李鵬飛，石華香，周夢瑋，郭家彬，王永安，王麗韞

（1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點實驗室，北京 100850；2.中國人民解放軍疾病預(yù)防控制中心，北京 100071）

缺氧是造成神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的重要誘因，包括外缺氧和內(nèi)缺氧，前者指機(jī)體外環(huán)境缺氧，后者指機(jī)體內(nèi)組織缺氧［1-2］。內(nèi)、外缺氧往往同時存在，如火災(zāi)發(fā)生時因氧供不足和氧利用障礙發(fā)生內(nèi)、外復(fù)合缺氧［3］。機(jī)體內(nèi)、外缺氧均可導(dǎo)致腦損傷，特別是外缺氧復(fù)合內(nèi)缺氧可能使腦損傷進(jìn)一步加劇，但其具體損傷特征和機(jī)制尚未闡明［4-5］。

氰化物是指含有氰根的物質(zhì)，包括無機(jī)氰化物〔如氰化鈉（sodium cyanide，NaCN）和氰化鉀等）〕和有機(jī)氰化物（如丙烯晴和氰化物等），在煉金、農(nóng)業(yè)和制藥領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用。NaCN 具有結(jié)構(gòu)簡單、儲存方便、毒性劇烈、中毒途徑多且中毒后難防難治等特點［6-8］。急性NaCN中毒發(fā)作迅速，首先出現(xiàn)頭暈和頭痛癥狀，繼而可出現(xiàn)昏迷，甚至死亡。中樞神經(jīng)系統(tǒng)是NaCN 重要靶器官，慢性NaCN 暴露可導(dǎo)致多種神經(jīng)系統(tǒng)功能異常，嚴(yán)重的會形成遲發(fā)性肌張力障礙或帕金森?。?-10］。氰根能結(jié)合線粒體內(nèi)細(xì)胞色素氧化酶的三價鐵形成氰化高鐵細(xì)胞色素氧化酶，從而阻斷呼吸鏈電子傳遞，導(dǎo)致體內(nèi)細(xì)胞無法獲得足夠的氧氣，使細(xì)胞主要產(chǎn)能方式由有氧呼吸轉(zhuǎn)換為無氧呼吸，產(chǎn)生大量乳酸堆積，造成代謝性酸中毒，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死［11-12］。

開展缺氧環(huán)境NaCN 中毒相關(guān)研究對于保障應(yīng)急條件下出現(xiàn)密閉環(huán)境復(fù)合NaCN 中毒后的救治具有重要意義。本研究通過構(gòu)建急性NaCN 暴露復(fù)合缺氧小鼠模型，采用激光散斑成像技術(shù)［13-14］和免疫組化等方法，探討在缺氧環(huán)境中發(fā)生NaCN急性染毒對海馬神經(jīng)元的損傷作用及病理機(jī)制，為NaCN 中毒復(fù)合缺氧的臨床治療提供新的思路和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性昆明種小鼠，SPF 級，體重18～20 g，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2019-0010。飼養(yǎng)環(huán)境為溫度18～24 ℃，濕度50%～60%，12/12 h 晝夜交替，小鼠自由進(jìn)食、飲水，適應(yīng)3 d 后用于實驗。所有的動物實驗均經(jīng)軍事醫(yī)學(xué)研究院動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：IACUCDWZX-2020-517）。

1.2 藥品、試劑和主要儀器

NaCN（純度＞98%），軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所合成，溶于生理鹽水；水合氯醛、固體甲醛、蔗糖和30%過氧化氫，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PBS，無錫傲銳東源生物科技有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒（A003-1-1）、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）測定試劑盒（A001-1-2）和考馬斯亮藍(lán)總蛋白測定試劑盒（A045-2），南京建成生物工程研究所；DAPI 熒光封片液（F5067），美國Sigma 公司；TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（C1090）、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）抗體（A0208）和HE染色試劑盒（C0105M），碧云天生物技術(shù)有限公司。

SIM BFI HR Pro 激光散斑血流成像系統(tǒng)，武漢迅微科技有限公司；UV-4802 紫外分光光度計，上海尤尼科儀器有限公司；CM1950 冰凍切片機(jī)，德國Leica 公司；LSM 880 激光共聚焦顯微鏡，德國Carl Zeiss 公司；AC-ROS 電子天平，德國Sartorius公司；ABL90FLEX 血氣分析儀，雷度米特醫(yī)療設(shè)備（上海）有限公司。

1.3 小鼠缺氧存活時間檢測

將小鼠隨機(jī)分為缺氧+NaCN〔0（缺氧對照），2.56，3.8 和5.1 mg·kg-1〕組，每組20 只。各組小鼠ip 給予不同劑量NaCN 后立即置于密閉的玻璃罐（容積為1.5 L，環(huán)境溫度為25 ℃，氣體壓強(qiáng)為101 kPa）中，每罐2 只，觀察并記錄小鼠呼吸運動、皮毛狀態(tài)和活動情況，以最后一次呼吸為標(biāo)記，記錄死亡時間。

1.4 血氣分析儀測定小鼠動脈血氣值

將小鼠隨機(jī)分為正常對照組、NaCN 暴露組（ip給予NaCN 3.8 mg·kg-1）、缺氧（30 和60 min）組（置缺氧罐內(nèi)30 或60 min 后取出）和NaCN+缺氧組〔ip 給予NaCN 3.8 mg·kg-1后立即置缺氧罐內(nèi)，缺氧處理30 min（NaCN+缺氧30 min組）或60 min（NaCN+缺氧60 min 組）后取出〕，每組5 只。小鼠按分組處理后ip 給予5%水合氯醛麻醉，經(jīng)腹主動脈取動脈血約0.2 mL，抗凝處理后于20 min內(nèi)使用全自動血氣分析儀進(jìn)行檢測，并記錄動脈血pH 值、氧飽和度（oxygen saturation，sO2）、氧分壓（oxygen tension，pO2）和二氧化碳分壓（carbon dioxide partial pressure，pCO2）。

1.5 激光散斑血流成像系統(tǒng)測定小鼠腦血流

小鼠ip 給予5%水合氯醛麻醉后固定于小鼠腦立體定位儀操作臺上，剪去顱頂部皮毛暴露顱骨，滴加3%雙氧水去除骨膜和殘余組織，充分暴露出Bregma點及顱骨表面，滴加生理鹽水保持顱頂濕潤。連接激光散斑血流成像系統(tǒng)腦血流儀，調(diào)整操作臺使顱骨中線與參考線重合或平行，拍照記錄腦定位的初始位置，實時監(jiān)測腦血流相對值，記錄時間2 min，作為給藥前或缺氧前正常腦血流基線值。記錄完成后，將小鼠暴露的顱頂進(jìn)行縫合，放回鼠籠恢復(fù)48 h，之后將小鼠按照1.4 分組處理并麻醉，每組5只。按原始位置圖片調(diào)整腦定位，再次實時監(jiān)測腦血流相對值2 min。繪制實驗處理前后腦血流實時變化圖像和折線圖，從折線圖上每間隔10 s取腦血流絕對值，缺氧處理前后各取12個點進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.6 試劑盒測定小鼠海馬T-SOD活性和MDA含量

小鼠分組處理方法同1.4，每組5只。處理后將小鼠處死，迅速取腦并分離海馬組織。用考馬斯亮藍(lán)試劑盒按照說明書步驟操作，定量檢測樣品蛋白濃度。分別按照T-SOD 和MDA 檢測試劑盒說明書操作，用紫外分光光度計測定吸光度，計算各組小鼠海馬組織T-SOD 活性（kU·g-1蛋白）和MDA含量（μmol·g-1蛋白）。

1.7 HE染色觀察小鼠海馬組織病理變化

將小鼠按照1.4分組處理并麻醉，每組3只。經(jīng)心臟灌流4%多聚甲醛40 mL，取出全腦，浸泡于4%多聚甲醛溶液中4 ℃固定2 d，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明和石蠟包后埋常規(guī)切片，厚度5 μm。每只小鼠各取1張腦片，經(jīng)常規(guī)HE染色后置顯微鏡下觀察海馬區(qū)細(xì)胞形態(tài)。

1.8 腦組織含水率測定

小鼠分組處理方法同1.4，每組4 只，按分組處理后處死并取全腦，去除嗅球和延髓，先用分析天平稱量濕重，而后置60 ℃烘箱連續(xù)烘干1周后稱量其干重，計算腦組織含水率。腦組織含水率（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.9 TUNEL染色檢測海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率

小鼠分組處理方法同1.4，每組3 只，小鼠灌流和石蠟切片制備方法同1.7。每只小鼠各取1 張海馬腦片，按照TUNEL 細(xì)胞凋亡試劑盒說明書操作，用含有DAPI 的抗熒光淬滅封片劑封片，于顯微鏡下觀察計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，根據(jù)凋亡細(xì)胞分布情況在400 倍光鏡下，每組切片拍攝7 個陽性視野，每個視野計數(shù)150 個細(xì)胞，以凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比作為凋亡率。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NaCN對小鼠缺氧存活時間的影響

小鼠缺氧存活時間如圖1所示，與缺氧對照組比較，缺氧+NaCN 2.56，3.8 和5.1 mg·kg-1組小鼠平均存活時間顯著延長（P＜0.01）；與缺氧+NaCN 2.56 mg·kg-1組比較，缺氧+NaCN 3.8和5.1 mg·kg-1組小鼠平均存活時間顯著延長（P＜0.01）。

2.2 NaCN對缺氧小鼠動脈血氣值的影響

表1結(jié)果可見，與正常對照組比較，缺氧30 min組小鼠pO2和pH 值顯著下調(diào)（P＜0.05），pCO2顯著上調(diào)（P＜0.05）；缺氧60 min 組pCO2顯著上調(diào)（P＜0.05）；NaCN 3.8 mg·kg-1組sO2和pO2均顯著下調(diào)（P＜0.05）。與缺氧30 min 組比較，NaCN+缺氧30 min 組sO2和pO2上調(diào)（P＜0.05），pCO2下調(diào)（P＜0.05）。與缺氧60 min 組比較，NaCN+缺氧60 min組sO2，pO2和pCO2均無顯著性差異。

Tab.1 Effect of NaCN on arterial blood gas values in hypoxic mice

2.3 NaCN對缺氧小鼠皮質(zhì)腦血流的影響

小鼠皮質(zhì)腦血流激光散斑成像（圖2A）顯示，正常對照組小鼠血流量豐富，同正常對照組比較，缺氧30 min 組主支循環(huán)無明顯變化，側(cè)支循環(huán)遠(yuǎn)端末梢減少；缺氧60 min 組主、側(cè)支循環(huán)均減少；NaCN 3.8 mg·kg-1組主支循環(huán)減少；NaCN+缺氧30 min組主支循環(huán)血流量顯著減少，側(cè)支循環(huán)稀疏分布。NaCN+缺氧60 min組主循環(huán)血流量進(jìn)一步減少，側(cè)支循環(huán)消失。

統(tǒng)計分析結(jié)果（圖2B）顯示，與正常對照組比較，除缺氧30 min 組外，其余各組皮質(zhì)腦血流相對值均顯著下調(diào)（P＜0.01）。同缺氧30 min 組比較，NaCN+缺氧30 min 組皮質(zhì)腦血流相對值顯著下調(diào)（P＜0.01）。同缺氧60 min 組比較，NaCN+缺氧60 min組皮質(zhì)腦血流相對值也顯著下調(diào)（P＜0.01）。

Fig.2 Effect of NaCN on cerebral cortical blood flow in hypoxic mice.See Tab.1 for the mouse treatment.A：real time laser speckle images of mouse cerebral blood flow（CBF）.B：statistical analysis of the relative value of CBF in each group.Relative CBF（%）=Cerebral blood flow value of experimental group/cerebral blood flow value of control group×100%.±s，n=5.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.##P＜0.01，compared with hypoxia 30 min group.ΔΔP＜0.01，compared with hypoxia 60 min group.

2.4 NaCN對缺氧小鼠氧化應(yīng)激水平的影響

實驗結(jié)果（圖3）顯示，與正常對照組比較，缺氧30 min 組和缺氧60 min 組小鼠T-SOD 活性和MDA 含量均無顯著性差異；NaCN 3.8 mg·kg-1組、NaCN+缺氧30 min 組和NaCN+缺氧60 min 組T-SOD活性和MDA含量均顯著上調(diào)（P＜0.01）。與缺氧30 min 組比較，NaCN+缺氧30 min 組T-SOD活性和MDA含量顯著上調(diào)（P＜0.01）。與缺氧60 min組比較，NaCN+缺氧60 min 組T-SOD 活性和MDA含量也顯著上調(diào)（P＜0.01）。

Fig.3 Effect of NaCN on MDA content（B）and TSOD activity（A）in hippocampal tissue of hypoxic mice.See Tab.1 for the mouse treatment.A：statistical analysis of total superoxide dismutase（T-SOD）activity in the hippocampus of hypoxia and NaCN poisoning combined hypoxia mice.B：statistical analysis of malondialdehyde（MDA）content in the hippocampus of hypoxia and NaCN poisoning combined hypoxia mice.±s，n=5.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with hypoxia 30 min group；ΔΔP＜0.01，compared with hypoxia 60 min group.

2.5 NaCN 對缺氧小鼠海馬組織病理結(jié)構(gòu)和腦組織含水率的影響

HE 染色結(jié)果（圖4A）顯示，正常對照組小鼠海馬組織細(xì)胞排列層次分明，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整；缺氧30 min 組小鼠海馬細(xì)胞排列稀疏、出現(xiàn)空泡化；缺氧60 min 組海馬神經(jīng)元數(shù)目減少，細(xì)胞核固縮，顏色加深；NaCN 3.8 mg·kg-1組小鼠海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少；NaCN+缺氧30 min 組和NaCN+缺氧60 min 組海馬組織細(xì)胞排列稀疏紊亂，細(xì)胞腫脹，出現(xiàn)空泡化，神經(jīng)元數(shù)目減少。

腦組織含水率檢測結(jié)果（圖4B）顯示，與正常對照組比較，缺氧30 min組和缺氧60 min組小鼠腦組織含水率均無明顯改變；NaCN 3.8 mg·kg-1組、NaCN+缺氧組30 min和60 min小鼠腦組織含水率顯著增加（P＜0.01）。與缺氧30 min組比較，NaCN+缺氧30 min 組腦組織含水率顯著增加（P＜0.01）。與缺氧60 min 組比較，NaCN+缺氧60 min 組腦組織含水率顯著增加（P＜0.01）。

Fig.4 Effect of NaCN on pathological structure of hippocampus（A）and brain moisture content（B）in hypoxic mice.See Tab.1 for the mouse treatment.Moisture content（%）=（Wet mass-dry mass）/wet mass×100%.±s，n=4.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with hypoxia 30 min group；ΔΔP＜0.01，compared with hypoxia 60 min group.

2.6 NaCN對缺氧小鼠海馬細(xì)胞凋亡率的影響

TUNEL 染色結(jié)果（圖5）顯示，與正常對照組比較，各處理組細(xì)胞凋亡率均顯著增加（P＜0.01）；與缺氧30 min 組比較，NaCN+缺氧30 min 組細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.01）；與缺氧60 min 組比較，NaCN+缺氧60 min 組細(xì)胞凋亡率也顯著增加（P＜0.01）。

Fig.5 Effect of NaCN on apoptosis of hippocampal cells in hypoxic mice by TUNEL staining.See Tab.1 for the mouse treatment.B was the statistical analysis result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with hypoxia 30 min group；ΔΔP＜0.01，compared with hypoxia 60 min group.

3 討論

NaCN 中毒時，線粒體有氧呼吸電子鏈傳遞過程受到抑制，從而使組織或細(xì)胞對氧的利用率降低［12］。在缺氧環(huán)境下，NaCN 染毒可降低組織對氧的利用，短時間內(nèi)代償部分急性單純?nèi)毖跻鸬姆瓮夂蛽Q氣功能不足，延長單純?nèi)毖跣∈蟮拇婊顣r間，但由于NaCN 染毒后會造成神經(jīng)組織氧利用障礙，會進(jìn)一步加重缺氧造成的海馬神經(jīng)元損傷。本研究結(jié)果表明，給予NaCN 能延長小鼠在缺氧密閉罐內(nèi)的存活時間。

動脈血氣值是分析機(jī)體對缺氧響應(yīng)的敏感指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，單純?nèi)毖?0 min 時，由于外界氧供不足，小鼠體內(nèi)氣體交換不足，小鼠呼吸方式改變?yōu)闇\快呼吸，同時出現(xiàn)pO2下降、pCO2上升和pH 顯著下降，體內(nèi)發(fā)生酸中毒。隨著缺氧時間延長，由于氣體交換障礙，小鼠呼吸出現(xiàn)緩慢深呼吸，血液CO2進(jìn)一步蓄積，缺氧60 min 時，血液pH值偏酸性。NaCN 染毒小鼠組織細(xì)胞氧利用能力降低，血液中游離氧濃度相對增加，表現(xiàn)出sO2和pO2下降，而pCO2和pH 無顯著改變。比較單純?nèi)毖跖cNaCN 染毒復(fù)合缺氧后可發(fā)現(xiàn)，給予NaCN 可緩解缺氧誘導(dǎo)的pCO2上調(diào)，糾正酸中毒，使pO2和sO2顯著性上升。以上結(jié)果提示，NaCN 染毒延長小鼠缺氧存活時間的機(jī)制與NaCN 染毒后機(jī)體氧利用能力下降，血液中游離氧增加有關(guān)。

環(huán)境缺氧復(fù)合NaCN 染毒缺氧會導(dǎo)致小鼠體內(nèi)酸中毒，導(dǎo)致血管擴(kuò)張［15-16］，血液流量和流速下降，繼而出現(xiàn)血管代償性改變。大腦耗氧量大，是機(jī)體對缺氧最敏感的組織器官，腦內(nèi)氧供與腦血流變化密切相關(guān)［17-18］。本研究發(fā)現(xiàn)，NaCN 染毒復(fù)合缺氧小鼠較單純?nèi)毖跣∈竽X血流進(jìn)一步降低，并隨時間延長而加重。腦血流減少導(dǎo)致腦組織缺氧，從而引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)。SOD 活性反應(yīng)機(jī)體清除氧自由基的能力，MDA反應(yīng)細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。本研究對小鼠海馬組織T-SOD 活性和MDA含量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)NaCN 染毒后加重缺氧小鼠海馬組織氧化應(yīng)激反應(yīng)。

血液是輸送氧氣和各種營養(yǎng)物質(zhì)的載體，同時腦血流與腦內(nèi)腦脊液和組織液回流密切相關(guān)［19］。本研究通過觀察腦組織含水率發(fā)現(xiàn)，NaCN 染毒后小鼠出現(xiàn)腦水腫現(xiàn)象，這可能與缺氧及酸中毒導(dǎo)致的微血管通透性增加和神經(jīng)元細(xì)胞損傷有關(guān)。本研究通過HE 染色發(fā)現(xiàn)，NaCN 染毒后出現(xiàn)明顯的細(xì)胞腫脹、空泡化、神經(jīng)元數(shù)量減少，部分細(xì)胞出現(xiàn)核固縮和細(xì)胞碎片。本研究通過TUNEL 染色發(fā)現(xiàn)，單純?nèi)毖蹩蓪?dǎo)致小鼠海馬細(xì)胞凋亡，NaCN 染毒可加劇缺氧小鼠海馬細(xì)胞凋亡。

綜上所述，急性NaCN 染毒能夠降低細(xì)胞利用氧的能力，延緩CO2在體內(nèi)的蓄積和增加體內(nèi)的游離氧，緩解單純?nèi)毖跻l(fā)的呼吸性酸中毒，從而延長小鼠缺氧存活時間，但NaCN染毒可加劇缺氧小鼠腦血流的降低，誘發(fā)腦組織水腫，導(dǎo)致海馬組織發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡。本研究為探討氰化物加重缺氧誘發(fā)的小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的機(jī)制提供了實驗依據(jù)，為臨床缺氧類疾病提供新的治療思路。