采用透射電鏡觀察了T1～T5中微生物細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)， 結(jié)果如圖3 所示。

圖3 TEM 下顆粒污泥細(xì)胞形貌特征Fig.3 Morphology features of granule sludge under TEM

隨著反應(yīng)器運行時間的延續(xù)， 污泥中細(xì)胞外周附著的鐵礦物（鐵殼）逐漸增多， 與Schmid［22］的試驗結(jié)果不同的是， 附著在細(xì)胞表面的“鐵殼”存在方式較單一， 僅為包裹式， 且包裹層較薄。 有研究表明， 由微生物介導(dǎo)的硝酸鹽型鐵氧化是由生物反應(yīng)和化學(xué)反應(yīng)耦合完成的， 生物反應(yīng)和化學(xué)反應(yīng)均會生成不同形式的鐵礦物［12，23］。 這些鐵礦物是以包裹式或犄角式分布于細(xì)胞周圍， 且與細(xì)菌種類和基質(zhì)種類有關(guān)［24－25］。 在反應(yīng)器中出現(xiàn)單層鐵殼包裹是因為六偏磷酸鈉－Fe2＋相對分子質(zhì)量較大， 難以通過通道蛋白進(jìn)入細(xì)胞， 故而Fe2＋只能在胞外失去電子。 針狀鐵會刺破細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)菌死亡［22］， 試驗過程中未見犄角式或針狀鐵殼， 即六偏磷酸鈉不會引起針狀鐵殼的形成， 從而減緩了細(xì)菌的死亡。

從圖3 中可以觀察到3 種細(xì)胞形態(tài)： 活菌、 腫脹菌和死菌。 活菌的細(xì)胞膜完整， 細(xì)胞內(nèi)含物清晰， 如圖T2－1及T5－1中a 所示； 腫脹菌一般表示受損細(xì)菌， 細(xì)菌生長狀態(tài)不良， 包膜緊張、 邊緣外翻細(xì)胞膜界線不清， 如圖T2－1及T5－1中b 所示； 死菌細(xì)胞膜受損， 通透性增加， 如圖T2－1及T5－1中c所示。 為了確定鐵在細(xì)胞內(nèi)／外的堆積位點， 使用激光拉曼光譜儀（HR Evolution）對圖3 中不同形態(tài)細(xì)胞內(nèi)／外的鐵含量進(jìn)行了能譜分析， 結(jié)果如表2所示。

表2 激光拉曼光譜儀下活菌、 腫脹菌和死菌內(nèi)／外鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tab.2 Mass fractions of iron in inside and outside of viable organism, swellen bacteria and dead bacteria under laser raman spectrometer

由表2 可知， 活菌表面及中心的鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)極少， 均為0.02%； 在腫脹菌的中心和邊緣都檢測到了鐵的存在， 質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.14%、 0.26%； 死菌中心和邊緣同樣檢測到了鐵的存在， 其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.30%、 0.29%。

不同形態(tài)細(xì)菌的表面和中心檢測到的鐵含量不同， 推測其原因是反應(yīng)器運行前期Fe2＋無法進(jìn)入細(xì)胞， Fe2＋在胞外失去電子， 變成Fe3＋； 隨著時間的延續(xù)， Fe3＋在胞外沉積形成鐵殼， 導(dǎo)致微生物細(xì)胞無法與外界進(jìn)行正常物質(zhì)交換， 微生物活性下降，細(xì)胞表面通透性改變， 部分Fe2＋進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行電子代謝； 當(dāng)進(jìn)入細(xì)胞的Fe2＋增多， 大量Fe3＋在胞內(nèi)積累， 細(xì)菌逐步死亡裂解。

2.2.2 微生物比活性

采用分批試驗測定了顆粒污泥的比活性， 結(jié)果如圖4 所示。 接種顆粒污泥比反硝化活性為0.71 mg［N］／（g［VSS］·h）， 比鐵氧化活性為7.3 mg［Fe］／（g［VSS］·h）。 隨著反應(yīng)器運行時間的延續(xù)， T1～T5的比反硝化活性和比鐵氧化活性均呈先下降后上升趨勢。 反應(yīng)器運行后期污泥（T5）的比反硝化活性為2.3 mg［N］／（g［VSS］·h）， 同比上升224%； 比鐵氧化活性為15 mg［Fe］／（g［VSS］·h）， 同比上升105%。前期比活性下降是因為鹽度及pH 值不適， 后期經(jīng)過調(diào)節(jié)隨著反應(yīng)器運行微生物比活性逐漸增加。 反應(yīng)器運行第82 天T5組中仍存在未被鐵包裹的活菌， 結(jié)合圖4 可以看出從T3～T5脫氮效能逐漸增加， 說明六偏磷酸鈉－Fe2＋反應(yīng)器中活菌的生存狀態(tài)良好。

圖4 顆粒污泥相對比活性Fig.4 Relative specific activity of granular sludge

2.2.3 生物活性

采用比色法測定了T1～T5的ALP 活性， 結(jié)果如圖5 所示。 隨著反應(yīng)器運行時間的延長， 樣品中ALP 活性逐步上升。 T1的ALP 活性為0.45 μmol／（g［VSS］·min）， T5的ALP 活性為11.12 μmol／（g［VSS］·min）， 是T1的24 倍， 說明六偏磷酸鈉－Fe2＋反應(yīng)器中細(xì)菌雖有死亡但活菌活性增加。 隨著部分細(xì)菌死亡， 系統(tǒng)VSS 容積負(fù)荷不斷增高， 因此部分細(xì)菌的活性增加。

圖5 顆粒污泥中ALP 活性Fig.5 Activities of ALP in granular sludge

采用Live／Dead Baclight 試劑盒， 對T1～T5的活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行了染色， 并于熒光顯微鏡下觀察， 對視野中的活細(xì)胞及死細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)， 并計算活細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例， 結(jié)果如圖6 所示。 隨著反應(yīng)器運行時間的延長， T1～T5中的活細(xì)胞比例逐漸降低， 死細(xì)胞比例逐漸上升。 對圖6 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合， 所得斜率即為反應(yīng)器中細(xì)胞的死亡速率。 由圖6 可知， 以六偏磷酸鈉－Fe2＋為進(jìn)水基質(zhì)的反應(yīng)器中細(xì)胞死亡速率為0.42%， 該速率是文獻(xiàn)［15］中以FeSO4作為進(jìn)水基質(zhì)的反應(yīng)器中細(xì)胞死亡速率的一半。

圖6 顆粒污泥中活細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例Fig.6 Percentage of live cells in granular sludge

反應(yīng)器正式運行時的污泥（T1）中的活細(xì)胞比例最高， 為89.6%； 此后顆粒污泥中的活細(xì)胞比例逐漸下降， 最終降至55.6%。 由于鐵沉積物堆積在微生物表面阻礙微生物與外界進(jìn)行物質(zhì)交換， 使基質(zhì)無法順暢進(jìn)入微生物細(xì)胞。 同時堆積在微生物內(nèi)部的鐵沉積物占用微生物內(nèi)部空間， 影響了微生物的正常生理代謝， 使得微生物活性降低甚至失活。

3 結(jié)論

（1） 本試驗條件下， 鐵鹽脫氮反應(yīng)器的脫氮效能可維持在0.41 kg［N］／（m3·d）達(dá)28 d 之久， 表明使用六偏磷酸鈉－Fe2＋基質(zhì)延長了鐵鹽脫氮污泥反硝化高效期。

（2） 六偏磷酸鈉－Fe2＋基質(zhì)下的顆粒污泥中細(xì)胞存活率、 酶活性、 比鐵氧化活性以及比反硝化活性有顯著提高， 表明六偏磷酸鈉－Fe2＋基質(zhì)增強(qiáng)了活細(xì)菌的生物活性和反硝化活性。

（3） 對于一部分微生物， 六偏磷酸鈉－Fe2＋基質(zhì)改變了細(xì)胞結(jié)殼方式， 鐵的存在形態(tài)主要表現(xiàn)為絮狀包裹式， 鐵的堆積路徑主要表現(xiàn)為先堆積在微生物表面再進(jìn)入微生物內(nèi)部， 同時六偏磷酸鈉－Fe2＋基質(zhì)延緩了細(xì)菌結(jié)殼時間， 使其死亡速度變慢； 對于另一部分微生物， 六偏磷酸鈉－Fe2＋基質(zhì)不會造成鐵在其表面堆積， 微生物仍保持較好的脫氮效能。