阿來·木合亞提，趙玉，俞綱，蘇瑞斌

（軍事科學院軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，神經(jīng)精神藥理學北京市重點實驗室，北京 100850）

γ-氨基丁酸A 型受體（γ-aminobutyric acid type A receptor，GABAAR）是哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)普遍存在的抑制性受體，廣泛參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能，包括警覺、疼痛、睡眠-覺醒、情緒和認知等［1-2］。目前已發(fā)現(xiàn)20 種GABAAR 亞基（α1-6，β1-4，γ1-3，δ，ε，π，θ 和ρ1-3），這些亞基排列組合成不同的五聚體亞型，每種亞型又表現(xiàn)出不同的腦區(qū)和細胞分布特點。GABAAR 結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性可能與其參與介導多重生物學功能相關(guān)［1，3-5］。GABAAR 也是苯二氮類藥物的作用靶點［6］。然而傳統(tǒng)的GABAAR變構(gòu)調(diào)節(jié)劑已被證實存在潛在的精神依賴風險，如地西泮劑量依賴性地降低小鼠顱內(nèi)自我刺激模型中的獎賞閾值［7］，氟溴西泮可誘導小鼠產(chǎn)生條件性位置偏愛［8］。同時已證實，苯二氮類藥物可能被用于娛樂，以獲得快感，具有潛在的精神依賴風險，從而限制了該類藥物的臨床應(yīng)用［9］。

根據(jù)亞基組成和亞細胞定位的差異可將GABAAR 分為突觸內(nèi)和突觸外2 種類型［10］，前者通常由α1，2，3，5，β 和γ2亞基組成，介導時相性抑制效應(yīng)，具有高電導、快速脫敏和GABA 敏感性低的特點；后者通常由α4，α6和δ 亞基組成，介導強直性抑制效應(yīng)［11-12］，被認為是睡眠障礙、癲癇、疼痛和抑郁的潛在治療靶點［13］。突觸外GABAAR 選擇性激動劑加波沙朵（gaboxadol）在非臨床研究中未見其具有精神依賴性的報道［14］。在野生型小鼠中，加波沙朵可誘導條件性位置厭惡，而在δ亞基敲除小鼠中，該行為效應(yīng)消失［15］；加波沙朵在小鼠和狒狒的靜脈自身給藥模型中也未表現(xiàn)出強化效應(yīng)［15］。突觸外GABAAR 甚至被認為是酒精和可卡因成癮的潛在治療靶點［16-19］。然而，加波沙朵可引起腹側(cè)被蓋區(qū)（ventral tegmental area，VTA）多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元突觸可塑性的改變［15，20］，而神經(jīng)可塑性改變是咪達唑侖（midazolam）等誘導藥物依賴的標志性變化［21-22］。因此，加波沙朵是否存在精神依賴性仍有待證實。

兩瓶自由選擇實驗（two-bottle free-choice test）是通過觀察嚙齒類動物自主口服攝入某種化學物質(zhì)溶液的行為來評估該物質(zhì)精神依賴潛能的自身給藥實驗。已有研究報道，在兩瓶自由選擇模型上，咪達唑侖可誘導小鼠產(chǎn)生顯著偏好，且該效應(yīng)與伏隔核中含α1和α2亞基的GABAAR 有關(guān)［22］。本研究旨在利用小鼠兩瓶自由選擇模型評價突觸外GABAAR選擇性激動劑加波沙朵的精神依賴潛能。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和主要儀器

咪達唑侖（批號201002，純度＞98%），中國食品藥品檢定研究院；加波沙朵（批號64603-91-4，純度＞99%），美國MedChemExpress 公司；吐溫-80，北京索萊寶科技有限公司；二甲亞砜（DMSO），美國Amresco 公司；生理鹽水，石家莊四藥有限公司。在翻正反射消失（loss of righting reflex，LORR）實驗中，咪達唑侖用含5% DMSO（V/V）和5%吐溫-80（V/V）的去離子水配制，加波沙朵用生理鹽水配制。兩瓶自由選擇實驗中，咪達唑侖溶解在50 μL DMSO和50 μL 吐溫-80 中，再用4%蔗糖溶液稀釋至1.4×10-5mol·L-1；加波沙朵用4%蔗糖溶液配制至3.9×10-6mol·L-1。CPA225D 電子天平，德國賽托利斯公司；飲水瓶，吉祥海螺科技有限公司。

1.2 實驗動物和分組

雄性C57BL/6J小鼠，SPF級，6～8周齡，18～22 g，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（京）2019-0010。實驗前每籠5 只群養(yǎng)，實驗期間每籠1 只孤養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境室溫25 ℃，濕度50%～60%，12 h/12 h 明暗交替，小鼠自由攝食飲水。

LORR 實驗設(shè)置咪達唑侖（59.0，73.7，92.2，115.2，144.0 和180.0 mg·kg-1）6 個劑量組，加波沙朵（8.4，10.5，13.1，16.4，20.5，25.6 和32.0 mg·kg-1）7 個劑量組及相應(yīng)溶劑對照組，每組8 只小鼠。兩瓶自由選擇實驗設(shè)置咪達唑侖（1.4×10-5mol·L-1）、加波沙朵（3.9×10-6mol·L-1）和正常對照組，每組10 只小鼠。所有實驗操作均獲軍事醫(yī)學研究院實驗動物倫理委員會批準（編號：AMMS-06-2019-006）。

1.3 翻正反射消失實驗

將小鼠單獨置于有機玻璃盒（40 cm×20 cm×20 cm）中適應(yīng)10 min 后開始實驗。ig 給予咪達唑侖、加波沙朵或溶劑后，將小鼠輕輕仰臥位放置，每1 min 評估1 次翻正反射，直至出現(xiàn)LORR（仰臥姿態(tài)），且60 s 內(nèi)不能恢復(fù)正常俯臥位姿態(tài)。小鼠出現(xiàn)LORR 后不受干擾，直至自行翻身恢復(fù)至俯臥位。小鼠在60 s內(nèi)能夠恢復(fù)俯臥位2次及以上即為翻正反射恢復(fù)。小鼠給藥后120 min內(nèi)始終能夠恢復(fù)俯臥位，則認為LORR 未發(fā)生。記錄出現(xiàn)LORR的動物數(shù)，根據(jù)LORR量效關(guān)系計算藥物的半數(shù)有效量（median effective dose，ED50）。通過ED50（咪達唑侖）∶ED50（加波沙朵）=C（咪達唑侖）∶C（加波沙朵）計算出與文獻咪達唑侖［22］藥效相當?shù)募硬ㄉ扯錆舛龋鳛閮善孔杂蛇x擇模型的藥物使用濃度。

1.4 兩瓶自由選擇實驗

實驗分為3 個階段進行（圖1）。適應(yīng)期（第1～3 天）：將小鼠單籠飼養(yǎng)并分為正常對照組、咪達唑侖組和加波沙朵組，每籠放入2個飲水瓶，均裝入飲用水，置于飼養(yǎng)籠對稱位置；訓練期（第4～5 天）：2 個飲水瓶均以4%蔗糖溶液替換飲用水；測試期（第6～15 天）：將咪達唑侖組和加波沙朵組小鼠籠中的1 個飲水瓶分別裝入含咪達唑侖或加波沙朵的蔗糖溶液（測試瓶），另1瓶分別裝入含相應(yīng)溶劑的蔗糖溶液（溶劑對照瓶）；將正常對照組籠中的2個飲水瓶均裝入4%蔗糖溶液。每日9∶00更新溶液，21∶00更換2個飲水瓶的位置，以消除化合物降解變質(zhì)及動物可能的位置偏好對實驗結(jié)果的干擾。每日9∶00記錄小鼠每瓶飲用量，計算每日總飲用量（每日每只小鼠測試瓶與溶劑對照瓶飲用量之和）、測試瓶累計飲用量（測試期內(nèi)測試瓶總飲用量）、相對飲用量（測試瓶飲用量/溶劑對照瓶飲用量）和測試期內(nèi)累計相對飲用量（測試期每日相對飲用量之和）。測試瓶累計飲用量或相對飲用量升高即表明小鼠對該藥物產(chǎn)生偏好。

Fig.1 Flow chart of two-bottle free-choice paradigm.Mice were housed with free access to two bottles of water in their home cage during the first day（D1）to D3（habituation stage）before 4% sucrose was added to both bottles during D4-D5（trail stage）.During the test stage（D6-D15），mice had access to bottles containing either midazolam（MDZ，1.4×10-5 mol·L-1）or gaboxadol（THIP，3.9×10-6 mol·L-1）in 4% sucrose or vehicle in 4% sucrose（vehicle consisting of 50 μL dimethyl sulfoxide and 50 μL Tween-80 or saline）.

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 咪達唑侖和加波沙朵ig 給藥劑量依賴性誘導小鼠翻正反射消失

結(jié)果顯示，咪達唑侖（圖2A）和加波沙朵（圖2B）ig 給藥均劑量依賴性地增加小鼠LORR 率。咪達唑侖73.7 mg·kg-1誘導小鼠開始出現(xiàn)LORR，180.0 mg·kg-1LORR 率達100%，其誘導LORR 的ED50為105.3 mg·kg-1（95%CI：96.4～115.2 mg·kg-1，R2=0.9796）。加波沙朵8.4 mg·kg-1誘導小鼠開始出現(xiàn)LORR，25.6 mg·kg-1及以上劑量LORR 率為100%，其誘導LORR 的ED50為13.7 mg·kg-1（95%CI：12.6～15.0 mg·kg-1，R2=0.9773）。加波沙朵與咪達唑侖的效價（ED50）比值為7.69，參照文獻［22］中咪達唑侖溶液濃度（1.4×10-5mol·L-1，相對分子質(zhì)量：325.77），確定兩瓶自由選擇模型中加波沙朵溶液濃度為3.9×10-6mol·L-1（相對分子質(zhì)量：176.60）。

Fig.2 Dose-response effect of MDZ（A）and THlP（B）on percentage of loss of righting reflex（LORR）in mice.Mice were ig administrated with MDZ（59.0，73.7，92.2，115.2，144.0 and 180.0 mg·kg-1），THIP（8.4，10.5，13.1，16.4，20.5，25.6 and 32.0 mg·kg-1）or vehicle.Non-liner regression was performed between doses and percentage of LORR.Median effective dose（ED50）was estimated from the dose-response curve.±s，n=8.

2.2 加波沙朵不影響小鼠每日總飲用量

兩瓶自由選擇模型中，各組小鼠每日總飲用量如圖3所示。適應(yīng)期，各組小鼠每日總飲用量約為3～5 mL（圖3A）；訓練期，以4%蔗糖溶液替換飲水，各組小鼠每日總飲用量約為8～12 mL（圖3A）。在測試期內(nèi)，無論瓶內(nèi)溶液更新或者飲水瓶位置更換，各組小鼠每日總飲用量維持穩(wěn)定，約為8～10 mL（圖3B）。

Fig.3 Two-bottle free-choice MDZ（1.4×10-5 mol·L-1）and THlP（3.9×10-6 mol·L-1）total consumption in habituation and trial stages（A）and test stage（B）in mice.See Fig.1 for the mouse treatment.±s，n=10.

2.3 加波沙朵組小鼠測試瓶飲用量增加

在測試期內(nèi)，各組小鼠測試瓶和溶劑對照瓶的飲用量如圖4所示。重復(fù)測量的雙因素方差分析結(jié)果顯示，測試期內(nèi)正常對照組小鼠對兩瓶溶液的每日飲用量無統(tǒng)計學差異（F（1，18）=0.042，P=0.839，圖4A）；整個測試期內(nèi)咪達唑侖組對測試瓶和溶劑對照瓶的每日飲用量總體無顯著性差異（F（1，18）=3.315，P=0.085），但第11～15 天測試瓶飲用量顯著高于溶劑對照瓶（F（1，18）=4.613，P＜0.05，圖4B）；加波沙朵組測試瓶整個測試期內(nèi)飲用量顯著高于溶劑對照瓶（F（1，18）=14.81，P＜0.01，圖4C），且在第8和9 天測試瓶飲用量較溶劑對照瓶顯著增加（P＜0.05，圖4C）。單因素方差分析結(jié)果顯示，與正常對照組比較，咪達唑侖組和加波沙朵組測試瓶累計飲用量有升高趨勢，但無統(tǒng)計學差異（F（2，27）=2.123，P=0.139，圖4D）。

Fig.4 Two-bottle free-choice MDZ（1.4×10-5 mol·L-1）and THlP（3.9×10-6 mol·L-1）consumption in mice.See Fig.1 for the mouse treatment.A-C：daily consumption of the test bottle and vehicle bottle in the test stage.An analysis of the D11-D15 data indicated a significant increase in the daily consumption of MDZ(C).D：accumulative consumption of the test bottle in normal control，MDZ and THIP groups during the test stage.±s，n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with vehicle in 4% sucrose（vehicle bottle）（two-way ANOVA with Bonferroni post hoc test）.

2.4 加波沙朵誘導小鼠產(chǎn)生飲用偏好

根據(jù)測試期各組小鼠測試瓶和溶劑對照瓶的實際飲用量，計算不同藥物的相對飲用量。正常對照組小鼠相對飲用量維持在1.0～1.3（圖5A）；咪達唑侖組小鼠第6～9 天每日相對飲用量在0.9～1.8 波動，自第10 天起逐漸上升，第12～15 天相對飲用量維持在1.9～2.3（圖5A）；加波沙朵組小鼠每日相對飲用量維持在1.8～2.7。重復(fù)測量的雙因素方差分析結(jié)果顯示，各組每日相對飲用量之間具有統(tǒng)計學差異（F（2，27）=5.219，P＜0.05，圖5A），第9 天加波沙朵組的相對飲用量與正常對照組比較顯著增加（P＜0.05；圖5A）。與正常對照組比較，加波沙朵組累計相對飲用量顯著升高（P＜0.01，圖5B）。

Fig.5 Two-bottle free-choice MDZ（1.4×10-5 mol·L-1）and THlP（3.9×10-6 mol·L-1）relative consumption in mice.See Fig.1 for the mouse treatment.A:daily relative consumption meant the consumption of the test bottle(mL)/ consumption of the vehicle bottle(mL).B:accumulative relative consumption means the sum of the relative consumption of each mouse during the test stage.±s，n=10.#P＜0.05，compared with normal control group，two-way ANOVA with Bonferroni post hoc test.##P＜0.01 compared with normal control group，one-way ANOVA with Bonferroni post hoc test.

2.5 咪達唑侖和加波沙朵不影響小鼠體重

在測試期內(nèi)，各組小鼠體重均逐步增加，且各組間小鼠體重變化無統(tǒng)計學意義（圖6）。提示自由飲用咪達唑侖或加波沙朵對小鼠體重無顯著影響。

Fig.6 Body mass of mice during test stage.See Fig.1 for the mouse treatment.±s，n=10.

3 討論

加波沙朵對突觸外GABAAR 具有較高的效能和效價強度，是研究突觸外GABAAR 藥理學效應(yīng)的常用工具藥［23］。傳統(tǒng)靶向突觸內(nèi)GABAAR 的藥物存在精神依賴風險［9］，而激活突觸外GABAAR 是否誘導精神依賴仍有爭議。本研究通過兩瓶自由選擇實驗發(fā)現(xiàn)，突觸外GABAAR 激動劑加波沙朵也存在精神依賴風險。

《精神疾病診斷和統(tǒng)計手冊》（第5版）［24］中，“物質(zhì)相關(guān)和成癮性障礙”的基本特征是個體知道存在顯著的物質(zhì)相關(guān)問題仍然繼續(xù)使用該物質(zhì)；其臨床診斷標準可概括為：長期獲得，自主使用，高攝入量，強烈渴求，不計對工作、社交以及生理心理的負面影響，難以控制，產(chǎn)生耐受和戒斷癥狀。研究藥物精神依賴性需要建立真正模擬人類成癮性障礙臨床特征的動物模型，目前常用的動物模型主要包括行為敏化、條件性位置偏愛、腦電自我刺激和自身給藥等［25］，其中自身給藥模型是最經(jīng)典、最受認可的模型。Tan 等［22］首次嘗試用兩瓶自由選擇模型，即口服自身給藥的方式評估了苯二氮類藥物的精神依賴潛能。相比于其他常用模型，兩瓶自由選擇模型具有簡單易行、非侵入性、無混雜因素（包括施加壓力誘導小鼠攝入藥物）和口服給藥數(shù)據(jù)的臨床轉(zhuǎn)化意義等優(yōu)勢。本研究發(fā)現(xiàn)，加波沙朵組小鼠在藥物和溶劑之間長期、連續(xù)地自主選擇服用藥物，其行為表現(xiàn)與陽性藥咪達唑侖組小鼠相似。2種藥物均可誘導小鼠產(chǎn)生強烈的可測量的服藥動機，符合人類成癮性障礙的關(guān)鍵特征。本研究中，小鼠咪達唑侖的每日飲用量為0.7～1.1 mg·kg-1，與文獻中的飲用量（0.8～1.1 mg·kg-1）相似［22］，加波沙朵的每日飲用量為0.1～0.2 mg·kg-1。本研究在考察咪達唑侖和加波沙朵精神依賴性的同時，也觀察了長期用藥對小鼠體重的影響，發(fā)現(xiàn)咪達唑侖和加波沙朵偏好小鼠體重增長的趨勢和幅度均與正常對照組接近。

藥物形成精神依賴的早期階段，VTA 的DA 神經(jīng)元會表現(xiàn)出突觸可塑性改變［21，26］，包括突觸部位形成新的缺乏GluA2亞基的α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸受體（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4 - isoxazolepropionic acid receptor，AMPAR），N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR）活性降低，這種可塑性改變的標志是AMPA/NMDA 比值增加［27-28］。獎賞通路中，VTA 的GABA 能神經(jīng)元和中腦皮質(zhì)邊緣DA能神經(jīng)元等均表達GABAAR［22，29］。根據(jù)這些受體被激活的位置，推測其可能通過調(diào)節(jié)VTA DA 能神經(jīng)元和/或通過對DA 能神經(jīng)元的投射促進獎賞或厭惡動機［30］。已有研究表明，咪達唑侖激活VTA 中含有α1亞基的GABAAR，使下游含有α3亞基的GABAAR的DA 能神經(jīng)元去抑制，從而增加DA 水平，誘發(fā)突觸可塑性改變［22］；與此結(jié)果一致，α1突變小鼠在兩瓶自由選擇模型中并未對咪達唑侖形成偏好［22］。另有研究報道，化合物TPA023 對含有α1的GABAAR 無活性，在狒狒的自身給藥模型上未表現(xiàn)出精神依賴潛能［31-32］，進一步證明含有α1的突觸內(nèi)GABAAR 可能與精神依賴風險有較高的相關(guān)性。加波沙朵在小鼠和狒狒靜脈自身給藥模型上未表現(xiàn)出強化效應(yīng)［15］，甚至誘導小鼠產(chǎn)生條件性位置厭惡［20］，加波沙朵也可誘導VTA 中AMPA/NMDA 比值升高，引發(fā)依賴相關(guān)的神經(jīng)可塑性改變，因此激活突觸外GABAAR 是否誘導依賴仍存在爭議。在大鼠酒精口服自身給藥模型上，敲減伏隔核背內(nèi)側(cè)殼核中的GABAAR δ 亞基可顯著降低酒精攝入量［33］，提示該核團中含δ亞基的突觸外GABAAR參與了酒精的強化作用［34］。Siivonen 等［35］也發(fā)現(xiàn)，GABAAR δ 亞基敲除小鼠中，嗎啡誘導的條件性位置偏好被逆轉(zhuǎn)，即缺乏GABAAR δ 亞基，阿片類藥物的條件性獎賞效應(yīng)減弱。近年來有研究進一步報道，GABAAR δ 亞基（GABRD）基因甲基化修飾可能參與海洛因成癮的獎賞，增加GABRD甲基化顯著增強海洛因復(fù)吸，而抑制其甲基化能夠顯著減少復(fù)吸［36］，GABRD基因多態(tài)性位點rs13303344 與海洛因成癮患者的藥物渴求相關(guān)聯(lián)［37］。總之，加波沙朵對VTA 腦區(qū)神經(jīng)可塑性的影響與藥物形成精神依賴的早期階段的變化相似，且有證據(jù)表明突觸外GABAAR δ 亞基促進了酒精和嗎啡的成癮，因此靶向突觸外GABAAR 的藥物存在精神依賴性的可能性較大。本研究中，小鼠對口服加波沙朵產(chǎn)生了顯著的偏好，這一結(jié)果支持突觸外GABAAR 促進藥物精神依賴發(fā)生的觀點。

綜上所述，與突觸內(nèi)GABAAR 變構(gòu)調(diào)節(jié)劑咪達唑侖一樣，突觸外GABAAR 激動劑加波沙朵在兩瓶自由選擇模型中可誘導動物產(chǎn)生顯著的偏向性飲用，提示加波沙朵仍可能存在精神依賴潛能。